专利名称：一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法
技术领域：
本发明属生物医学检验领域，涉及国内常见毒蛇的蛇伤鉴别检测方法，特别涉及一种利用消减适配子技术进行蛇毒种属特异适配子的筛选技术。
背景技术：
毒蛇伤害是一个全球性的公共卫生问题，可导致呼吸麻痹、致命性出血性败血症、 不可逆性肾功能衰竭和导致永久性残疾的局部组织严重坏死。据统计我国有已知毒蛇4科 28属63余种，常见毒蛇包括中华眼镜蛇、眼镜王蛇、金环蛇、银环蛇、尖吻蝮蛇、圆斑蝰蛇、 蝮蛇、竹叶青、海蛇等。抗蛇毒血清是目前国内常用的治疗毒蛇咬伤的特效药物，目前我国常见的抗蛇毒血清包括抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清等。但是在应用抗蛇毒血清治疗蛇伤之前必须根据肇事毒蛇种类选择正确种类的抗蛇毒血清，才能降低过敏反应的风险，提高毒素拮抗效率获得理想的疗效，否则将导致血清病等严重过敏反应的发生，错失救治的最佳时间。目前我国蛇伤临床诊断主要依靠病史和临床表现，缺乏快速、特异的实验室鉴别蛇毒种类的方法，往往造成治疗的盲目性。究其原因，是因为蛇毒成分复杂，且亲缘关系较近的蛇毒素存在许多同源蛋白，具有大量相同的抗原位点， 致使寻找种属特异性单克隆抗体显得十分困难。而近年来发展起来的适配子筛选技术，能从容量高达IOm的单链寡核酸随机文库中经过数轮的筛选得到与靶标高特异高亲和性结合的适配子。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种利用蛇毒种属特异性的适配子来检测鉴别蛇毒的方法。本发明目的是这样实现的
一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，其关键在于按如下步骤进行
(1)先构建随机单链DNA文库和引物，单链DNA文库通过PCR扩增为双链DNA、再通过非对称PCR及纯化得到单链DNA文库；
(2)筛选出纯化的单链DNA文库与靶标粗蛇毒相结合的单链DNA；再次PCR扩增为双链 DNA、非对称PCR及纯化得到与靶标耜蛇毒相结合的单链DNA ；
(3)将步骤(2)得到的单链DNA再与需要鉴别的4、种蛇毒反筛得到不相结合的单链
DNA ；
(4)按照步骤(2)和步骤(3)交叉循环筛选，得到可与蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒结合的单链DNA适配子，PCR扩增为双链DNA、非对称PCR及纯化得到单链DNA适配子库；
(5)对筛选终池单链DNA适配子库进行亲和性检测筛选出靶标适配子；
(6)获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子(7)采用酶联免疫法从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质， 从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。上述步骤(4)中按照步骤(2)和步骤(3)交叉循环筛选12轮以上。步骤(1)、(2)和(4)采用不对称PCR法或生物素链亲和素磁珠法制备单链DNA文库。步骤(2)、(3)和(4)筛选过程中以硝酸纤维素膜、亲和树脂或微孔板为分离介质。一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，具体按如下步骤进行 一、适配子的筛选
1)、构建随机单链DNA (ssDNA)文库和引物构建序列长度为78个碱基的单链 DNA (ssDNA)文库5， -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3，， 其中N代表碱基A，G, C，T中的任意一个，该文库的容量约为IO14-IO15,构建上游引物 5，-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3，，构建下游引物5，-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3，。随机单链DNA文库和引物由生物公司合成。2)、单链DNA文库合成双链DNA文库将单链DNA文库0. μδ,上游引物lOOpmol、 下游引物IOpmol、15mmol/l Mgcl2、0. 2mmol/l dNTP、1 XDNA聚合酶反应缓冲液和1个活性单位的DNA聚合酶，加入双蒸水，使总体积为20μ1 ；然后放入PCR仪中，先进行94°C反应5 分钟预变性，然后按以下条件循环18次94°C反应30秒，65°C反应30秒，72°C反应30秒， 最后72°C反应5分钟，得到双链DNA文库的PCR扩增产物，并用酚氯仿法纯化回收。3)、不对称PCR法制备单链DNA文库步骤2)中回收的DNA为模版0. μδ,上游引物0. lpmol、下游引物 10pmol、7. 5mmol/l MgC12、0. 2mmol/l dNTP、IXDNA聚合酶反应缓冲液和1个活性单位的DNA聚合酶，加入双蒸水，使总体积为20μ1 ；然后放入PCR仪中，先进行94°C反应5分钟预变性，然后按以下条件循环18次94°C反应30秒，65°C反应30秒， 72°C反应30秒，最后72°C反应5分钟，得到单链DNA文库的PCR扩增产物并用酚氯仿法纯化回收，得到纯化的单链DNA文库。4)、筛选循环
①将透析后的IOPg靶标粗蛇毒用PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用 3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤5)中纯化的单链DNA文库Ing在SELEX结合缓冲液中先与空白对照孔37°C作用40分钟，反筛去除与BSA结合的单链DNA，然后转移到蛇毒蛋白包被孔与蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX 冲洗缓冲液洗涤6次，再加入SELEX洗脱液于80°C作用10分钟，洗脱下与蛇毒蛋白结合的 ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，得到纯化的单链DNA。按照步骤2)对纯化后的ssDNA进行常规PCR反应扩增，而后按照步骤3)进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。②将PBS透析后的鉴别蛇毒混合体(需要与之鉴别的4-8种蛇毒混合物)用 PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤①中纯化的单链DNA文库Ing转移到蛇毒蛋白包被孔与蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，收集洗涤下来的ssDNA，纯化得到的单链DNA。在把得到的单链DNA按照步骤2)常规PCR反应扩增，而后按照步骤3) 进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。5)、重复步骤4)12轮单数轮筛选将靶标蛇毒作为筛选靶标，收集结合洗脱ssDNA 用于下一循环；双数轮筛选使用需要与之鉴别的4-8种蛇毒混合体作为消减筛选靶标，收集未结合洗脱ssDNA用于下一循环。包被的蛇毒蛋白的浓度和用于结合的单链DNA浓度随着筛选轮数的增加而不断的降低，至第12轮时，包被蛋白的浓度达到每孔0. 05Pg，相应的结合单链DNA的浓度为每孔0. 02ng，得到可与蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒结合的单链DNA适配子库。6)、将步骤5)最终获得的高亲和性单链DNA适配子库按照步骤2)扩增，获得双链 DNA文库的PCR扩增产物。用含浓度0. 5μδ/πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，将双链DNA文库的PCR扩增产物进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置放在荧光检测板上，将呈橘红色条带的双链DNA文库的PCR扩增产物切下，用TaKaRa公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的双链DNA。7)、将步骤6)获得的双链DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector试剂盒连接到PMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。8)将各单个生长菌落所对应的DNA适配子用生物素标记，量为0. Mg，与每孔10μβ 包被的蛇毒蛋白在SELEX结合缓冲液中37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次， 加入1 :1000的辣根过氧化物酶标链霉亲和素，370C，作用30分钟，用PBST缓冲液洗涤4次， 洗去未与蛇毒蛋白上DNA生物素结合的酶标链酶亲和素，然后加入四甲基联苯胺室温显色 20分钟作用，加入2M浓硫酸终止显色反应，450nm酶联仪测定OD值，选取OD值最高的DNA 适配子，该适配子即为能与蛇毒蛋白结合的DNA适配子，将该适配子测序获得序列。二、检测方法的建立
将由上述过程获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子，就可采用酶联免疫法从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质，从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。有益效果本发明针对成分复杂的蛇毒，采用消减适配子筛选技术(depletion SELEX)，筛选获得具有高度蛇毒种属特异性的适配子，并将适配子转为报告适配子建立蛇毒快速检测新方法。蛇伤检测特异性强与敏感性好等，检测迅速，被蛇咬伤后，可以马上进行针对性的治疗。
具体实施例方式实施例1:
一种基于适配子技术的中华眼镜蛇毒鉴别方法，按如下步骤进行 1)、中华眼镜蛇毒种属特异性适配子的筛选，构建随机单链DNA (ssDNA)文库和引物， 将单链DNA文库通过PCR合成双链DNA文库，再利用不对称PCR法扩增DNA文库，PCR扩增产物用酚氯仿法纯化回收，得到大量纯化的单链DNA文库。2)、中华眼镜蛇蛇毒筛选循环将中华眼镜蛇毒透析后包被于酶联板上，37°C作用 3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将纯化的单链DNA 文库Ing在SELEX结合缓冲液中先与空白对照孔37°C作用40分钟，反筛去除与BSA结合的单链DNA，然后转移到中华眼镜蛇蛇毒蛋白包被孔与中华眼镜蛇蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，再加入SELEX洗脱液于80°C作用10分钟，洗脱下与中华眼镜蛇蛇毒蛋白结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，得到纯化的单链DNA。对纯化后的ssDNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。3)、鉴别蛇毒反筛循环将鉴别蛇毒混合体(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)用PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤2)中纯化的单链DNA文库Ing转移到蛇毒混合体包被孔与混合蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，收集洗涤下来的ssDNA，纯化得到的单链DNA。在把得到的单链DNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。4)、重复步骤2) -3) 12轮单数轮筛选将中华眼镜蛇毒作为筛选靶标，收集结合洗脱ssDNA用于下一循环；双数轮筛选使用需要与之鉴别的蛇毒混合体(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)作为消减筛选靶标，收集未结合洗脱ssDNA用于下一循环。包被的蛇毒蛋白的浓度和用于结合的单链DNA浓度随着筛选轮数的增加而不断的降低，至第12轮时，包被蛋白的浓度达到每孔0. 05μg,相应的结合单链DNA的浓度为每孔0. 02ng,得到可与中华眼镜蛇蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒(尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)结合的单链DNA适配子库。5)、将步骤4)获得的高亲和性单链DNA适配子库进行PCR扩增，获得双链DNA文库的PCR扩增产物。用含浓度0. 5μδ/πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，将双链DNA文库的PCR 扩增产物进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置放在荧光检测板上，将呈橘红色条带的双链DNA 文库的PCR扩增产物切下，用TaKaRa公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的双链 DNA。6)、将步骤5)获得的双链DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector试剂盒连接到PMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。7)、将各单个生长菌落所对应的DNA适配子用生物素标记，量为0. Mg，与每孔 IOPg包被的中华眼镜蛇蛇毒蛋白在SELEX结合缓冲液中37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，加入1 1000的辣根过氧化物酶标链霉亲和素，370C，作用30分钟，用PBST 缓冲液洗涤4次，洗去未与中华眼镜蛇蛇毒蛋白上DNA生物素结合的酶标链酶亲和素，然后加入四甲基联苯胺室温显色20分钟作用，加入2M浓硫酸终止显色反应，450nm酶联仪测定 OD值，选取OD值最高的DNA适配子，该适配子即为能与中华眼镜蛇蛇毒蛋白结合的DNA适配子，将该适配子测序获得序列。8)、将由上述过程获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、 放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子，
9)、从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质，从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。实施例2:一种基于适配子技术的尖吻蝮蛇毒鉴别方法，按如下步骤进行 1)、尖吻蝮蛇毒种属特异性适配子的筛选，构建随机单链DNA (ssDNA)文库和引物，将单链DNA文库通过PCR合成双链DNA文库，再利用不对称PCR法扩增DNA文库，PCR扩增产物用酚氯仿法纯化回收，得到大量纯化的单链DNA文库。2)、尖吻蝮蛇蛇毒筛选循环将尖吻蝮蛇毒透析后包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将纯化的单链DNA文库 Ing在SELEX结合缓冲液中先与空白对照孔37°C作用40分钟，反筛去除与BSA结合的单链 DNA，然后转移到尖吻蝮蛇蛇毒蛋白包被孔与尖吻蝮蛇蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX 冲洗缓冲液洗涤6次，再加入SELEX洗脱液于80°C作用10分钟，洗脱下与尖吻蝮蛇蛇毒蛋白结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，得到纯化的单链DNA。对纯化后的ssDNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。3)、鉴别蛇毒反筛循环将鉴别蛇毒混合体(中华眼镜蛇、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)用PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤2)中纯化的单链DNA文库Ing转移到蛇毒混合体包被孔与混合蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，收集洗涤下来的ssDNA，纯化得到的单链DNA。在把得到的单链DNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。4)、重复步骤2) -3) 12轮单数轮筛选将尖吻蝮蛇毒作为筛选靶标，收集结合洗脱ssDNA用于下一循环；双数轮筛选使用需要与之鉴别的蛇毒混合体(中华眼镜蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)作为消减筛选靶标，收集未结合洗脱ssDNA用于下一循环。包被的蛇毒蛋白的浓度和用于结合的单链DNA浓度随着筛选轮数的增加而不断的降低，至第12轮时，包被蛋白的浓度达到每孔0. 05μg,相应的结合单链DNA的浓度为每孔0. 02ng,得到可与尖吻蝮蛇蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒(中华眼镜蛇毒、江浙蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)结合的单链DNA适配子库。5)、将步骤4)获得的高亲和性单链DNA适配子库进行PCR扩增，获得双链DNA文库的PCR扩增产物。用含浓度0. 5μδ/πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，将双链DNA文库的PCR 扩增产物进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置放在荧光检测板上，将呈橘红色条带的双链DNA 文库的PCR扩增产物切下，用TaKaRa公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的双链 DNA。6)、将步骤5)获得的双链DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector试剂盒连接到PMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。7)、将各单个生长菌落所对应的DNA适配子用生物素标记，量为0. Mg，与每孔 IOPg包被的尖吻蝮蛇蛇毒蛋白在SELEX结合缓冲液中37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，加入1 :1000的辣根过氧化物酶标链霉亲和素，37°C，作用30分钟，用PBST 缓冲液洗涤4次，洗去未与尖吻蝮蛇蛇毒蛋白上DNA生物素结合的酶标链酶亲和素，然后加入四甲基联苯胺室温显色20分钟作用，加入2M浓硫酸终止显色反应，450nm酶联仪测定OD值，选取OD值最高的DNA适配子，该适配子即为能与尖吻蝮蛇蛇毒蛋白结合的DNA适配子， 将该适配子测序获得序列。8)、将由上述过程获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、 放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子，
9)、从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质，从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。实施例3:
一种基于适配子技术的江浙蝮蛇毒鉴别方法，按如下步骤进行 1)、江浙蝮蛇毒种属特异性适配子的筛选，构建随机单链DNA (ssDNA)文库和引物，将单链DNA文库通过PCR合成双链DNA文库，再利用不对称PCR法扩增DNA文库，PCR扩增产物用酚氯仿法纯化回收，得到大量纯化的单链DNA文库。2)、江浙蝮蛇蛇毒筛选循环将江浙蝮蛇毒透析后包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将纯化的单链DNA文库 Ing在SELEX结合缓冲液中先与空白对照孔37°C作用40分钟，反筛去除与BSA结合的单链 DNA，然后转移到江浙蝮蛇蛇毒蛋白包被孔与江浙蝮蛇蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX 冲洗缓冲液洗涤6次，再加入SELEX洗脱液于80°C作用10分钟，洗脱下与江浙蝮蛇蛇毒蛋白结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，得到纯化的单链DNA。对纯化后的ssDNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。3)、鉴别蛇毒反筛循环将鉴别蛇毒混合体(中华眼镜蛇、尖吻蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)用PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤2)中纯化的单链DNA文库Ing转移到蛇毒混合体包被孔与混合蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，收集洗涤下来的ssDNA，纯化得到的单链DNA。在把得到的单链DNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。4)、重复步骤2) -3) 12轮单数轮筛选将江浙蝮蛇毒作为筛选靶标，收集结合洗脱ssDNA用于下一循环；双数轮筛选使用需要与之鉴别的蛇毒混合体(中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)作为消减筛选靶标，收集未结合洗脱ssDNA用于下一循环。包被的蛇毒蛋白的浓度和用于结合的单链DNA浓度随着筛选轮数的增加而不断的降低，至第12轮时，包被蛋白的浓度达到每孔0. 05μg,相应的结合单链DNA的浓度为每孔0. 02ng,得到可与江浙蝮蛇蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒(中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、烙铁头蛇毒)结合的单链DNA适配子库。5)、将步骤4)获得的高亲和性单链DNA适配子库进行PCR扩增，获得双链DNA文库的PCR扩增产物。用含浓度0. 5μδ/πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，将双链DNA文库的PCR 扩增产物进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置放在荧光检测板上，将呈橘红色条带的双链DNA 文库的PCR扩增产物切下，用TaKaRa公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的双链 DNA。6)、将步骤5)获得的双链DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector试剂盒连接到PMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。7)、将各单个生长菌落所对应的DNA适配子用生物素标记，量为0. Mg，与每孔 IOPg包被的江浙蝮蛇蛇毒蛋白在SELEX结合缓冲液中37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，加入1 :1000的辣根过氧化物酶标链霉亲和素，37°C，作用30分钟，用PBST 缓冲液洗涤4次，洗去未与江浙蝮蛇蛇毒蛋白上DNA生物素结合的酶标链酶亲和素，然后加入四甲基联苯胺室温显色20分钟作用，加入2M浓硫酸终止显色反应，450nm酶联仪测定OD 值，选取OD值最高的DNA适配子，该适配子即为能与江浙蝮蛇蛇毒蛋白结合的DNA适配子， 将该适配子测序获得序列。8)、将由上述过程获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、 放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子，
9)、从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质，从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。实施例4:
一种基于适配子技术的烙铁头蛇毒鉴别方法，按如下步骤进行 1)、烙铁头蛇毒种属特异性适配子的筛选，构建随机单链DNA (ssDNA)文库和引物，将单链DNA文库通过PCR合成双链DNA文库，再利用不对称PCR法扩增DNA文库，PCR扩增产物用酚氯仿法纯化回收，得到大量纯化的单链DNA文库。2)、烙铁头蛇蛇毒筛选循环将烙铁头蛇毒透析后包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将纯化的单链DNA文库 Ing在SELEX结合缓冲液中先与空白对照孔37°C作用40分钟，反筛去除与BSA结合的单链 DNA，然后转移到烙铁头蛇蛇毒蛋白包被孔与江浙蝮蛇蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX 冲洗缓冲液洗涤6次，再加入SELEX洗脱液于80°C作用10分钟，洗脱下与烙铁头蛇蛇毒蛋白结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，得到纯化的单链DNA。对纯化后的ssDNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。3)、鉴别蛇毒反筛循环将鉴别蛇毒混合体(中华眼镜蛇、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇) 用PH值9. 6的碳酸缓冲液包被于酶联板上，37°C作用3小时，同时设空白对照孔。样本孔和对照孔用3%的BSA封闭2小时。将步骤2)中纯化的单链DNA文库Ing转移到蛇毒混合体包被孔与混合蛇毒蛋白37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，收集洗涤下来的ssDNA，纯化得到的单链DNA。在把得到的单链DNA进行常规PCR反应扩增，而后进行非对称PCR反应，酚氯仿法纯化回收获得富集单链DNA随机库，该文库作为一下轮筛选的文库。4)、重复步骤2) -3) 12轮单数轮筛选将江浙蝮蛇毒作为筛选靶标，收集结合洗脱ssDNA用于下一循环；双数轮筛选使用需要与之鉴别的蛇毒混合体(中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒)作为消减筛选靶标，收集未结合洗脱ssDNA用于下一循环。包被的蛇毒蛋白的浓度和用于结合的单链DNA浓度随着筛选轮数的增加而不断的降低，至第12轮时，包被蛋白的浓度达到每孔0. 05μg,相应的结合单链DNA的浓度为每孔0. 02ng,得到可与烙铁头蛇蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒(中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒)结合的单链DNA适配子库。
5)、将步骤4)获得的高亲和性单链DNA适配子库进行PCR扩增，获得双链DNA文库的PCR扩增产物。用含浓度0. 5μδ/πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，将双链DNA文库的PCR 扩增产物进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置放在荧光检测板上，将呈橘红色条带的双链DNA 文库的PCR扩增产物切下，用TaKaRa公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的双链 DNA。6)、将步骤5)获得的双链DNA，用TaKaRa公司提供的pMD18_T Simple Vector试剂盒连接到PMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。7)、将各单个生长菌落所对应的DNA适配子用生物素标记，量为0. Mg，与每孔 IOPg包被的烙铁头蛇蛇毒蛋白在SELEX结合缓冲液中37°C结合40分钟，用SELEX冲洗缓冲液洗涤6次，加入1 :1000的辣根过氧化物酶标链霉亲和素，37°C，作用30分钟，用PBST 缓冲液洗涤4次，洗去未与烙铁头蛇蛇毒蛋白上DNA生物素结合的酶标链酶亲和素，然后加入四甲基联苯胺室温显色20分钟作用，加入2M浓硫酸终止显色反应，450nm酶联仪测定OD 值，选取OD值最高的DNA适配子，该适配子即为能与烙铁头蛇蛇毒蛋白结合的DNA适配子， 将该适配子测序获得序列。8)、将由上述过程获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、 放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子，
9)、从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质，从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。
权利要求
1.一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)先构建随机单链DNA文库和引物，单链DNA文库通过PCR扩增为双链DNA、再通过非对称PCR扩增并纯化得到单链DNA文库；(2)筛选出纯化的单链DNA文库与靶标粗蛇毒相结合的单链DNA；再次常规PCR和非对称PCR扩增DNA、纯化得到与靶标粗蛇毒相结合的单链DNA ；(3)将步骤(2)得到的单链DNA再与需要鉴别的4、种蛇毒反筛得到不相结合的单链DNA ；(4)按照步骤(2)和步骤(3)交叉循环筛选，得到可与蛇毒蛋白高亲和性结合同时不与鉴别蛇毒结合的单链DNA适配子，PCR扩增为双链DNA、非对称PCR扩增并纯化得到单链DNA 适配子库；(5)对筛选终池单链DNA适配子库进行亲和性检测筛选出靶标适配子；(6)获得的适配子进行修饰增强其稳定性，然后用荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金进行标记转为报告适配子；(7)采用酶联免疫法从蛇伤受害者血、尿、伤口组织及分泌物中检测相应的蛇毒物质， 从而判断蛇伤种类，进行相应的抗蛇毒血清救治。
2.根据权利要求1所述一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，其特征在于 所述步骤(4)中按照步骤(2)和步骤(3)交叉循环筛选12轮以上。
3.根据权利要求1所述一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，其特征在于 步骤(1)、(2)和(4)采用非对称PCR法或生物素链亲和素磁珠法制备单链DNA文库。
4.根据权利要求1所述一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，其特征在于 步骤(2)、(3)和(4)筛选过程中以硝酸纤维素膜、亲和树脂或微孔板为分离介质。
全文摘要
本发明公开了一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法属生物医学检验领域，涉及一种利用适配子技术检测蛇毒的方法。本发明针对蛇毒成分复杂，目前蛇伤检测方法特异性与敏感性差等问题，采用消减适配子筛选技术(depletionSELEX)，筛选获得具有高度蛇毒种属特异性的适配子，并将适配子转为报告适配子建立蛇毒快速检测新方法。
文档编号G01N33/53GK102323400SQ20111015234
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者府伟灵, 邓昆 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院