专利名称：真假蜂胶的薄层色谱(tlc)鉴别方法
技术领域：
本发明涉及蜂胶的鉴别方法，具体地，本发明涉及ー种利用薄层色谱方法鉴别真假蜂胶的方法。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂(树胶)，混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的ー种具有芳香气味的胶状固体物。近代研究证明，蜂胶所含有的丰富而独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用，现已成为各国科学研究的热点，并成为新兴的保健品倍受推祟。假蜂胶一般是指杨树芽胶或掺了杨树芽胶的蜂胶。杨树芽胶是由人工采集杨树芽，经高温蒸煮熬出芽孢的胶状物质，再经乙醇浸泡提取和浓缩得到的黑色胶状物质。与蜂胶相比，假蜂胶价格低廉，生理活性物质含量得不到保证，不法商家在蜂胶及其制品中掺入杨树胶充当蜂胶出售，使蜂胶产品的安全性也得不到保证。据中国蜂产品协会统计目前市场上有一半以上蜂胶产品是假的，所以真假蜂胶的辨别是涉及食品安全的大问题。蜂胶的成分相当复杂，其主要成分是黄酮类化合物。目前，已从蜂胶中分离出20 多种黄酮化合物，它是蜂胶中的主要活性物质，约占蜂胶的4. 13%。这些黄酮化合物包括黄酮类、黄酮醇类和双氢黄酮类等。属于黄酮类的有白杨素、杨芽黄素、刺槐素、芹菜素、柳穿钱素等；属于黄酮醇类的有良姜素、高良姜素、鼠李素、异鼠李素、鼠李柠檬素、山奈素、岳桦素、槲皮素及其衍生物等，属于双氢黄酮类的有乔松素、松球素、樱花素、异樱花素、柚皮素等。黄酮化合物是ー类重要的并且在植物界分布很广的天然化合物。药理学试验证明，此类物质中有许多具有很强的活性，对多种疾病有良好的疗效，医用价值甚高。目前真假蜂胶鉴别的主要方法为指纹图谱法、分光光度比色测定总黄酮评价法、 有机酸含量判断法、GC-MS鉴定成分法、热分析法，肉桂酸与对-香豆酸以及黄酮类含量法、 癸烯酸含量法、糖类成分法等。CN 1221110A采用简单的化验仪器和简便的方法快速鉴别蜂胶是否掺假，主要包括把盐酸、镁粉加入到蜂胶乙醇溶液中，摇动后呈红色，即为阳性(+)反应，然后把硫酸、 高锰酸钾加到蜂胶乙醇溶液中，同时开动秒表，记下紫红色消極的时间，查表即可得出结论。CN 101871919 A提供了一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，是用HPLC測定水杨苷来判断蜂胶的真假，从而控制蜂胶质量。另外还有目測法、总黄酮的碱性铝离子络合鉴别反应、酸性KMnO4滴定法等等。现有技术中真假蜂胶鉴别方法普遍具有准确度不高、缺乏量化指标、操作复杂、速度较慢等缺点
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之ー在于提供一种真假蜂胶的薄层色谱 (TLC)鉴别方法。本发明通过采用三种不同的溶剂系统的薄层层析(TLC)技木，以待测蜂胶中的生物活性成分黄酮类化合物在层析系统中的色谱行为与真蜂胶的对照品在相同标示浓度相同斑点上样量的情况下及相同实验条件下在层析系统中的色谱行为相对照，并在紫外分析灯下进行荧光斑点面积大小和荧光强度的对比来鉴别真假蜂胶。所述真假蜂胶的薄层色谱(TLC)鉴别方法主要包括(1)选择展开剂为甲苯、乙酸乙酯和冰醋酸的混合液，或苯和乙酸乙酯的混合液， 或苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液；(2)采用相同溶剂提取相同重量的真蜂胶及待测蜂胶样品，并将提取液分別配制成相同浓度的样液；(3)分别将真蜂胶及待测蜂胶样液在相同条件下进行同步点样、展开、干燥；(4)在366nm波长紫外灯下测试荧光強度及荧光斑点面积并进行对比，若待测蜂胶与真蜂胶荧光強度相比差距在20 %以内(包括20 % )，则为真蜂胶；若待测蜂胶与真蜂胶荧光強度相比差距在20%以上，则为假蜂胶；或若待测蜂胶与真蜂胶荧光斑点面积相比差距在20%以内(包括20%)，则为真蜂胶；若待测蜂胶与真蜂胶荧光斑点面积相比差距在20%以上，则为假蜂胶。优选地，薄层层析板在使用前进行活化，其活化温度为90 115°C，例如91°C、 92°C、95°C、100°C、110°C、114°C、114. 5°C等，特别优选为 105°C ；活化时间优选为 0. 3 浊， 特別优选为0. 5 lh。优选地，所述薄层层析板为硅胶G薄层板。优选地，步骤(1)中所述展开剂甲苯、乙酸乙酯和冰醋酸的混合液中各组分体积比为 9 11 2 4 0.2 0.8，例如 9 4 0. 8、11 2 0. 2、10 3 0. 5 等，特别优选为10 3 0.5。优选地，步骤(1)中所述展开剂苯和乙酸乙酯的混合液中各组分体积比为2 7 10，例如3 10,6 10,7 10等，更优选为4 5 10，特别优选为3 7。优选地，步骤(1)中所述展开剂苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液中各组分体积比为 17 ぬ2 7 1 5，例如17 7 5、23 2 1、17 7 1等，进ー步优选为 19 22 4 6 2 4，特别优选为20 5 2. 5。优选地，步骤( 中所述真蜂胶样品至少1組，优选2 10組，特別优选3 8組； 优选所述各组真蜂胶样品选自不同批次。 优选地，步骤( 中所述假蜂胶样品至少1組，优选2 10組，特別优选3 8組； 优选所述各组假蜂胶样品选自不同批次。所述真蜂胶及假蜂胶样液的测试浓度为所属领域公知技木，可由所属领域的技术人员根据其掌握的专业知识決定。优选地，步骤じ)中所述用于提取的溶剂为乙醇、水、甲醇、己烷、丙酮、氯仿中的1 种或至少2种的组合，所述组合典型但非穷尽的实例有乙醇和水的組合，己烷、丙酮和氯仿的组合，乙醇、水和甲醇的组合等，进ー步优选为乙醇和水的混合溶液，更优选质量浓度为80 99%的乙醇的水溶液，特別优选质量浓度为85 95%的乙醇的水溶液。优选地，步骤(3)中所述点样采用定量毛細管，特別优选为10 μ L定量毛細管。
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优选地，步骤(3)中所述点样基线距薄层板底边2cm。优选地，步骤(3)中所述展开在距板上端5 7cm时停止。优选地，所述真假蜂胶的鉴别方法采用薄层扫描仪进行。本发明的目的之一还在于提供一种用于真假蜂胶的薄层色谱鉴别方法的展开剂，所述展开剂为展开剂苯和乙酸乙酯的混合液，其中各组分体积比为2 7 10，例如 3 10,6 10,7 10等，优选为4 5 10，特别优选为3 7。本发明的目的之一还在于提供一种用于真假蜂胶的薄层色谱鉴别方法的展开剂， 所述展开剂为苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液，其中各组分体积比为17 23 2 7 1 5，例如 17 7 5、23 2 1、17 7 1 等，进ー步优选为 19 22 4 6 2 4， 特別优选为20 5 2.5。本发明所述真假蜂胶的薄层色谱鉴别方法与现有技术相比，具有灵敏、准确可信、 操作简单、可靠性高、省时高效等特点。
图1是实施例1的薄层色谱鉴别結果。图2是实施例2的薄层色谱鉴别結果。图3是实施例3的薄层色谱鉴别結果。
具体实施例方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1取6批待测蜂胶样品，记为a、b、C、d、e、f。取6批经过鉴别的真蜂胶，依次标记为 A、B、C、D、E、F。待测蜂胶样品a、b、c、d、e、f和6批真蜂胶各精密称取2. OOOOg,分别置于 IOOml烧杯中，然后向各烧杯中加入95%的乙醇10ml，置超声波清洗机中超声提取30min， 依次过滤，滤液分别滤入IOml的容量瓶中，最后以95%的乙醇稀释定容到刻度。这样制成标示浓度相同的真胶供试液6份作为參照液；同时，待测蜂胶样品a、b、c、d、e、f也同法制成了与前述真胶參照液相同标示浓度的供试液。用定量毛細管依次吸取10微升真蜂胶參照液A、B、C、D、E、F和待测蜂胶样品a、 b、c、d、e、f点样于同样活化好的薄层板上。点样基线距薄层板底边2cm左右。接触点样时注意不要损伤薄层表面，并且样品开始扩散后不可移动接触点。将点样操作制备好的三块薄层板用甲苯乙酸乙酯冰醋酸=11 2 0.2 溶剂系统倾斜上行法展开至距板上端5cm处停止展开，取出晾干溶剂后置紫外分析灯 UV366nm下检测荧光斑点。6种不同批号的相同标示浓度相同薄层上样量的真胶黄酮TLC谱斑点面积和荧光強度接近一致即含量比较接近；而与真胶相同标示浓度相同薄层上样量的待测胶黄酮TLC 谱斑点面积和荧光強度明显偏离真胶，即含量明显存在差別，并且普遍高于或强于真胶。经测试，待测蜂胶样品a、b、c、d、e、f荧光强度比真蜂胶參照液A、B、C、D、E、F荧光强度分别高21%、观％、21%、25%、33%、32%，荧光斑点面积分别大21%,28%,21%,25%,33%,32%,所以该批蜂胶为假蜂胶。实施例2取6批待测蜂胶样品，记为a'、b'、c'、d'、e'、f ‘。取6批经过鉴别的真蜂胶，依次标记为A'、B'、C'、D'、E'、F'。待测蜂胶样品和6批真蜂胶各精密称取 2. OOOOg，分别置于IOOml烧杯中，然后向各烧杯中加入85 %的乙醇10ml，置超声波清洗机中超声提取30min，依次过滤，滤液分别滤入IOml的容量瓶中，最后以85%的乙醇稀释定容到刻度。这样制成标示浓度相同的真胶供试液6份作为参照液；同时，待测蜂胶样品也同法制成了与前述真胶参照液相同标示浓度的供试液。用定量毛细管依次吸取10微升真蜂胶参照液A'、B'、C'、D'、E'、F'和待测蜂胶样品a'、b'、c'、d'、e'、f'点样于相同活化好的薄层板上。点样基线距薄层板底边2cm左右。接触点样时注意不要损伤薄层表面，并且样品开始扩散后不可移动接触点。将点样操作制备好的三块薄层板用苯乙酸乙酯=3 7溶剂系统倾斜上行法展开至距板上端7cm处停止展开，取出晾干溶剂后置紫外分析灯UV366nm下检测荧光斑点。经测试，待测蜂胶样品c'、f'荧光强度比真蜂胶参照液A'、B'、C'、D'、E'、 F'荧光强度分别高21%和25%，为假蜂胶，而a'、b'、d'、e'荧光强度比真蜂胶参照液 A'、B'、C'、D'、E'、F'荧光强度低约观％，也为假蜂胶。实施例3取6批待测蜂胶样品，记为a*、b*. (Λ cT、e*. f*。取6批经过鉴别的真蜂胶，依次标记为A*、B*、C*、D*、E*、F*。待测蜂胶样品a*、b*、c*、d*、e*、f*和6批真蜂胶各精密称取 2. OOOOg，分别置于100ml烧杯中，然后向各烧杯中加入90%的乙醇10ml，置超声波清洗机中超声提取30min，依次过滤，滤液分别滤入IOml的容量瓶中，最后以90%的乙醇稀释定容到刻度。这样制成标示浓度相同的真胶供试液6份作为参照液；同时，待测蜂胶样品aW、 c*. cT、e*. f*也同法制成了与前述真胶参照液相同标示浓度的供试液。用定量毛细管依次吸取10微升真蜂胶参照液k*、B*. Cf、D*. Ε*. F*和待测蜂胶样品 aW、C*、cT、e*、f*点样于同样活化好的薄层板上。点样基线距薄层板底边2cm左右。接触点样时注意不要损伤薄层表面，并且样品开始扩散后不可移动接触点。如此相同的点样操作制备薄层板三块。将点样操作制备好的三块薄层板用苯乙酸乙酯甲酸=23 2 1溶剂系统倾斜上行法展开至距板上端5cm处停止展开，取出晾干溶剂后置紫外分析灯UV366nm下检测荧光斑点。经测试，待测蜂胶样品a*、b*. (Λ cT、e*. f*荧光强度比真蜂胶参照液k*、B*. C*. D*. Ε*.F*荧光强度分别高21 %、28 %、21 %、22 %、27 %、25 %，荧光斑点面积分别大21 %、28 %、 21%,22%,27%,25%,所以该批蜂胶均为假蜂胶。实施例1、实施例2和实施例3的实验结果证明，真假蜂胶在该层析系统中的色谱行为高度相似，但荧光斑点面积大小和荧光强度相差甚远。据此可以鉴别真假蜂胶。对比例1总黄酮的碱性铝离子络合鉴别反应甘草黄酮与铝离子先经亚硝酰化络合产生络合物，该络合物在碱性条件下经互变异构生成红色醌式结构，产物的吸光度和甘草黄酮浓度在一定范围内符合朗白-比尔定律。
权利要求
1.真假蜂胶的薄层色谱(TLC)鉴别方法，其特征在干，所述方法包括(1)选择展开剂为甲苯、乙酸乙酯和冰醋酸的混合液，或苯和乙酸乙酯的混合液，或苯、 乙酸乙酯和甲酸的混合液；(2)采用相同溶剂提取相同重量的真蜂胶及待测蜂胶样品，并将提取液分別配制成相同浓度的样液；(3)分别将真蜂胶及待测蜂胶样液在相同条件下进行同步点样、展开、干燥；(4)在366nm波长紫外灯下测试荧光強度及荧光斑点面积并进行对比，若待测蜂胶与真蜂胶荧光強度相比差距在20 %以内(包括20 % )，则为真蜂胶；若待测蜂胶与真蜂胶荧光強度相比差距在20%以上，则为假蜂胶；或若待测蜂胶与真蜂胶荧光斑点面积相比差距在20%以内(包括20% )，则为真蜂胶；若待测蜂胶与真蜂胶荧光斑点面积相比差距在 20%以上，则为假蜂胶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在干，薄层层析板在使用前进行活化，其活化温度为90 115°C，特別优选为105°C ；活化时间优选为0. 3 2h，特別优选为0. 5 Ih ；优选地，所述薄层层析板为硅胶G薄层板。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在干，步骤(1)中所述展开剂甲苯、乙酸乙酯和冰醋酸的混合液中各组分体积比优选为9 11 2 4 0.2 0.8，特別优选为 10 3 0. 5 ；优选地，步骤(1)中所述展开剂苯和乙酸乙酯的混合液中各组分体积比为2 7 10， 更优选为4 5 10，特別优选为3 7。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在干，步骤(1)中所述展开剂苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液中各组分体积比为17 23 2 7 1 5，进ー步优选为19 22 4 6 2 4，特别优选为20 5 2. 5。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在干，步骤O)中所述真蜂胶样品至少1組， 优选2 10组，特别优选3 8组；优选所述各组真蜂胶样品选自不同批次；优选地，步骤O)中所述假蜂胶样品至少1組，优选2 10組，特別优选3 8组；优选所述各组假蜂胶样品选自不同批次。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在干，步骤(2)中所述用于提取的溶剂为乙醇、水、甲醇、己烷、丙酮、氯仿中的1种或至少2种的组合，进ー步优选为乙醇和水的混合溶液，更优选质量浓度为80 99%的乙醇的水溶液，特別优选质量浓度为85 95%的乙醇的水溶液。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在干，步骤(3)中所述点样采用定量毛细管，特別优选为10 μ L定量毛細管；优选地，步骤(3)中所述点样基线距薄层板底边2cm ；优选地，步骤(3)中所述展开在距板上端5 7cm时停止。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在干，所述真假蜂胶的鉴别方法采用薄层扫描仪进行。
9.一种用于如权利要求1-8任一项所述真假蜂胶的薄层色谱鉴别方法的展开剂，其特征在干，所述展开剂为展开剂苯和乙酸乙酯的混合液，其中各组分体积比为2 7 10，优选为4 5 10，特別优选为3 7。
10. 一种用于如权利要求1-8任一项所述真假蜂胶的薄层色谱鉴别方法的展开剂， 其特征在干，所述展开剂为苯、乙酸乙酯和甲酸的混合液，其中各组分体积比为17 23 2 7 1 5，进ー步优选为19 22 4 6 2 4，特别优选为20 5 2. 5。
全文摘要
本发明涉及一种通过同时采用薄层层析(TLC)技术，以蜂胶中的生物活性成分黄酮类化合物在该层析系统中的色谱行为与选定的真蜂胶的对照品在相同标示浓度相同斑点上样量的情况下，在该层析系统中的色谱行为相对照，并在紫外分析灯下进行荧光斑点面积大小和荧光强度的对比来鉴别真假蜂胶。结果表明真假蜂胶在该层析系统中的色谱行为高度相似，但荧光斑点面积大小和荧光强度相差甚远。据此可以鉴别真假蜂胶。结果证明本发明的方法灵敏、简易、准确可信。
文档编号G01N21/64GK102539613SQ201210001290
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者何丽琼, 冉江涛, 刘俊熙, 孙泓, 李楠, 李育强, 黄冀东 申请人:北京知蜂堂蜂产品有限公司