专利名称：用于吗啡检测的试纸条制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于吗啡检测的试纸条的制备方法，还涉及用于吗啡检测的试纸条的应用。
背景技术：
吗啡(Morphine)是由阿片提炼的一种阿片生物碱，为纯粹的阿片受体激动剂，有强大的镇痛作用，故在医学上，吗啡为麻醉性镇痛药。该类物质于使用初有欣快感，无法集中精神，会产生梦幻现象，过量使用造成急性中毒，极易产生耐受性和成瘾。目前，检测食品药品中吗啡，运用比较成熟的检测方法薄层色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)，液质联用法等。这些方法虽有力的加强了对食品药品的监管， 但是各具有优势但具有明显的缺陷，液相、气相、液质联用等仪器分析因仪器价格昂贵，需要特定的实验室，检测周期长，一般需要一天的时间，需要专业人员的操作；薄层层析法操作繁杂，而且由于被测样品中往往含有多种香料，对实验造成严重干扰，可能得到不准确结^ ο
发明内容
本发明的目的在于提供用于吗啡检测的试纸条制备方法及其应用。本发明所采取的技术方案是
用于吗啡检测的试纸条制备方法，包括如下步骤
1)制备胶体金标记抗吗啡单克隆抗体，将其包被在胶体金结合垫上；
2)制备吗啡与BSA的偶联物，将其和羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，干燥；
3)试纸条组装试纸条由PVC模板和PVC背板组成，在PVC背板上按顺序粘上样品垫、 胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。优选的，步骤3)硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线、控制线。优选的，步骤3) PVC背板上粘贴的各部分间有1 2mm的重叠。上述的用于吗啡检测的试纸条在食品、药品中的应用。本发明的有益效果是
本发明的用于吗啡检测的试纸条，专属性强、灵敏度高，准确度高，不需要专门设备，适合于现场操作，操作人员没有专业知识也可快速掌握，非常适合监督执法部门日常监督中使用，能够满足基层的监督检验需求，广泛应用于食品、药品的检测。
图1是用于吗啡检测的试纸条操作示意图； 图2是用于吗啡检测的试纸条结果判断图3是阳性样品与阴性样品检测结果对比图。
具体实施例方式为便于对本发明进一步理解，现结合具体实施例对本发明进行详细描述。用于吗啡检测的试纸条制备方法，包括如下步骤
1.制备胶体金标记抗吗啡单克隆抗体
胶体金颗粒的大小平均为30nm，在IOOml去离子水中加入1%柠檬酸三钠1ml，煮沸后迅速加入1%氯金酸1ml，继续煮沸5min，冷却后，得胶体金溶液，4°C下保存备用。取已制备好的胶体金溶液100ml，用0. 2mol/L碳酸钠溶液调pH到8. 0。边搅拌边加入抗吗啡单克隆抗体1. 5mg，搅拌30min，再逐滴加入IOml 10%BSA，搅拌15min。12000G 离心15min,弃上清液，加入10mlpH7. 4PBS缓冲液(含1%BSA)，共清洗3次。将沉淀用5ml 含1%BSA的PBS缓冲液(pH7. 4)溶解，用0. 2 μ m无菌过滤器过滤后，得胶体金标记抗吗啡单克隆抗体，4°C保存备用。
2.制备吗啡与BSA的偶联物
吗啡是小分子化合物，分子量为观5，具有氢化毗咤菲的绸环母核，3位的酚轻基、6位的醇轻基活性较强，其本身无免疫原性，采用一氯醋酸钠法和唬拍酸配法合成唬拍酞化吗啡半酷，在EDC催化下，与大分子载体蛋白交联，形成3位、6位偶联复合物，
包被抗原为吗啡与BSA的偶联物(MOP-BSA)，其合成方法为先将20mg吗啡琥珀酸盐、 15mgEDC及30mgBSA混合溶于ImlTris缓冲液中，0 4°C下避光搅拌lh，再加入5mgEDC，在 0°C下搅拌反应12h，静置过夜后，用Tris缓冲液透析3d，得吗啡与BSA的偶联物。3.包被抗体及偶联物
用BioJetXYDOOO型点膜仪将吗啡与BSA的偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37°C烘箱干燥他。以同样方法，将制备好的胶体金标记抗吗啡单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。4.用于吗啡检测的试纸条组装
用于吗啡检测的试纸条由一个PVC背板和一个PVC模板组成，在PVC背板上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，各部分间有1 2mm的重叠。硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线、控制线。用带MARK胶带绕背板覆盖在样品垫、胶体金结合垫及吸水垫上。用切条机将贴好的板切割成3mm宽的条。PVC模板包括加样孔(S)、检测区、控制区，其盖于PVC背板上，加样孔(S)对应于样品垫，检测区能显示硝酸纤维素膜的检测线(T)，控制区能显示控制线(C)。将制成的试纸条放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。上述试纸条在固体或半固体食品中的应用
取样品约5g (约2勺)于25mL样品管中，加水10mL，强力振摇1分钟，用一次性注射器吸取上层液体，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤。如果样品溶液太浓，无法过滤，可加等体积水稀释后再过滤，点于上述试纸条的加样孔后，1 5分钟内判断结果，如图1所示。上述试纸条在火锅汤料中的应用
取火锅汤料静置，除去上层油脂层，用一次性注射器吸取下层水层5mL于25ml样品管中。用0.45 μ m微孔滤膜过滤。如果样品溶液太浓，无法上样，加等体积水稀释后再过滤， 点于上述试纸条的加样孔后，1 5分钟内判断结果。
上述试纸条在胶囊或片剂药品中的应用
取2粒药(药若有胶囊，需弃胶囊外壳)，加水5ml，强力振摇1分钟，用一次性注射器吸取液体，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，点于上述试纸条的加样孔后，1 5分钟内判断结果。上述试纸条在止咳糖浆中的应用
取约5ml止咳糖浆，加等体积水稀释，用一次性注射器吸取液体，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，点于上述试纸条的加样孔后，1 5分钟内判断结果。上述用于吗啡检测的试纸条的结果判断
1)阴性(-):τ线(测试线，靠近加样孔)比C线(对照线)深或一样深，表示样品中吗啡浓度低于检出限，或不含吗啡，表明不含有吗啡；
2)阳性(+) :Τ线比C线浅，或T线无显色，则表示样品中吗啡浓度高于检出限；T线比 C线越浅表示样品中吗啡浓度越高，表明含有吗啡；
3)无效未出现质控C线，表明操作过程不正确或检测卡已失效。可参照图2进行结果判定。用上述试纸条检测两种浓度的样品1)阴性样品；2)在阴性样品中添加吗啡至浓度为20ng/ml。检测结果如图3所示，左边的试纸条检测的是样品2)，含有20ng/ml吗啡， 右边的试纸条检测的是样品1)，阳性样品，如图可知，左边结果显示为阳性，右边显示为阴性，结果一致。可见，本发明方法快速准确，且能检测出20ng/ml的吗啡。2011年，采用液相色谱-串联质谱测定方法共检测了 86批从广东省各地市抽检的火锅底料及调料，确证6批添加吗啡，用上述试纸条检验这86批样品，若出现阳性结果， 须复试一次，并送实验室进一步确证，结果如表1所示，由表1可知，结果未发现假阳性样品和假阴性样品，试纸条检测正确率为100%，误检率为0，漏检率为0，灵敏度和特异度均为
权利要求
1.用于吗啡检测的试纸条制备方法，包括如下步骤1)制备胶体金标记抗吗啡单克隆抗体，将其包被在胶体金结合垫上；2)制备吗啡与BSA的偶联物，将其和羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，干燥；3)试纸条组装试纸条由PVC模板和PVC背板组成，在PVC背板上按顺序粘上样品垫、 胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
2.根据权利要求1所述的用于吗啡检测的试纸条制备方法，其特征在于步骤3)硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线、控制线。
3.根据权利要求1所述的用于吗啡检测的试纸条制备方法，其特征在于步骤3)PVC 背板上粘贴的各部分间有1 2mm的重叠。
4.权利要求1所述的用于吗啡检测的试纸条在食品、药品中的应用。
全文摘要
本发明公开了用于吗啡检测的试纸条制备方法及其应用，制备方法包括如下步骤制备胶体金标记抗吗啡单克隆抗体，将其包被在胶体金结合垫上；制备吗啡与BSA的偶联物，将其和羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，干燥；试纸条组装。本发明的用于吗啡检测的试纸条，专属性强、灵敏度高，准确度高，不需要专门设备，适合于现场操作，操作人员没有专业知识也可快速掌握，非常适合监督执法部门日常监督中使用，能够满足基层的监督检验需求，广泛应用于食品、药品的检测。
文档编号G01N33/577GK102393464SQ201110327560
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者余靖衡, 刘敏敏, 张朝正, 李延志, 温家欣, 陈俏 申请人:广东省药品检验所