专利名称：用于测定单个红血细胞的体积和血红蛋白含量的方法
用于测定单个红血细胞的体积和血红蛋白含量的方法
背景技术：
患者血液中红血细胞的形态和生理特征的差异提供了与多种特定类型的红细胞疾病或贫血的病理状态有关的有价值信息。在这些疾病的诊断中，可以测量平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)和平均细胞体积(MCV)以对患者状态提供有价值的分析。可以将这些信息与经训练的血液病学家对染色血液涂片中红细胞大小、形状和颜色之分布的显微镜评估以及其他生物化学测试联合使用。单个红细胞的折光率差异与它们的血红蛋白浓度高度相关，该信息与对大小的测量结合可以具有诊断价值。例如，在小红细胞性贫血中，红细胞的大小显著减小，因而MCV也显著降低，但光学密度(与折光率相关)和MCHC稍有升高。在巨成红细胞性贫血中，大小(大红细胞)和MCHC均稍有升高。本公开内容部分涉及使用血液分析仪测定单个红血细胞的体积和/或血红蛋白含量的方法，以及用于实施所述方法的血液分析仪。发明概述本文提供使用血液分析仪测定血液样品中的单个红血细胞的体积和/或血红蛋白含量的方法，以及用于实施所述方法的血液分析仪。一般而言，该方法涉及使用血液分析仪获得包含红血细胞群体的样品一组数据点；然后计算所述样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量，包括使用(I)在多个光学散射通道(例如轴向光损失、中间角散射和/或偏振侧散射通道等)中对单个红血细胞的测量；(II)使用来自独立的阻抗转换器的测量计算的红血细胞群体的平均细胞体积，(III)在独立的色度转换器上测量的样品的总血红蛋白浓度；(IV)红血细胞群体中的细胞数目；(V)在多个所述光学散射通道上对红血细胞群体进行的测量的平均值；和(￥1)在所述血液分析仪中在至少一个所述光学散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值。还提供了与计算机相关的实施方案。
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图片。有彩图的本专利或专利申请的副本在申请且支付必需费用后由专利局提供。图I是一个示例性血液分析仪的光学子组件的示意图。图2是在Abbot Diagnostics的CELL-DYN Sapphire血液分析仪中进行的网织红细胞测定中收集的血细胞图。图3是显示应用于红血细胞(RBC) /网织红细胞(Retic)分布的示例性阈值的图形。图4是描绘了体积与细胞浓度模型中的关系的表。图5是用于计算细胞体积的模型的图解表示。图6是显示研究中的数据点的图，其表示特定样品中所有细胞的比例尺平均化且规格化的轴向光损失和中间角散射值。使用数据点生成用于计算细胞体积的模型。内部的线显示体积模型表面的范围。图7是用于计算细胞血红蛋白浓度的局部模型(CHC局部模型)的图解表示。
图8是显示了用于生成CHC局部模型的数据点的图。内部的线显示CHC模型表面的范围。图9是在研究中落到977例样品的CHC模型表面外部的RBC/Retic点的百分比的图。图10是在研究中落到977例样品的CHC模型表面外部的RBC/Retic点的百分比作为光学MCHC值的函数的图。图11是在具有最多CHC模型表面外部事件(event)(6%)的研究中样品的经换算、规格化的中间角和偏振侧向散射平面中所有RBC/Retic的事件的图。
图12是在MCHC为32g/dL的研究中其他样品的经换算、规格化的中间角和偏振侧向散射平面中所有RBC/Retic的事件的图。图13图解描述了用于分类正常样品中呈网状血小板(rPLT)的算法规则。rPLT是循环事件。
具体实施例方式在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为实施方案当然可以有所变化。在不偏离本发明真正的精神和范围的条件下，可以对所述发明做各种改变且可以用等价物代替。另外，可以做很多修改，使得特殊的条件、材料、物质的组成、方法、方法行动或步骤适应本发明的目的、精神或范围。所有这些修改旨在落入本文所附的权利要求范围内。本文引用的任何方法的步骤可以以逻辑上可能的所引用事件的任何顺序来实施，以及以事件的所引用顺序来实施。另外，在提供数值范围时，应理解该范围上下限和指定范围内任何其他指定值或中间值之间的任何中间值均涵盖在本发明中。同时，应预期所述发明方案的任何任选特征可以单独列出和要求权利，或者与本文描述的任何一种或更多种特征组合。参考项目仅提供用于本发明申请日之前的公开。本文不应被解释为承认本发明不能通过在先发明优先于这些材料。关于单数项目，包括存在相同项目的复数形式的可能性。更特别地，除非另外明确指出，如本文和在所附的权利要求中使用的没有数量词指代的名词包括复数指代。例如，如果一个值与“标准”比较，这个值可以与一个或更多个标准比较，即单一标准或多重标准。还应注意，可以书写权利要求以排除任何任选的要素。同样地，该声明旨在作为使用任何排除性术语如“单独地”、“仅”等限定要求权利的要素或使用“反”限定的在先基础。以下缩写可用于本公开文献中CBC(全血细胞计数)、RBC (血红细胞或红细胞)、rRBC(抗溶红血细胞或红细胞)、Retic (网织红细胞，幼稚红血细胞)、HGB (血红蛋白)、MCHC(平均血球、或细胞血红蛋白浓度)、MCV(平均血球、或细胞体积)、RDW(红血细胞分布宽度)、PLT(血小板)、WBC(白血细胞或白细胞)、fWBC(易碎白血细胞或白细胞)、NEU(中性粒细胞)、LYM(淋巴细胞)、Μ0Ν(单核细胞)、DSS (消偏振侧向散射)、CLL (慢性淋巴细胞性白血病)、ALL(轴向光损失)、IAS (中间角散射)、PSS (偏振侧向散射)、DSS (消偏振侧向散射)、和FCS (流式细胞术标准)。通常，大写的首字母缩写词是用来指示测量方法、测定或检测通道(例如HGB、IAS)，而小写的斜体字用于指示从这些测量获得的值(例如mcv、pSS)。此外，术语“细胞”可以用于指外周血中常见的或病理上发现的任何形成的体，例如RBC和WBC，还包括PLT。其它缩写可以在下面定义。在本公开文献中，术语“FCS文件”是用来描述由分析仪捕获和由自动内部算法分类的经检测事件集合的数字表示(例如RBC、淋巴细胞等)。FCS文件中的事件也可以被称为“列表型”数据，这反映出FCS文件格式的一个方面，其中事件安排在以检测时间顺序排列的列表中。血液分析仪如上所述，提供了一种血液分析仪，其提供了样品中单个红血细胞的体积和/或血红蛋白数量。一般而言，血液分析仪包括a)流动细胞池；b)用于将光导向所述流动细胞池的光源；c)用于检测多个光散射通道上细胞的光散射的多个检测器；d)用于测量细胞裂解物中总血红蛋白浓度的装置；e)用于测量伴随单个细胞通过的阻抗变化的阻抗转换器；和f)数据分析工作站，其包括计算包含红血细胞群体的样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量的程序，包括使用(I)在多个所述光散射通道上对所述单个红血细胞的测量；
(II)使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；(III)所述样品的总血红蛋白浓度；(IV)所述红血细胞群体中细胞的数目；(V)在所述多个所述光散射通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和(￥1)在所述血液分析仪中在至少一个所述光散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值(即平均值的中值)。下面描述的方法包括通常可以用在程序形式的任何适合的流式细胞仪(包括血液分析仪)上的几种计算方法，其实例在现有技术中和下列描述中是已知的，例如美国专利5，017，497,5, 266，269,5, 378，633,5, 631，165 和 6，524，858，以及已公开的美国专利申请US20080153170.US20080158561和US20080268494，它们的全部内容通过引用并入本文。血液分析仪分析全血的样品以确定除其他结果外，红细胞、血小板和血红蛋白的浓度。图I图解地示出示例性血液分析仪的光学组件。本领域的技术人员应认识到，对元件的选择、数量和设计(例如所用激光的类型、光学元件的数目和规格等)在分析仪之间有河大差异，因此，图I的血液分析仪作为实例提供并不应用来限制本公开内容。例如，在某些情况下血液分析仪可以或不可以检测荧光。除了图I所示的光学元件之外，血液分析仪可以包含用于测量细胞通过(例如进入或退出)流动细胞池的阻抗变化的阻抗测量装置。这样的装置包括阻抗计，其实例在美国专利2，656，508,3, 810，011和5，125，737中有所描述，它们的全部内容通过引用给并入本文。电阻抗测量可以用来对通过流动细胞池的细胞计数和测量大小(例如计算细胞的体积)。现在参考图1，示例性血液学分析仪10包括光源12、用于光束偏转的前镜14和后镜16、包含第一柱面透镜组20和第二柱面透镜组22的光束扩展模块18、聚焦透镜组24、精细光束调节器26、流动细胞池28、前向散射透镜组30、靶心检测器32、第一光电倍增管34、第二光电倍增管36、和第三光电倍增管38。靶心检测器32包括内检测器32a和外检测器32b，内检测器用于测量向前传播光束的消光(由此产生的数据被称为“轴向光损失”或“ALL”)，外检测器用于来自前面的3°到10°的环中的光散射(否则称为“中间角散射”或“IAS”)。光源12可以是垂直偏振的488nm风冷氩离子激光器或垂直偏振的蓝色(488nm)固态激光器。其他激光波长可以被替换，同时伴随光学设计布局的变化(即光学元件的选择、定位和特征)。关于激光、流动细胞池、透镜组、聚焦透镜组、精细光束调节机制和激光聚焦透镜组的其他细节可以在美国专利5，631，165中找到，特别是第41栏第32行至第43栏第11行，通过引用并入本文。图I中所示的血液分析仪的前向光路系统包括平凸透镜组30和位于透镜组的后焦面的双元件光电二极管检测器32。在该配置中，外光电二极管检测器32b内的每个同心环描绘了来自移动通过流动细胞池28的细胞的光的特定增加的角度收集环(incrementalangular collection annulus)。检测器32可以是能够检测轴向光损失(ALL)和中间角前向散射(IAS)的靶心检测器。美国专利5，631，165在第43栏第12至52行描述了该检测器的各种替代。第一光电倍增管34 (PMTl)测量消偏振侧向散射(DSS)或绿色荧光(FLl)。第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧向散射(PSS)或黄色至橙色荧光(FL2)，以及第三光电倍增 管38(PMT3)测量红色荧光(FL3)。在约515至约545纳米之间检测FLl，绿色荧光。在约565至约595纳米之间检测FL2，黄色至橙色荧光。在约615至约645纳米之间检测FL3，红色荧光。侧向散射和荧光发射通过分色镜40和42导向这些光电倍增管，其在所需波长下有效地传输和反射以便可以有效地检测。美国专利5，631，165在第43栏第53行至第44栏第4行描述了关于光电倍增管的各种附加的细节。测量荧光时，通过使用浸没式收集系统增强了光电倍增管34、36和38处的灵敏度。浸没式收集系统是通过折射率匹配层的装置将聚光器组件44的第一透镜组与流动细胞池28光学耦合的一种系统，能够收集在宽角度范围的光。美国专利5，631，165在第44栏第5至31行描述了该光学系统的各种附加的细节。聚光器44是具有像差校正的光学透镜组系统，所述像差校正足够用于用在高分辨率显微镜的衍射限制成像。美国专利5，631，165在第44栏第32至60行描述了该光学系统的各种附加的细节。图I所示的其他元件，即狭缝46、物镜48和第二狭缝50的功能在美国专利5,631, 165在第44栏第63行至第45栏第15行中描述。光电倍增管34、36和38检测侧向散射(在圆锥体中散射的光，所述圆锥体的轴大概垂直于入射激光束)或荧光(从细胞以来自如涉及光束的不同波长发出的光)。放置在光电倍增管34前面的滑动组件允许光电倍增管34的双重用途当偏振镜52移动至光路中时检测消偏振侧向散射(DSS)，和当过滤器54移动至光路中时检测绿色荧光(FLl)。放置在光电倍增管36前面的类似的滑动组件(未示出)允许检测偏振侧向散射(PSS)和橘黄色荧光(FL2)的双重用途。光电倍增管38配置有过滤器56以只检测红色荧光(FL3)。显而易见的是，上述分析仪的很多变体的是可能的。例如，两个圆柱透镜组可能被替换为变形棱镜对，靶心检测器可以被替换为单独的探测器和带孔的镜子，并且可以使用其他波长的光。美国专利5，631，165中，尤其在第24栏第47行至第25栏第36行以及图6和7中描述了不检测荧光的血液分析仪的实例。该描述通过引用并入本文。含有红细胞的血液悬液可以从采样喷嘴推进，并在那里与快速移动的、层流的鞘流接触。在被称为流体动力聚焦的过程中，样品流被挤压进入薄的中央核心。这种安排通常确保了在任何给定的时间在激光束的传感区域只有单个细胞。测量过程始于细胞核心流经过流动细胞池28，用稀释剂稀释使得细胞基本上以单行，在被鞘液包围的层流动样品流中通过激光照亮的体积。该照亮的体积由激光束和样品流的交集来限定，且在一个实施方案中尺寸大概为沿激光传播方向80μπι，沿样品流流动方向20 μ m,和在横向于样品流动和激光束传播两者的方向上约5至10 μ m。使用光电倍增管(PMT)可以收集在与激光束的轴呈90度散射的光。不是发光二级管，而是光电倍增管用在90度通道中，因为相对少的光以大角度散射，并且因为光电倍增管还可以用于检测一般来说更低强度的荧光发射。如果冲击偏振光经过主要来自细胞膜和核(如果存在)的光散射，它通常会保持其原始的垂直偏振面。然而，如果它与可能存在于细胞质中的某些亚细胞成分，例如颗粒体或各向异性组织互相作用，那么散射的光可能具有角度变化的偏振。为了使用这种现象，一个PMT的前面可以具有水平偏振器。该偏振器防止垂直偏振的光与光电倍增管互撞。因此，由“90度消偏振”PMT检测到的任何光是已经通过其与细胞亚结构(通常是白细胞，且特别是嗜酸性粒细胞)相互作用而消偏振的光。第二光电倍增管(“90度偏振”PMT)可以接收由分束器反射的散射光，所述分束器是成45度角和设计主要反射垂直偏振光和主要传输水平偏振光在激发(激光)波长。由第二光电倍增管检测的光的主要部分是垂直偏振的侧向散射光并携带与核的构造相关的信息。在此简要概述的散射光检测方案是关于多角度偏振光散射分类(MAPSS)的独特设计，并在美国专利·5，017，497中全面地描述。该描述通过引用并入本文。从光电传感器获得的数据可以用于构造一个多维散射图(包括二至五个或更多个维度，且典型的是四个维度)。可以使用装置的计算机图形处理功能查看任何三个维度，这可以实现在空间旋转的三维“实体”展示，使用颜色来识别由在数据站编程的自动算法实现的细胞群体的不同分类，或者替代地用来描绘来自第四维度的值。为了书面存档，可以通过六个用户可选的二维散射点或投影对和很多用户可选的一维直方图投影来检验思维的散射图。可以分析数据以列举例如样品中的红细胞和血小板，以及列举例如样品中的幼稚红细胞(例如网织红细胞)。可以如下将网织红细胞与成熟的红细胞区分开，即通过使用核酸染料或在试剂溶液中，在与包含在幼稚细胞(但不存在成熟细胞)中的RNA结合时染色，因此标记网织红细胞以允许通过荧光或光散射装置识别网织红细胞。按照下面更详细地描述的方法可以进一步分析数据。在自动的血液学分析仪中通过将独立等分的血液样本与裂解试剂混合来测量血液样品的总血红蛋白浓度(HGB)，并使用色度转换器测量所得细胞裂解物的血红蛋白浓度。在暴露于裂解试剂时，红血细胞完全裂解，并将血红蛋白释放到样品混合物中，血红蛋白在与裂解试剂中的配体反应形成发色体。然后在预定的波长下通过比色法测量血红蛋白发色体，并由该测量计算HGB。适合测量HGB的一种裂解试剂体系包括等渗的血液稀释剂，例如在美国专利4，521，518,4, 528，274,5, 935，857和6，706，526中描述的稀释剂，和裂解试剂，例如在美国专利5，763，280,5, 834，315和6，573，102中描述的裂解试剂；这些全部通过引用并入本文。替代地，试剂系统还可以是如美国专利5，882，934中描述的单一裂解试剂，其全部通过引用并入本文。此外，用于测量血红蛋白的本领域已知的各种裂解试剂可用于本发明的目的。可能使用非集中的流量孔径测量阻抗，且血液样品可以高度稀释，例如用稀释率为6250:1。当使用集中的流动池进行测量时，可以大幅降低稀释率，例如290:1。在血液学分析仪中测量期间为了保持红血细胞的体积和形态，使用等渗稀释剂来稀释血液样品。典型地，稀释剂包含一种或更多种碱金属盐。各种商用的等渗血液稀释剂可以用来稀释血液样品。合适的实例包括，但不限于，美国专利4，521，518,4, 528，274,5, 935，857和6，706，526中描述的稀释剂。当悬浮在导电溶液中的粒子或血细胞通过孔径时，可以测量由于阻抗增加产生的电子信号或脉冲。电脉冲可以用于计算血液样品的血细胞的数量。同时，脉冲的形状、高度和宽度与粒子的体积或大小直接相关，并可以转化成所测量的细胞的体积。当测量不同体积的、包含两种或更多种不同血细胞的样品时，从测量获得的直方图可以表现这些血细胞的体积分布。用于通过装备有阻抗计的血液分析仪对血细胞计数和测量大小的检测方法和仪器通常在美国专利2，656，508,3, 810, 011和5，125，737中描述，其全部内容通过引用并入本文。方法在下面随后的讨论和实施例部分，使用短语“将测量输入公式”或与其语法等同的·短语来描述某些计算。如公认的，任何单个计算都可以作为多步骤方法执行，并且使用单个公式可以描述许多多步骤计算。因此，具有“将测量输入公式”或类似步骤的任何方法并不意见将其只限制在涉及将测量输入单个公式的那些实施方案。如公认的和在本文的实施例部分说明的，这样的计算可以使用多个不同的步骤进行，每个步骤都使用不同的公式，这与使用单个公式时得到相同的结果。所有方法都在本文预期中，包括那些使用不同测量单位和不同公式得到与下面所述的类似或相同的同样结果的方法。可以用电脑执行计算方法的所有步骤，且计算的各种步骤可以在程序行使的计算机可读介质上体现。另外，在下面描述的一些实施方案中，该方法可以被描述为“使用”多个变量计算样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量的方法。应理解，术语“使用”包括将变量或其衍生物输入公式，在执行时输出结果，即样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量。术语“算法”和“公式”是作为同义词使用，并且如上面所述，并非意在暗示可以使用单一步骤解决任何计算。在特定的实施方案中，血红细胞群体中的某些指标(例如，群体中细胞的数量、群体中的平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞体积等)可以不使用光散射测量来计算，例如使用阻抗和总血红蛋白测量来计算。该方法在本领域是已知的，并在上面引用的参考文献中详细描述。本文提供了样品分析的方法。一般而言，该方法包括使用血液分析仪获取包括红血细胞群体的样品的一组数据点；和计算样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量，包括使用(I)在多个光散射通道上对单个红血细胞的测量；(II)使用阻抗值计算的红血细胞群体的平均细胞体积；(III)样品的总血红蛋白浓度；(IV)红血细胞群体中细胞的数目；(V)在多个光散射通道上对红血细胞群体进行的测量的平均值JP(VI)在血液分析仪中在至少一个光散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值。在特定的实施方案中和将在下面描述的，使用前可以过滤使用任何光散射通道的测量以除去由噪声和巧合产生的数据点。下面还将描述，作为方法的一部分，测量可以换算(即乘以合适的系数以将分析器之间的差异和任何一种分析仪的偏差降至最低)和规格化(即在数学上转化为产生集中在O周围和通常分布在-I和I之间的量)。在特定的实施方案中和在本公开文本的实施例部分更详细地描述的，可以计算样品中单个红血细胞的体积，使用(1)在ALL和IAS通道上对单个红血细胞的测量；(II)使用阻抗值计算的红血细胞群体的平均细胞体积；(III)群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用平均细胞体积、总血红蛋白浓度和群体中细胞的数目计算；(IV)在ALL和IAS通道上对红血细胞群体的测量的平均值；和(V)在血液分析仪中在IAS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS值。在这些实施方案中，ALL和IAS测量可以是经换算的ALL和IAS测量，即在计算细胞的体积之前相对于初始ALL和IAS测量调整ALL和IAS测量。在某些情况下，可以对初始IAS测量进行换算以提供经换算的IAS值，使用(I)红血细胞群体的平均细胞血红蛋白浓度；(II)在IAS通道上对红血细胞群体的测量的平均值；和(III)从在血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位IAS值。在本公开文本的实施例部分列出了用于换算初始IAS测量以提供经换算的IAS值的示例性公式。可以对初始ALL测量进行换算以提供经换算的ALL值，使用(I)经换算的IAS值；(II)使用阻抗值计算的红血细胞群体的平均细胞体积；和(III)在ALL通道中对红血细胞群体的测量的平均ALL值。在本公开文本的实施 例部分列出了用于换算初始ALL测量以提供经换算的ALL值的示例性公式。在特定的实施方案中和在本公开文本的实施例部分更详细地描述的，可以计算样品中单个红血细胞的血红蛋白含量，使用(1)在IAS和PSS通道上对单个红血细胞的测量；(II)群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用基于阻抗值的平均细胞体积、总血红蛋白浓度和群体中细胞的数目来计算；(III)在IAS和PSS通道上对红血细胞群体的测量的平均值；和(IV)在血液分析仪中的IAS和PSS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS和PSS值。在这些实施方案中，IAS和PSS测量可以是经换算的IAS和PSS测量，即在计算细胞的血红蛋白含量之前相对于初始IAS和PSS测量调整IAS和PSS测量。在某些情况下，可以使用上述方法对初始IAS测量进行换算以提供经换算的IAS值，即使用(I)红血细胞群体的平均细胞血红蛋白浓度；(II)在IAS通道上对红血细胞群体的测量的平均值；(III)从在血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位IAS值。在本公开文本的实施例部分列出了用于换算初始IAS测量以提供经换算的IAS值的示例性公式。可以对初始PSS测量进行换算以提供经换算的PSS值，使用(I)红血细胞群体的平均细胞血红蛋白浓度；(II)在PSS通道上对红血细胞群体的测量的平均值；(III)从在血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位PSS值。在本公开文本的实施例部分列出了用于换算初始PSS测量以提供经换算的PSS值的示例性公式。在某些情况下，为了除去由噪声(例如细胞碎片或其他粒子)和巧合(即在几乎相同的时间穿过血液分析仪的光源的两个细胞的未分辨运动)产生的数据点，在用在方法中之前，例如在可能出现任何换算之前，可以过滤用于任何光散射通道的数据点。在一些实施方案中，过滤以除去被认为从噪声和巧合产生的高端和低端的测量。在一个实施方案中，在直方图中绘制用于任意通道的数据点(例如用于ALL、IAS和/或PSS通道的数据)，且可接受数据的边界可以设定为直方图峰高的定义百分比，如图3所示。例如，可接受数据的边界可以设定为直方图峰高的1%至10%的百分比范围内，例如5%。为了从网织红细胞的IAS数据除去巧合和噪声，用作上边界的直方图直条(bin)与用于红血细胞的整个群体的直方图直条比可以增加5%至15% (例如10%)，因为网织红细胞往往大于红血细胞，这意味着通过巧合产生的数据往往具有比红血细胞的整个群体更高的值。用于从由血液分析仪获得的光学数据识别和除去噪声(在较低范围)和巧合的其他方法是已知的，并可用于本文。在一些实施方案中，该方法可能还包括作为计算步骤一部分的、测量的规格化，例如在对测量进行换算之后。规格化包括相对于常数调整测量，以便获得接近I的量，并进一步减去1，以便获得经规格化的、分布在O周围的测量。在具体实施方案中，每个通道的初始数据可以除以规格化常数(对于每个通道是不同的)，该常数可由经验确定。规格化常数在样品之间不可改变。相反，除非出现需要，该常数可以是稳定并在样品间不经变化的。因此，在具体实施方案中，该方法可以包括a)使用血液分析仪获得一组用于包括红血细胞群体的样品的数据点；b)除去对应噪声和巧合的数据点以提供经过滤的数据集；c)计算样品中包含的单个红血细胞的体积或血红蛋白含量，使用(1)在多个光散射通道上对单个红血细胞的测量；(II)使用阻抗值计算的红血细胞群体的平均细胞体积；
(III)样品的总血红蛋白浓度；(IV)红血细胞群体中细胞的数目；(v)在多个光散射通道上对红血细胞群体的测量的平均值；和(VI)在血液分析仪中至少一个光散射通道上分析的·在先红血细胞群体的平均中位值。该计算包括对测量的换算和规格化，并将这样经换算、规格化的测量输入公式以获得细胞的体积和/或血红蛋白浓度。对红血细胞群体中单个红血细胞的体积和/或单个红血细胞的血红蛋白量的测量队群体的其他特征的进一步分析。在一个实施方案中，该方法可以进一步包括计算具有限定的特征的红血细胞的比例(可以表示为百分比，例如分数或其他数字)。例如，该方法可以用来计算体积在限定体积以上和/或以下的红血细胞的百分比(例如，大于120fL的细胞的百分比，即“大红细胞的”红血细胞的百分比；或小于60fL的细胞的百分比，即“小红细胞的”红血细胞的百分比)。在另一个实施方案中，该方法可以用来计算血红蛋白浓度在限定体积以上和/或以下的红血细胞的比例(例如，细胞血红蛋白浓度小于28g/dL的血红细胞的百分比，即“低血色素”血红细胞的百分比；或细胞血红蛋白浓度大于41g/dL的血红细胞的百分比，即“增色性”血红细胞的百分比)。同样，群体的单个红血细胞的体积和/或血红蛋白浓度可以统计分析，以识别其他统计度量，其描述例如群体内单个RBC的分布形状或者体积或血红蛋白浓度的变化。在一个示例性实施方案中，计算血红细胞群体中血红蛋白浓度的分布宽度。在进一步实施方案，该方法进一步涉及识别样品中的网织红细胞，它是红血细胞的亚组，可通过荧光与其他红血细胞区分。该方法还可以用来分析样品中的网织红细胞，通过例如计算网织红细胞中血红蛋白的平均量、网织红细胞中血红蛋白的平均浓度、或网织红细胞的平均体积。上述血液分析仪可以用于例如调查红血球疾病或贫血，并且如果必要的话，用于作出治疗决定。贫血的实例包括缺铁性贫血、慢性疾病的贫血、和由维生素B12和叶酸引起的巨成红细胞性贫血。例如，铁补充物的施用用于治疗缺铁性贫血是极其有效的，但是对慢性疾病的贫血无效。因此，贫血的原因对治疗贫血是重要的。缺铁是世界范围内最普遍的单一缺陷状态。其在经济上是很重要的，因为它削弱了受影响的个体从事体力劳动的能力，并影响了儿童的成长和学习。具有贫血或不贫血的绝对性缺铁，和功能行缺铁是高发的临床病症，这些患者有缺铁性红细胞生成。绝对性缺铁被定义为体内总的铁含量降低。缺铁足够严重以致减少红细胞生成并导致贫血的发展时发生缺铁性贫血。功能性缺铁描述了身体的总铁含量正常甚至升高，但铁是“锁定”的且不可用于产生血红细胞的状态。该病症主要在进行血液透析的慢性肾功能衰竭患者，和患有慢性炎症或慢性感染的患者中观察到。可以使用血液和生化指标测量铁的状态。铁的状态的每个参数反映了在不同的体内铁区室的变化，并在影响在不同水平的铁损耗。特定的铁测量包括血红蛋白、平均细胞体积、血细胞比容、红细胞原卟啉、等离子体铁、转铁蛋白、转铁蛋白饱和水平、血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和红细胞分布宽度。使用血红蛋白的时间已经比其他任何铁状态参数都长。一旦发展为贫血，它提供了对缺铁严重性的定量测量。血红蛋白测定是一种方便和简单的筛选方法，并且在缺铁的患病率高(如妊娠或婴儿期)时特别有用。使用血红蛋白作为铁状态的测量的局限性是，它缺乏特异性(因为例如维生素B12和叶酸缺乏、遗传疾病和慢性感染的因素可以限制红细胞生成)和由于正常人群和缺铁人群之间值的明显重叠而相对不灵敏。为了识别缺铁性贫血，与对铁状态更有选择性的测量一起进行血红蛋白的测量。
缺铁变得严重时出现平均细胞体积的降低，大约在同一时间开始发展为贫血。一旦排除地中海贫血和慢性疾病的贫血，平均细胞体积的降低是相当特殊的缺铁的指标。接受80fl的截止值为成人正常范围的下限。近年来使用红细胞分布宽度(RDW)与其他用于贫血分类的参数相结合。它反映了红细胞大小的变化并可用于检测红细胞不均的微妙程度。目前最常用的铁状态参数是转铁蛋白饱和度(TSAT)和血清铁蛋白。然而，二者都是铁状态的间接测量。转铁蛋白是一种运输蛋白，它包含将铁从存储位点运输到红血球前期细胞的两个铁结合位点。TSAT (即由铁占据的总结合位点的百分比)是对可用于红细胞生成的铁的测量。TSAT如下计算，通过血清铁除以总铁结合能力、对循环转铁蛋白的测量，并乘以100。铁蛋白是一种存储蛋白质，它主要包含在网状内皮系统内部，以及释放到血清中的一些量。在铁过量的条件下，铁蛋白产量增加以抵消等离子体铁的增加。因此，血清中铁蛋白的水平反映了存储的铁含量。网织红细胞是未成熟的红细胞，成熟时间只有I到2天，然后变成成熟的红血细胞。当从骨髓首先释放时，对它们的血红蛋白含量的测量可以提供立即可用于红细胞生成的铁的量。这些网织红细胞中低于常规地血红蛋白含量是铁供应相对于需求不足的指示。这些网织红细胞中血红蛋白的量还对应于成熟的红血细胞中血红蛋白的量。近年来，在许多研究中已经评估网织红细胞的血红蛋白含量(CHr)作为缺铁和功能性缺铁的测试，且被认为是高度灵敏和特异性的。然而，确切阈值尚未建立，因为阈值取决于所用的实验室和仪器。促红细胞生成素对刺激血红细胞的产生是有效的，但没有足够的铁供应来结合至血红蛋白，红细胞会减色，即血红蛋白含量低。因此，在缺铁状态下，相当比例的离开骨髓的红血细胞具有低血红蛋白含量。通过测量血红蛋白含量低于28g/dL的血红细胞的百分比，可以检测缺铁。低血色素细胞的百分比大于10%已经与缺铁相关联，并因此被用作缺铁检测的诊断标准。程麽在一个实施方案中，提供用于执行上述方法的包含指令(即“程序”)的物理内存。在一些实施方案中，该内存可以包括物理的计算机刻度介质，该介质包括程序用于计算a)使用上述方法计算样品的单个红血细胞的体积；和/或b)以上述方法计算样品的单个红血细胞中血红蛋白的量。在一个实施方案中，收集来自血液分析仪的数据，并使用来自FCS文件的输入，执行包含用于计算的算法的程序。可以在物理存储或传输介质中提供程序。然后接收指令的计算机可以执行算法和/或处理从主题方法获得的数据。计算机可读的存储媒介的实例包括软盘、磁带、CD-ROM、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘、或计算机可读卡如PCMCIA卡等，无论该设备是计算机内置或外置的。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，“存储”意味着记录信息使其可以在稍后的日期被本地或远程网络的计算机访问和检索。每次运行样品时可以自动执行上述方法。实施例算法实施
本文描述了用于测量单个红血细胞(RBC)的参数的方法。可以测量的确定参数包括小于60fL的RBC的分数(小红细胞百分比，％Micro)，大于120fL的RBC的分数(大红细胞百分比，％Macro)，细胞HGB浓度低于28g/dL的RBC的分数(低血色素百分比，%Hypo)和细胞HGB浓度高于41g/dL的RBC的分数(增色性百分比，％Hyper)。其他感兴趣的参数包括RBC中HGB浓度分布宽度(血红蛋白分布宽度，HDW)、网织红细胞中HGB的平均量(网织红细胞的平均红细胞血红蛋白，MCHr)、网织红细胞中HGB的平均浓度(网织红细胞的平均红细胞血红蛋白浓度，MCHCr )、网织红细胞的平均体积(网织红细胞的平均红细胞体积，MCVr )、和网状血小板的分数(网状血小板的百分比，%rPLT)。RBC参数来源于在ALL、IAS和PSS中的光学逐一细胞散射数据，使用光学细胞血红蛋白浓度(CHC)和光学体积模型。下面的实施例详细描述这些模型的实施。数据事件过滤进行Retic测定(包括收集RBC、PLT和Retic细胞事件，以及一些WBC细胞事件)，并收集ALL、IAS、PSS和FLl数据。下面描述的RBC算法使用所有这些来源的数据。图2说明了来自Retic测定的数据的log FLl对线性IAS形式。Retic测定将RBC (红血细胞)和Retic (网织红细胞)与PLT (血小板)和WBC (白血细胞)分离。本实施例使用相同的分类，但仔细检查RBC和Retie。如图2所示，RBC存在一定量的巧合(量化的总RBC计数的约几个百分比)，它应在任何计算之前消除。因此，在三个相关检测通道(ALL、IAS和PSS)中找到RBC和Retic群体的分布的最高点，然后可接受数据的边界被设定在5%的直方图峰高。这些阈值用来消除噪声(在低端)和巧合事件(在高端)，且来自之前研究中的数据。为了除去Retic中的巧合和噪声，之前得到的最高级IAS边界增加了 10%，因为Retic往往大于RBC。图3示出了用于控制RBC和Retic的阈值。x轴上方的水平线是相对于最大值的5%水平。内部的垂直线是RBC的阈值，它被放置在5%阈值外面的第一个直条处。在该实施例中，380通道处RBC和Retic都是低阈值。RBC的上阈值是在630通道处。增加10%，得到用作Retic的上阈值(右侧垂直线)的693通道。樽型和通道换算方案通道换算的方式与体积和CHC模型构建的方式密切联系。图4描绘了那些关系。参考图4，有由其构建并应用于各个逐一细胞测量的组(左侧栏)的变量和函数；以及与该组的平均值相关联的其他变量和函数(右侧栏)。在以下的段落中定义和讨论图4表中的数量。在应用了如前面“数据事件过滤”中所述的过滤边界之后，测定剩余的RBC和Retic的平均值(在IAS、ALL和PSS中)。这些平均值用来构建体积和CHC模型，并用来校准通道换算因子。因为RBC参数可用于具有不同增益设定的分析仪，该算法包含一种机制，即在将
来自IAS、ALL和PSS的测量用于计算之前，将其标准化和换算。光学标准化和换算(以逐一
细胞为基础)如下
权利要求
1.血液分析仪，其包括a)流动细胞池；b)用于将光导向所述流动细胞池的光源；c)用于检测多个光散射通道上细胞的光散射的多个检测器；d)用于测量细胞裂解物中血红蛋白浓度的色度转换器；e)用于测量阻抗变化的阻抗转换器；和f)数据分析工作站，其包括计算包含红血细胞群体的样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量的程序，所述计算使用1.在多个所述光散射通道上对所述单个红血细胞的测量； .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；iii.所述样品的总血红蛋白浓度；iv.所述红血细胞群体中细胞的数目；V.在所述多个所述光散射通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和 vi.在所述血液分析仪中在至少一个所述光散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值。
2.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述数据分析工作站包括计算所述样品中所述单个红血细胞的体积的程序，所述计算使用i.在ALL和IAS通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；iii.所述群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用所述平均细胞体积、所述总血红蛋白浓度和所述群体中细胞的所述数目来计算；V.在ALL和IAS通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和vi.在所述血液分析仪中在所述IAS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS值。
3.如权利要求2的血液分析仪，其中所述数据分析工作站包括在计算所述体积之前换算所述ALL和IAS测量的程序，其中a)换算所述IAS测量以提供经换算的IAS值，所述换算使用 i.所述红血细胞群体的所述平均细胞血红蛋白浓度； .在所述IAS通道上对所述红血细胞群体进行的所述测量的平均值；iii.从在所述血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位IAS值；和b)换算所述ALL测量以提供经换算的ALL测量，所述换算使用 i.所述经换算的IAS值；和 .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的所述平均细胞体积；和iii.在所述ALL通道中对所述红血细胞群体进行的所述测量的平均ALL值。
4.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述数据分析工作站包括计算所述样品中所述单个红血细胞的血红蛋白浓度的程序，所述计算使用i.在IAS和PSS通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .所述群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用基于阻抗值的所述平均细胞体积、所述总血红蛋白浓度和所述群体中的所述细胞数目来计算；· iii.在IAS和PSS通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和·iv.在所述血液分析仪中在所述IAS和PSS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS和PSS值。
5.如权利要求4所述的血液分析仪，其中所述数据分析工作站包括在计算所述血红蛋白浓度之前换算所述IAS和PSS测量的程序，其中a)换算所述IAS测量以提供经换算的IAS值，所述换算使用 i.所述红血细胞群体的所述平均细胞血红蛋白浓度； .在所述IAS通道上对所述红血细胞群体的所述测量的平均IAS值； iii.从在所述血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位IAS值；和b)换算所述PSS测量以提供经换算的PSS值，所述换算使用 i.所述红血细胞群体的所述平均细胞血红蛋白浓度； .在所述PSS通道上对所述红血细胞群体进行的所述测量的平均PSS值；iii.从在所述血液分析仪中运行的在先样品获得的平均中位PSS值。
6.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述程序包括用于过滤所述测量以除去由噪声和巧合产生的数据点的指令。
7.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述程序包括用于将所述测量规格化的指令，其中所述规格化包括相对于常数调整所述测量。
8.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述程序还包括用于计算具有限定特征的红血细胞部分的指令。
9.如权利要求8所述的血液分析仪，其中所述计算包括计算体积在限定体积以上或以下的红血细胞的百分比。
10.如权利要求8所述的血液分析仪，其中所述计算包括计算血红蛋白浓度大于或小于限定浓度的细胞的百分比。
11.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述程序还包括用于计算所述红血细胞中血红蛋白浓度的分布宽度的指令。
12.如权利要求I所述的血液分析仪，其中所述程序还包括用于识别所述样品中网织红细胞的指令。
13.如权利要求12所述的血液分析仪，还包括计算所述网织红细胞中血红蛋白的平均量、所述网织红细胞中血红蛋白的平均浓度、或所述网织红细胞的平均体积。
14.如权利要求I所述的血液分析仪，还包括用于计算所述样品中网状血小板的部分的指令。
15.样品分析的方法，所述方法包括使用血液分析仪获得一组用于包括红血细胞群体的样品的数据点；和计算所述样品中包含的单个红血细胞的体积或血红蛋白含量，所述计算使用 i.在多个光散射通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；iii.所述样品的总血红蛋白浓度；iv.所述红血细胞群体中细胞的数目；V.在所述多个所述光散射通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和vi.在所述血液分析仪中在至少一个所述光散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值。
16.如权利要求15所述的方法，其中计算所述样品中所述单个红血细胞的所述体积， 所述计算使用i.在ALL和IAS通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；iii.所述群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用所述平均细胞体积、所述总血红蛋白浓度和所述群体中所述细胞数目来计算；V.在ALL和IAS通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和vi.在所述血液分析仪中在所述IAS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS值。
17.如权利要求15所述的方法，其中计算所述样品中所述单个红血细胞的所述血红蛋白含量，所述计算使用i.在IAS和PSS通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .所述群体的平均细胞血红蛋白浓度，使用基于阻抗值的所述平均细胞体积、所述总血红蛋白浓度和所述群体中所述细胞数目来计算；iii.在IAS和PSS通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和iv.在所述血液分析仪中在所述IAS和PSS通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位IAS和PSS值。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述计算使用样品的训练集依据经验推导的简单的二次公式。
19.如权利要求15所述的方法，还包括计算具有限定特征的红血细胞的百分比。
20.用在血液分析仪中以分析样品的物理的计算机可读介质，其包括计算包含红血细胞群体的样品中单个红血细胞的体积或血红蛋白含量的程序，所述计算使用i.在多个所述光散射通道上对所述单个红血细胞进行的测量； .使用阻抗值计算的所述红血细胞群体的平均细胞体积；iii.所述样品的总血红蛋白浓度；iv.所述红血细胞群体中细胞的数目；V.在所述多个所述光散射通道上对所述红血细胞群体进行的测量的平均值；和 vi.在所述血液分析仪中在至少一个所述光散射通道上分析的在先红血细胞群体的平均中位值。
全文摘要
本发明提供的是在包含红血细胞群体的样品中测量单个红血细胞的体积或血红蛋白含量的方法。所述方法可以在血液分析仪中进行。还提供的是用于实施所述方法的血液分析仪和含有实施所述方法的程序的计算机可读介质。
文档编号G01N33/49GK102933964SQ201180013889
公开日2013年2月13日 申请日期2011年1月14日 优先权日2010年1月15日
发明者马丁·克罗肯贝格尔, 戴安娜·G.·加勒特, 贾科莫·瓦卡 申请人:雅培制药有限公司