专利名称：生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及分析化学、食品安全、兽药残留领域，具体地说，是涉及复杂生物样品中磺胺类抗生素多残留的高选择性、快速分离、富集和纯化方法。
背景技术：
磺胺类抗生素(Sulfonamides，SAs)是一类化学合成的抗生素，它对多数革兰氏阳性菌及某些革兰氏阴性菌有抑制作用，被广泛应用于治疗各种动物的细菌性感染疾病， 但是磺胺类抗生素可导致机体过敏反应、破坏机体的造血系统、导致各种贫血症的发生。尤其是，目前抗生素在食品中的残留问题十分普遍，世界上许多国家都对动物源性食品中的抗生素残留限量作了严格规定，加拿大、欧盟、美国等国家规定动物组织中磺胺类药物总量的最大残留量是100μ g/kg ；我国农业部第235号文件规定其在动物源性食品中磺胺类抗生素的最高残留限量(MRL)为0. lmg/kg。因此，磺胺类抗生素的检测对保障我国动物性产品出口贸易的正常发展和人民身体健康具有重要意义。目前，对磺胺类抗生素残留的分析检测方法主要有分光光度法、示波极谱法、荧光光度法、毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MQ及用于快速检测的放射免疫法和酶联免疫法。但是由于样品基质的复杂性和多样性，常规检测方法和仪器往往无法从复杂的样品中准确的检测到痕量的违禁药物残留；而且复杂的样品基质会影响检测仪器的寿命，增加检测成本。同时，在检测过程中，样品的前期处理占用的时间和工作量通常占整个检测过程的60 %以上，导致检测效率较低。中国发明专利申请CN200810052542. 8所公开的《磺胺甲恶唑分子印迹聚合物的制备方法》，该申请采用磺胺甲恶唑为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐为致孔剂、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，制备得到的分子印迹聚合物用于固相萃取和高效液相色谱填料对磺胺甲恶唑分子表现出较好的识别特异性。但是该申请中的分子印迹聚合物只对磺胺甲恶唑具有识别性， 对其它的磺胺类抗生素则没有识别性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其通过利用对磺胺类抗生素特异的分子印迹聚合物作为基质固相分散萃取技术的填料，进一步通过对萃取条件的优化，建立一种复杂生物样品中磺胺类抗生素多残留分离纯化方法，以达到从复杂生物样品中快速、高选择性的分离和富集磺胺类抗生素多残留、有效的去除样品基质的干扰、同时提高了检测灵敏度和准确度的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备分子印迹聚合物按模板分子功能单体交联剂的摩尔比1 2 8 25的比例配料，通过本体聚合法获得对磺胺类抗生素具有特异识别功能的分子印迹聚合物；其中，所述的模板分子为磺胺二甲氧嘧啶，所述的功能单体为甲基丙烯酸，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；(2)称取0. 1-0. 3g待分离生物样品于研钵中，用研钵磨碎，加入适量上述分子印迹聚合物，进一步勻浆后得到勻浆样品；(3)将所述的勻浆样品置于固相萃取小柱中，依次用2. 0-4. OmL水、 2. 0-4. OmLlOwt %乙腈水溶液淋洗，然后用3. 0-5. OmL甲醇/甲酸混合溶液洗脱；磺胺类抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脱液中从所述的待分离生物样品中分离出来；其中，所述甲醇/甲酸混合溶液中甲醇与甲酸的体积比为90 10。较好的，步骤O)中所述勻浆样品中待分离生物样品与所述分子印迹聚合物的重量比为2 5。上述各方案中所采用的固相萃取小柱为聚丙烯固相萃取小柱，其能获得更佳的萃取效果。较好的，所述固相萃取小柱的体积可以为3-10mL。为获得理想的分离纯化效果，提高样品回收率，上述各方案中，步骤(3)中所述勻浆样品置于所述固相萃取小柱之前，可以先向所述的固相萃取小柱中预装20-30mg所述的分子印迹聚合物。众所周知，制备可同时特异识别一类物质的分子印迹聚合物及解决模板分子的渗漏对检测结果的干扰，模板分子的选择是关键。模板分子的选择不仅对分子印迹聚合物的识别特性具有重要的影响，而且对分离纯化效果也有一定的影响。本发明在大量试验的基础上，选择磺胺二甲氧嘧啶为模板分子，进一步结合功能单体、交联剂用量及比例的优化， 制备得到一种具有固定孔穴和特定功能基团排列的高分子交联聚合物，对磺胺类抗生素具有较好的特异识别功能，可同时实现对多种磺胺类抗生素的特异性识别，例如同时识别磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶等，适用性广；将其应用于基质固相分散萃取，表现出较好的分离、纯化性能，尤其适用于复杂生物样品中多残留磺胺类抗生素的快速高效分离纯化，并且模板分子残留对检测结果干扰小，检测效率高，分离富集效果好。
图1为本发明实施例1中分离效果的液相色谱图；图2为本发明实施例2中分离效果的液相色谱图；图3为本发明实施例3中分离效果的液相色谱图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。下述各实施例中分子印迹聚合物的制备方法如下称取适量功能单体甲基丙烯酸和模板分子磺胺二甲氧嘧啶(SDM)溶解于15mL乙腈稀释剂中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA 5mL、偶氮二异丁腈引发剂120mg， 超声脱气5 lOmin，混合均勻后，通入氮气10 15min，密封。置于60°C水浴中反应Mh ；聚合反应结束后，将合成的块状聚合物取出研磨、过筛后依次用甲醇甲酸(90 10, ν/ V)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，用丙酮反复沉降以除去过细的聚合物颗粒，然后将除去模板分子的聚合物在50°C真空干燥，即得到对磺胺类抗生素具有特异识别功能的分子印迹聚合物。实施例1.(一 )磺胺类抗生素分子印迹聚合物的制备准确称取功能单体甲基丙烯酸2mmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交联剂EGDMA 25mmol、引发剂偶氮二异丁腈120mg，超声脱气5min，混合均勻后，通入氮气10 15min，密封。置于60°C水浴中反应24h ；聚合反应结束后，将合成的块状聚合物取出研磨、过筛后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，用丙酮反复沉降以除去过细的聚合物颗粒，然后将除去模板分子的聚合物在50°C 真空干燥，即得到分子印迹聚合物。( 二)磺胺类抗生素基质固相分散萃取方法，具体步骤如下选择市购且经检测体内无磺胺类抗生素残留的鱼作为样品，向该鱼样品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺间二甲氧嘧啶，三种加标浓度如表1所示。称取0. 2g加标后的鱼样品于研钵中，用研钵磨碎，加入0. 5g分子印迹聚合物，进一步勻浆后，得到勻浆样品。(2)向下端带有垫片的IOmL聚丙烯固相萃取小柱中预装20mg分子印迹聚合物，然后将勻浆样品置于聚丙烯固相萃取小柱中。(3)依次用2. OmL水、3. OmL 10wt%乙腈水溶液淋洗聚丙烯固相萃取小柱中的勻浆样品，然后用3mL体积比为90 10甲醇/甲酸混合液进行洗脱，磺胺类抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脱液中。(三)分离效果的检测基质固相分散萃取获得的甲醇/甲酸洗脱液40°C氮气吹干后，溶于0. 5mL液相色谱流动相中，0. 22 μ m滤膜过滤后用高效液相色谱-紫外检测器检测。检测结果如表1所示，其液相色谱如图1所示。实施例2(一 )磺胺类抗生素分子印迹聚合物的制备准确称取功能单体甲基丙烯酸4mmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交联剂EGDMA 25mmol、引发剂偶氮二异丁腈120mg，超声脱气5 lOmin， 混合均勻后，通入氮气15min，密封。置于60°C水浴中反应Mh ；聚合反应结束后，将合成的块状聚合物取出研磨、过筛后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，用丙酮反复沉降以除去过细的聚合物颗粒，然后将除去模板分子的聚合物在50°C 真空干燥，即得到分子印迹聚合物。( 二)磺胺类抗生素基质固相分散萃取方法，具体步骤如下(1)选用市场购买的、经检测后体内无磺胺类抗生素残留的虾作为样品，向该虾样品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺间二甲氧嘧啶。三种加标浓度如表1所示。
经检测称取0.2g虾于研钵中，用研钵磨碎，加入0. Ig分子印迹聚合物，进一步勻浆后，得到勻浆样品。(2)向下端带有垫片的IOmL聚苯乙烯固相萃取小柱中预装20mg分子印迹聚合物， 将勻浆样品置于聚苯乙烯固相萃取小柱中。(2)依次用2. OmL水、3. OmL 10wt%乙腈水溶液淋洗聚苯乙烯固相萃取小柱，然后用体积比为90 10的甲醇/甲酸混合液进行洗脱，勻浆样品中受到磺胺类抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脱液中。(三)分离效果的检测基质固相分散萃取获得的甲醇/甲酸洗脱液40°C氮气吹干后，溶于0. 5mL液相色谱流动相中，0. 22 μ m滤膜过滤后用高效液相色谱-紫外检测器检测。检测结果如表1所示，其液相色谱如图2所示。实施例3(一 )磺胺类抗生素分子印迹聚合物的制备准确称取功能单体甲基丙烯酸Smmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交联剂EGDMA 25mmol、引发剂偶氮二异丁腈120mg，超声脱气lOmin，混合均勻后，通入氮气lOmin，密封。置于60°C水浴中反应Mh ；聚合反应结束后，将合成的块状聚合物取出研磨、过筛后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通过索氏萃取除去模板分子，用丙酮反复沉降以除去过细的聚合物颗粒，然后将除去模板分子的聚合物在50°C真空干燥，即得到分子印迹聚合物。( 二)磺胺类抗生素基质固相分散萃取方法，具体步骤如下(1)选择市购且经检测体内无磺胺类抗生素残留的猪肉作为样品，向该猪肉样品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺间二甲氧嘧啶，三种加标浓度如表1所示。称取0. 2g加标后的猪肉样品于研钵中，用研钵磨碎，加入0. 3g分子印迹聚合物， 进一步勻浆后，得到勻浆样品；(2)向下端带有垫片的IOmL聚丙烯固相萃取小柱中预装30 mg分子印迹聚合物， 将勻浆样品置于聚苯乙烯固相萃取小柱中。(3)将获得固相萃取小柱依次用2. OmL水、2. OmLlOwt 10%乙腈水溶液淋洗，然后用3mL甲醇/甲酸(90/10，ν/ν)洗脱，获得对磺胺类抗生素多残留分离纯化技术。(三)分离效果的检测基质固相分散萃取获得的甲醇/甲酸洗脱液40°C氮气吹干后，溶于0. 5mL液相色谱流动相中，0. 22 μ m滤膜过滤后用高效液相色谱-质谱检测。检测结果如表1所示，其液相色谱如图3所示。表 权利要求
1.生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备分子印迹聚合物按模板分子功能单体交联剂的摩尔比1 2 8 25 的比例配料，通过本体聚合法获得对磺胺类抗生素具有特异识别功能的分子印迹聚合物；其中，所述的模板分子为磺胺二甲氧嘧啶；所述的功能单体为甲基丙烯酸，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；(2)称取一定量待分离生物样品于研钵中，用研钵磨碎，加入适量上述分子印迹聚合物，进一步勻浆后得到勻浆样品；其中待分离生物样品与分子印迹聚合物的重量比为 2 1-5。(3)将所述的勻浆样品置于固相萃取小柱中，依次用2.0-4. OmL水、2. 0-4. OmL IOwt% 乙腈水溶液淋洗，然后用3. 0-5. OmL甲醇/甲酸混合溶液洗脱；磺胺类抗生素即溶于甲醇/ 甲酸洗脱液中从所述的待分离生物样品中分离出来；其中，所述甲醇/甲酸混合溶液中甲醇与甲酸的体积比为90 10。
2.根据权利要求1所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于步骤O)中所述勻浆样品中待分离生物样品与所述分子印迹聚合物的重量比为2 · 5 ο
3.根据权利要求1或2所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法， 其特征在于所述的固相萃取小柱为聚丙烯固相萃取小柱。
4.根据权利要求3所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于所述固相萃取小柱的体积为3-10mL。
5.根据权利要求1或2所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法， 其特征在于步骤(3)中所述勻浆样品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中预装20-30mg所述的分子印迹聚合物。
6.根据权利要求3所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中所述勻浆样品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中预装20-30mg所述的分子印迹聚合物。
7.根据权利要求4所述的生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中所述勻浆样品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中预装20-30mg所述的分子印迹聚合物。
全文摘要
本发明涉及到一种生物样品中多残留磺胺类抗生素的高效分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备分子印迹聚合物按模板分子功能单体交联剂的摩尔比1∶2～8∶25的比例配料，通过本体聚合法获得对磺胺类抗生素具有特异识别功能的分子印迹聚合物；(2)称取一定量待分离生物样品于研钵中，用研钵磨碎，加入适量上述分子印迹聚合物，进一步匀浆后得到匀浆样品；其中待分离生物样品与分子印迹聚合物的重量比为2∶1-5。(3)将所述的匀浆样品置于固相萃取小柱中，依次用2.0-4.0mL水、2.0-4.0mL 10wt％乙腈水溶液淋洗，然后用3.0-5.0mL甲醇/甲酸混合溶液洗脱；磺胺类抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脱液中从所述的待分离生物样品中分离出来。本发明所提供的方法选择性广、分离纯化效果好。
文档编号G01N30/14GK102279232SQ20111007622
公开日2011年12月14日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者史西志, 孙爱丽, 孟原, 李德详, 陈炯 申请人:宁波大学