专利名称：一种荧光检测植物木聚糖分布的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及用荧光检测植物木聚糖分布的方法。
背景技术：
木聚糖(xylan)是一种以P _D_1，4木糖苷键形成主链的多聚五碳糖，常带有阿魏糖，阿拉伯糖等侧链。是主要的半纤维素成分，广泛分布在植物细胞中，是一种丰富的生物质资源，约占植物细胞干重的35%。木聚糖可以作为饲料，食品添加剂和生物质能源的原 料。因此检测木聚糖在植物中的分布与含量，已经成为木聚糖研究的重要指标。现有检测木聚糖分布的方法中，通常采用免疫荧光法和底物染料法。底物染料法是以木聚糖为基质，用交联方式连接和包裹特定的染料做成切片。底物染料法因为染料易溶于水而流失，导致染色结果可重复性差，而且染料颗粒大，不适合高精度观测。免疫荧光法是近年发展起来的一种新型检测技术，先用重组木聚糖结合蛋白与植物切片中木聚糖集合，再用抗组氨酸标记的抗体与重组蛋白中的组氨酸标记结合，最后与带荧光集团的第二抗体结合，从而标记出木聚糖的位置，在荧光显微镜下观察植物切片中木聚糖的分布。该方法中使用的抗组氨酸标记的抗体常会出现效价不高，特异性不强而使得木聚糖荧光信号弱，背景荧光信号过强，干扰检测结果。另外，抗体孵育时间长，会对植物切片造成破损，木聚糖分布显示会不完整。抗体成本高，特别是带荧光标记的第二抗体，直接增加耗材成本。不同批次的抗体之间的差别也导致荧光结果可比较性低。
发明内容
有鉴于此，本发明的要解决的技术问题有两个方面，一个是克服现有技术的弊端，提供一种适用于植物木聚糖检测的方法，另一方面是，提供基于该方法在木聚糖检测试剂盒中的应用。本发明采用以下的技术方案检测植物木聚糖的分布I)制备重组蛋白将目的蛋白的质粒转入大肠杆菌中，加入IPTG诱导蛋白表达。离心收获细胞，超声波破碎细胞。之后过镇柱洗脱该重组蛋白。透析后，蛋白溶液制备完成。2)制备植物切片将植物材料用石蜡包埋成方块。用旋转切片机切成薄片，粘在载玻片上。用二甲苯脱蜡，经酒精溶液置换入水中。用盖玻片封好备用。3)检测植物切片木聚糖的分布用制备的重组蛋白溶液浸泡有植物切片的载玻片30min,冲洗3 4次,滤纸吸干后放置在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光的分布，即为植物切片中的木聚糖分布。在本发明的另一方面，提供了基于上述方法在木聚糖分布检测试剂盒中应用，所述木聚糖分布检测试剂盒至少包含重组蛋白溶液和使用说明书。所述木聚糖分布检测试剂盒，还可以包含木聚糖酶，阳性对照的植物切片，石蜡，二甲苯，无水乙醇等试剂。由于采用上述的技术方案，本发明中的结合荧光定量的木聚糖分布检测方法，克服了以往检测方法的弊端(I)避免使用各种抗体，节省抗体成本和抗体保存费用，操作的相关耗材成本和操作时间；(2)本方法避免抗体带来的结果重复性差，荧光信号不强，背景过强；(3)本方法避免抗体孵育过程中对植物样品的损坏，使得切片结构更完整；(4)本方法使用的木聚糖结合蛋白特异性强，不与植物材料中其他成分结合；(5)本方法不受抗体量的限制，容易放大，容易实现高通量操作。
综上所述，本发明具有特异性强，荧光信号强，背景信号弱，操作简单，快捷，容易放大，消耗更少等特点。
具体实施例方式结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002 [美]J.萨姆布鲁克，D. W拉塞尔著，黄培堂等译)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例II)制备重组蛋白扩增与木聚糖特异性结合的多糖结合蛋白的基因片段，转入含有绿色荧光蛋白基因片段的PMV261载体中，使两个蛋白进行重组共表达。将该重组蛋白的质粒2 Ul加入50 u I的大肠杆菌化学感受态细胞BL21的溶液中，冰浴30min，转入42°C水浴锅中静止放置lmin，取出放在冰浴中Imin。用移液器吸出，转入铺有LB琼脂培养基和50 u g/ml卡那霉素的玻璃培养皿中，用涂布器涂抹均匀，倒置放在37°C培养箱中16小时。取出培养皿，挑取一个单克隆菌苔，转入有50 ii g/ml卡那霉素的100ml LB培养基溶液中，在37°C恒温振荡器中培养至OD6tltl为0.6，加入终浓度为0.2 ii M IPT6诱导蛋白表达。继续培养16个小时之后，离心收获细胞，用50mM Tris,200mM NaCl，pH 8. 0缓冲溶液悬浮细胞，在冰浴中用超声波破碎细胞。之后高速低温离心得到细胞上清，过镍柱除去细胞上清中的杂蛋白，用50mM Tris,200mM NaCl，IOOmM咪唑，pH 8. 0缓冲液洗脱该重组蛋白。透析除去咪唑后，蛋白溶液制备完成，4°C保存。2)制备植物切片将I立方厘米见方的植物材料在90%酒精中浸泡I小时，依次换入酒精与二甲苯的I : 1,1 : 3的混合溶液中各30min,最后转入纯二甲苯溶液30min。用52°C的石腊浸染30min，再用52°C的石蜡包埋成方块。用旋转切片机切成薄片，粘在载玻片上。在30°C放置I小时烘干，用二甲苯脱蜡，经酒精溶液从100%，90%，70%，50%，30%依次置换，之后转入水中。用盖玻片封好备用。3)检测植物切片木聚糖的分布用制备的重组蛋白溶液浸泡有植物切片的载玻片30min，取出载玻片，用50mMTris,pH 8. 0缓冲液冲洗3次，用滤纸吸干多余的缓冲液，放置在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光的分布，即为植物切片中的木聚糖分布。实施例2I)制备重组蛋白扩增与木聚糖特异性结合的多糖结合蛋白的基因片段，转入含有绿色荧光蛋白基因片段的PMV261载体中，使两个蛋白进行重组共表达。将该重组蛋白的质粒I 加入50 u I的大肠杆菌化学感受态细胞BL21的溶液中，冰浴30min，转入42°C水浴锅中静止放置lmin，取出放在冰浴中lmin。用移液器吸出，转入铺有LB琼脂培养基和50 y g/ml卡那霉素的玻璃培养皿中，用涂布器涂抹均匀，倒置放在37°C培养箱中16小时。取出培养皿，挑取一个单克隆菌苔，转入有50 ii g/ml卡那霉素的100ml LB培养基溶液中，在37°C恒温振荡器中培养至0D_为0.6，加入终浓度为0.2 ii M IPTG诱导蛋白表达。继续培养16个小时 之后，离心收获细胞，用50mM Tris,200mM NaCl, pH 8. 0缓冲溶液悬浮细胞，在冰浴中用超声波破碎细胞。之后用高速低温离心机得到细胞上清，过镍柱除去细胞上清中的杂蛋白，用50mM Tris,200mM NaCl，IOOmM咪唑，pH 8. 0缓冲液洗脱该重组蛋白。透析除去咪唑后，蛋白溶液制备完成，4°C保存。2)制备植物切片将I立方厘米见方的植物材料在90%酒精中浸泡2小时，依次换入酒精与二甲苯的I : 1,1 : 3的混合溶液中各30min,最后转入纯二甲苯溶液30min。用52°C的石腊浸染30min，再用52°C的石蜡包埋成方块。用旋转切片机切成薄片，粘在载玻片上。在37°C放置I小时烘干，用二甲苯脱蜡，经酒精溶液从100%，95%，75%，50%，30%依次置换，之后转入水中。用盖玻片封好备用。3)检测植物切片木聚糖的分布用制备的重组蛋白溶液浸泡有植物切片的载玻片30min，用50mM Tris,pH 8. 0缓冲液冲洗4次，用滤纸吸干多余的缓冲液，放置在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光的分布，即为植物切片中的木聚糖分布。
权利要求
1.一种荧光检测植物木聚糖分布的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 1)制备重组蛋白 将目的蛋白的质粒转入大肠杆菌中，加入IPTG诱导蛋白表达。离心收获细胞，超声波破碎细胞。之后过镇柱洗脱该重组蛋白。透析后，蛋白溶液制备完成。
2)制备植物切片 将植物材料用石蜡包埋成方块。用旋转切片机切成薄片，粘在载玻片上。用二甲苯脱蜡，经酒精溶液置换入水中。用盖玻片封好备用。
3)检测植物切片木聚糖的分布 用制备的重组蛋白溶液浸泡有植物切片的载玻片30min，冲洗3 4次，滤纸吸干后放置在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光的分布，即为植物切片中的木聚糖分布。
2.一种基于权利要求I所述方法的木聚糖检测试剂盒，其特征在于所述木聚糖检测试剂盒至少包括重组蛋白溶液和使用说明书。
3.权利要求2所述木聚糖检测试剂盒，还可以包括木聚糖酶，阳性对照的植物切片，石蜡，二甲苯，无水乙醇等试剂。
全文摘要
本发明提供一种荧光检测植物木聚糖分布的方法，它包括制备重组蛋白，制备植物切片，荧光检测木聚糖分布等步骤。本发明还公开了基于该办法制备木聚糖检测试剂盒的应用。本发明的方法使用有荧光蛋白标记的木聚糖结合蛋白与木聚糖结合发出荧光来检测木聚糖分布的原理代替以往的免疫荧光法，即降低了检测时间，又降低了耗材的费用，提高了检测的灵敏度和稳定性，提高了检测效率，容易放大操作。
文档编号G01N21/64GK102735660SQ201110082780
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者郑红俊 申请人:郑红俊