专利名称：重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于重金属镉离子免疫化学和残留分析技术领域；涉及无机螯合化学，免疫化学，生物化学及物化测试技术等；特别涉及具有双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)人工特异性抗原的设计合成，和免疫动物特异性抗体的制备及其在建立免疫分析方法方面的应用。
背景技术：
重金属是一类很危险的污染物，在生物体内长期积累不可降解，在极其微量的情况下也会产生不良后果。各种生态系统都不同程度受到重金属的影响。重金属通过食物链沉积到人体中，可引起各种疾病，因此重金属在环境、农产品、中草药中残留监测都是非常重要的。重金属的检测常规方法主要有比色法、紫外分光光度法、原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)，近年还发展了感应耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子原子发射光谱仪联用(ICP-AES)及高效液相色谱法(HPLC)等。比色法和紫外分光光度法所需仪器简单、操作简便，但准确度相对较差，受多种金属的干扰，选择性差。原子吸收光谱法(AAS)和原子荧光光谱法(AFS)具有检出限低，准确度高，选择性高，谱线较简单，谱线干扰少，分析速度快等优点，目前被广泛采用。感应耦合等离子体质谱法(ICP-MS)可同时或顺序测定多种金属元素，对高温金属元素快速分析，但其价格昂贵，易受污染。利用痕量金属离子与有机试剂形成稳定络合物后用HPLC分离，紫外可见检测器检测，可以多种元素同时测定。但是由于络合剂选择有限，此方法仍有局限。以上的镉离子检测方法多采用昂贵的化学仪器，需要熟练的操作人员及在远离采样现场的实验室里进行，需要繁琐耗时的采样、运输和存储等步骤。而酶联免疫学法检测灵敏度高、重复性好、成本低廉、简便快捷、样品容量大、时间短，这些优点使其获得了很大的发展空间。其基本原理认为抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为重金属残留研究提供了一条新的分析检测途径。
发明内容
需要解决的问题针对上述情况，当前急需一种简易快速有效地检测重金属镉离子方法。本发明的目的是通过双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)将重金属镉离子和匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联合成人工抗原独特之处在于，镉离子能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒，因此选择了双功能螯合剂ITCBE螯合镉离子，形成能被动物免疫系统识别的螯合物，但这些重金属螯合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反应。而ITCBE除了能螯合镉离子之外，还能与载体蛋白KLH偶联，可以成功获得人工抗原。免疫动物诱导产生亲和性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，准确检测重金属镉离子。技术方案本发明设计、合成了重金属镉离子人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量地检测中药白芷中微量小分子目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲和性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测重金属镉离子在样本中的残用量。该技术研究的关键是人工抗原的合成及抗体的制备。重金属镉离子人工抗原和抗体，其特征在于选择双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，分子量MW为439.44，结构为:
权利要求
1.重金属镉离子人工抗原和抗体，其特征在于选择双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)络合镉离子合成半抗原，半抗原与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联合成人工抗原，半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成包被抗原，其中人工抗原再经免疫动物，取血，分离含有抗体的全血清，纯化制得抗体；
2.权利要求1所述的重金属镉离子人工抗原和抗体的制备抗法，其特征在于使用下述步骤制得: (1)人工抗原的合成 采用双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，将重金属镉离子和匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，具体做法是: 称取1.4mg ITCBE溶于ImLDMSO中，将1000mg/L镉溶液标品710 μ L缓慢滴加到ITCBE溶液中，使用三乙胺调节PH至7.4，在25°C下，使用磁力搅拌器搅拌24h，IOmg KLH溶解在20mmol/L的Hepes缓冲溶液中，并将上述螯合好的反应液缓慢滴加到KLH溶液中，使用三乙胺调节PH至9.6。在25°C下，使用磁力搅拌器搅拌24h后，用5mmol/L的HEPES缓冲溶液透析三天； (2)包被抗原的制备 采用双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，将重金属镉离子和牛血清白蛋白(BSA)偶联，具体做法是: 称取1.33mg ITCBE溶于ImLDMSO中，将1000mg/L镉溶液标品716 μ L缓慢滴加到ITCBE溶液中，使用三乙胺调节PH至7.4，在25°C下，使用磁力搅拌器搅拌24h。IOmgBSA溶解在20mmol/L的H印es缓冲溶液中，并将上述螯合好的反应液缓慢滴加到BSA溶液中，使用三乙胺调节PH至9.6。在25°C下，使用磁 力搅拌器搅拌24h后，用5mmol/L的Ifepes缓冲溶液透析三天；
3.权利要求1所述的重金属镉离子人工抗原、包被抗原和抗体在中药中重金属镉离子的免疫检测方法中的应用，其特征在于方法如下: (1)将2-5克中药样品粉粹成粉末，使用5倍体积的高氯酸浸泡过夜，然后装入高压消解罐在160°C _180°C消化至溶液澄清，使用四乙基乙二胺调节pH至中性，过0.22 μ m的微孔滤膜并使用双蒸水定容到50ml作为待测样品； (2)包被:将制备好的Cd-1TCBE-BSA包被原溶于pH9.6Na2C03-NaHC03的缓冲液中，将Cd-1TCBE-BSA包被原稀释为1.0 μ g/100 μ L作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100 μ L，室温放置过夜或者37°C恒温温育2 3小时，用含有Tween200.05% (V/V)磷酸盐缓冲液(PBST)洗液洗涤三次； (3)封闭:每孔加入200μ L0.5%脱脂乳粉/磷酸盐缓冲液(PBS)封闭液，封闭I小时，用洗液洗漆二次； (4)加样:用二乙基四乙胺(EDTA)将待测样品螯合后溶于PBS中，重金属镉离子标品(Cd-EDTA)也溶于PBS中，加样时每孔加入50 μ L上述待测样品或标样； (5)竞争反应:将重金属镉离子抗体溶于PBS缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50 μ L抗体溶液，孵育60min后，用PBST洗涤四次； (6)显色:向每微孔加100μ L羊抗兔酶标二抗，37°C反应30分钟，用PBST洗涤五次后每孔加入100 μ L由5mg四甲基联苯胺溶于Iml底物缓冲液并加入5 μ L双氧水溶液配成的底物溶液，室温下反应0.5小时；(7)终止:向各微孔中加入50 μ L硫酸终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值。
全文摘要
重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用涉及重金属镉离子的半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂、成本较高、分析速度慢的问题，提供了简便、快速、灵敏、准确的免疫分析技术。它以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)与隔离子络合物为半抗原，分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白等载体蛋白连接合成人工抗原和包被抗原。人工抗原再经动物免疫、取血、分出抗血清、纯化制得抗体。该抗体稳定、具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简便，可用于重金属镉离子的快速免疫检测，具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/531GK103076446SQ201110325898
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者王硕, 王俊平, 生威, 王津 申请人:天津科技大学