专利名称：蜂胶水溶液的制备工艺及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药剂制备工艺，尤其是涉及一种不含有机溶剂的蜂胶水溶液的制备工艺以及在降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节药物制备中的应用。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂，再混以蜜蜂的舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质。据文献报导，蜂胶具有广泛的药理作用，其中包括抗肿瘤、抗病原微生物、护肝、免疫调节、抗氧化、改善心血管、消炎抗变态反应、抗辐射、抗溃疡、降血脂、降血糖等作用，国内外已有许多以蜂胶为原料的保健食品。
蜂胶的基本成份为树脂类、蜂蜡、花粉等。从化合物来讲，主要有类黄酮化合物、有机酸类的化合物、酯、醛、醇类化合物以及烯、烃、萜类化合物等。蜂胶的水溶性很差，目前通常采用有机溶剂和乳化剂来制备蜂胶溶液，如乙醇、聚乙二醇、氯仿、乙酸乙脂、二氯甲烷、甘油等溶解或通过吐温-80、甘油酯、大豆磷脂、卵磷酯等乳化，在这些化学物质中，除乙醇外其它物质均非人们常用物质，通常情况采用下，以乙醇作为溶剂制备的蜂胶乙醇水溶液有一种难以接受的刺激味道，从而限制其应用。采用乳化剂乳化后再加入甘油、油稀释制备蜂胶溶液时，这些有机溶剂的加入增加了毒副作用和产品成本，国家对这些物质的应用均有严格的规定和限制，因此制备不合有机溶剂的绿色蜂胶水溶液是当前迫切需要解决的问题。
公开号为CN1460512A的发明专利申请公开了一种水溶性蜂胶液及其制备方法，该水溶性蜂胶系将经乙醇初提并脱铅除杂的原料蜂胶加入到聚乙二醇的水溶液中，加热到80℃，并保持在此温度2-3小时后得到的。该发明采用聚乙二醇作为溶剂来制备水溶性蜂胶液，作为保健食品长期食用同样存在着毒副作用和生产成本增加。
发明内容
本发明提供了一种蜂胶水溶液的制备工艺，该工艺采用醇溶水提法进行，工艺简单、黄酮含量高，不合有机溶剂或添加剂，制备成本低，生物学效应好。
本发明还提供了上述蜂胶水溶液在制备降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节制品中的应用，其应用前景广阔。
一种蜂胶水溶液制备工艺，包括(1)将蜂胶加入95％乙醇中，充分搅拌使其溶解后边搅拌边缓慢加入到50-100℃热水中温浴，得蜂胶-乙醇-水混合液，混合液中乙醇含量为20％-60％，冷却至室温、静置，过滤；滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液；(2)将上述过程中的滤渣和沉渣再加入95％乙醇中，充分搅拌使其溶解后边搅拌边缓慢加入到50-100℃热水中温浴，得蜂胶-乙醇-水混合液，混合液中乙醇含量达到20％-60％，冷却至室温、静置，过滤；滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液；(3)重复上述醇溶水提过程，将获得的滤液合并，80℃浓缩或用水调至溶液相对密度为1.01-1.04，冷却、过滤，即得蜂胶水溶液。
所述的蜂胶-乙醇-水混合液乙醇含量为20％-60％。
所述的温浴温度为80℃。
所述的醇溶水提过程为2-4次。
所述的蜂胶水溶液在制备降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节制品中的应用。
本发明采用醇溶水提的方法制备蜂胶水溶液，解决了以前一直得不到不合有机溶剂的蜂胶水溶液的难题，通过该工艺提取的蜂胶水溶液其黄酮含量达8mg/ml以上，比单纯水浸提(1mg/ml)高7倍以上，在蜂胶水溶液成品中不含任何有机溶剂，生产工艺极其简单，成本低廉，无任何毒副作用，小鼠最大耐受量达120ml/kg，为人体推荐剂量(0.33ml/kg体重)的364倍。
将本发明工艺制备的蜂胶水溶液进行动物降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节等功效研究，结果表明该蜂胶水溶液具有明显的降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节等作用。
图1为本发明制备工艺流程图。
具体实施例方式
蜂胶水溶液制备①取纯蜂胶100g，加入5倍量95％食用乙醇，充分搅拌使其溶解。
②将上述醇溶蜂胶液边搅拌边缓慢加入到688ml80℃热水中，冷却至室温、静置2h，过滤。滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液(I)备用。
③将②中的滤渣和沉渣再加入95％乙醇500ml，充分搅拌使其溶解。
④将③中的醇溶蜂胶液边搅拌边缓慢加入到688ml80℃热水中，冷却至室温、静置2h，过滤。滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液(II)。
⑤将滤液(I)和滤液(II)合并，用蒸馏水加至1000ml或80℃浓缩至1000ml，即相对密度1.02，冷却、过滤，即得蜂胶水溶液。
具体试验1.不同浓度乙醇提取对蜂胶水溶液中黄酮量的影响①材料纯蜂胶，1kg/包，总黄酮20％，95％食用乙醇。
②总黄酮测定方法以芦丁为标准品，采用分光光度法。
将纯蜂胶溶于五倍量95％乙醇中，充分溶解后，将蜂胶醇溶液倒入80℃热水中，分别制成乙醇终浓度为0％(直接将蜂胶加入80℃热水中，温浸16h)，20％、40％、60％溶液，充分搅拌后，冷却至室温、静置2h，过滤。滤液回收乙醇至无醇味，80℃浓缩至0.1g生药/ml浓度，取样测定总黄酮(结果见表1)。
表1 不同浓度乙醇提取对黄酮量的影响
由表可见，40～60％乙醇提取的蜂胶水溶液中黄酮含量最高。
2.40％乙醇提取次数对蜂胶水溶液中黄酮量的影响取纯蜂胶加五倍量95％乙醇充分溶解后，倒入80℃热水中，使成40％乙醇终浓度，搅拌10分钟后，冷却至室温，过滤、滤液回收乙醇至无醇味，80℃浓缩或用水调至0.1g生药/ml浓度。沉渣及滤渣重新加五倍95％乙醇充分溶解后，重复上述步骤提取蜂胶水溶液，并将沉渣及滤渣再重复提取一次。然后将三次提取液合并，80℃浓缩至0.1g生药/ml，取样测定总黄酮(结果见表2)表2 40％乙醇提取次数对黄酮量的影响
由表可见，第1次和第2次提取液中总黄酮量明显高于第3次，而三次提取液合并浓缩后黄酮量有所增加，但浓度过高易出现较多沉淀，故浓缩时溶液相对密度为1.01-1.04为最适宜生产条件。
3.40％乙醇提取时间对蜂胶水溶液中黄酮量的影响蜂胶醇溶液制备方法同上，将含醇量为40％的蜂胶水溶液置80℃5分、10分、30分、60分钟及1h、2h、16h，各样品置室温冷却后，过滤，80℃浓缩或用水加至相同体积(浓度0.1g生药/ml)，摇匀，取样测总黄酮(结果见表3)。
表3 40％乙醇不同提取时间对黄酮量的影响
由表可见，80℃温浴10分至16h，蜂胶水溶液中黄酮量相近，因此将醇溶蜂胶液边搅拌边缓慢加入到80℃水中，搅拌后静置时间在10分以上即可。
4.不同温度对40％乙醇提取黄酮量的影响取纯蜂胶加五倍量95％乙醇充分溶解后，倒入50℃、80℃、100℃热水中，使成40％乙醇终浓度，搅拌10分钟后，冷却至室温，过滤、滤液回收乙醇至无醇味，80℃浓缩或用水调至0.1g生药/ml浓度。沉渣及滤渣重新加五倍95％乙醇充分溶解后，重复上述步骤提取蜂胶水溶液，各样品置室温冷却后，过滤，80℃浓缩或用水加至相同体积(浓度0.1g生药/ml)，摇匀，取样测总黄酮(结果见表4)。
表4 不同温度对40％乙醇提取黄酮量的影响
由表可见，50℃、80℃、100℃温浴10分，蜂胶水溶液中黄酮量随着温度的升高而增加，其中温度在80-100℃所得黄酮量相近，考虑到温度过高会影响到蜂胶中某些成分的活性，因此选用80℃温度作为最佳工艺条件。
本发明制备的蜂胶水溶液应用效果测试(一)、蜂胶水溶液降血糖作用的实验测试1.材料与条件 供试品蜂胶水溶液乳黄色液体，黄酮含量为8.5mg/ml，由本实验室制备；动物ICR小鼠，体重20～22g，雌雄各半，浙江省实验动物中心提供；四氧嘧啶Sigma公司生产，临用时配成6mg/ml；测试仪器采用721型分光光度计。
2.方法小鼠禁食24小时后，尾静脉注射四氧嘧啶溶液60mg/kg。4天后禁食15h，眼眶取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值，将造型动物血糖值高于10mmol/L高血糖模型小鼠随机分成四组，每组10只，设蜂胶水溶液高剂量组(30ml/kg)；中剂量组(20ml/kg)；低剂量组(10ml/kg)；蒸馏水对照组(20ml/kg)。各组动物均每日灌胃给药一次，连续30天。实验同时设不作任何处理的正常动物组。未次给药后各组动物禁食24h，眼眶取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。接着各组动物均经口灌胃葡萄糖2.0g/kg，测给葡萄糖后0、0.5、2小时的血糖值，以观察动物的糖耐量。通过蜂胶水溶液各组的血糖值与蒸馏水组血糖值比较，观察蜂胶水溶液的降糖作用。
3.结果(1)蜂胶水溶液对四氧嘧啶所致高血糖小鼠的降糖作用(见表5)表5蜂胶水溶液对四氧嘧啶所致小鼠血糖的影响(X±SD)
注*、***表示与水对照组比较P＜0.05、0.001。
由表5可见，造型小鼠的血糖值明显高于正常动物(P＜0.001)，显示造型成功，而蜂胶水溶液高剂量组血糖值与水对照组比较有无明显下降(P＜0.05)。表明蜂胶水溶液对小鼠高血糖有明显下降作用。
(2)蜂胶水溶液对高血糖模型小鼠耐糖量的影响(见表2)表6 蜂胶水溶液对高血糖模型小鼠耐糖量的影响(X±SD)
注*、***表示与水对照组比较P＜0.05、0.001。
由表6可见，正常动物组与水对照组各时段的血糖值均有明显差异(P＜0.001)，而蜂胶水溶液高剂量组与水对照组比较2h时段血糖值有明显下降(P＜0.05)。提示蜂胶水溶液对高血糖小鼠耐糖量有明显下降作用。
4.结论蜂胶水溶液对高血糖小鼠有降血糖作用。
(二)、蜂胶水溶液的抗炎作用的实验测试1.材料与条件 蜂胶水溶液乳黄色液体，黄酮含量为8.5mg/ml，由本实验室制备。动物ICR小鼠，雌雄兼用，体重20±2g，由浙江实验动物中心提供；药品与试剂乙酸(分析纯)，上海试剂一厂，用灭菌生理盐水配制成0.7％溶液。阿斯匹林，由宁波制药厂提供。伊文氏蓝，上海试剂采购供应站。
2、方法和结果2.1毛细血管通透性试验取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，设蜂胶水溶液高剂量组(30ml/kg)；中剂量组(20ml/kg)；低剂量组(10ml/kg)；阿斯匹林(0.2g/kg)阳性对照组和水对照组(20ml/kg)。各组动物每日灌胃1次，连续5天，于最后一次给药后30分钟尾静脉注射10％伊文氏蓝生理盐水溶液0.2ml/只，再腹腔注射0.7％乙酸1ml/只，30分钟后取腹腔液于620nm处测光密度(721分光光度计)，以腹腔上清液光密度值作组间统计学处理，比较组间差异，结果见表7。
表7 蜂胶水溶液的抗炎作用(毛细血管通透性试验)
注P值表示与水对照组比较由表1可见，蜂胶水溶液三个剂量组的光密度均低于水对照组，其中高剂量组与水对照组比较有明显差异(P＜0.05)，表明蜂胶水溶液可明显抑制毛细血管通透性的增加，对炎症渗出有较好的抑制作用。
2.2小鼠耳肿胀试验取小鼠50只，随机分成5组，每组10只，组别及给药剂量同上。各组动物每日灌胃1次，连续5天，于最后一次给药后30分钟，取二甲苯20ul滴涂于左耳，15分钟后将动物脱颈处死，以打孔器将小鼠双耳同部位等面积切下，电子天平(BS210S型)称重，以左耳重量与右耳重量之差为肿胀程度，比较各组差异，并求出肿胀抑制率(％)。结果见表8。
表8 蜂胶水溶液的抗炎作用(小鼠耳肿胀试验)(X±SD)
注*、**表示与水对照组比较P＜0.05、0.01由表8可见，蜂胶水溶液各组对二甲苯致炎引起的耳肿胀均有抑制作用，肿胀抑制率为11.4～45.5％，其中高剂量组(30ml/kg)与水对照组比较有明显差异(P＜0.05)，表明蜂胶水溶液可明显抑制炎症引起的肿胀。
3、结论通过以上试验表明，蜂胶水溶液高剂量组对小鼠毛细血管通透性和小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用(P＜0.05)，表明蜂胶水溶液有较好的抗炎和消肿作用。
(三)蜂胶水溶液对免疫功能影响的实验测试1.材料与条件 供试品蜂胶水溶液乳黄色液体，黄酮含量为8.5mg/ml，由本实验室制备。动物ICR小鼠，体重17-20g，雌雄兼用，浙江省实验动物中心提供。绵羊红细胞自采，保存在Alsever溶液中，临用前生理盐水洗涤3次，配制成所需浓度。试剂刀豆蛋白素(ConA)由Sigma公司产，分装成1mg/ml，-20℃存放；RPMI-1640完全培养液日本产，每1000ml含Hepes 25mM，谷氨酰胺2mM，2-ME 50μM，小牛血清10％，青霉素100μ/ml，链霉素100μ/ml；氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)中国科学院上海原子核研究所产，浓度1mCi/ml，比度42Ci/mM；闪烁液PPO 4克、POPOP 0.4克(上海试剂一厂产)用甲苯加至1000ml，40℃水浴过夜，暗室保存备用。
2.方法取小鼠40只，随机分为4组，每组10只，设蜂胶水溶液高剂量组(30ml/kg)；中剂量组(20ml/kg)；低剂量组(10ml/kg)和水对照组(20ml/kg)。并分别编号称重，各组动物每日灌胃给药一次，连续12天，于实验第8天腹腔注射3∶5(v/v)绵羊红细胞0.2ml致敏。停药次日各组小鼠摘眼球取血，收集血清，用比色法进行溶血素测定，然后颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾脏，用1640培养液制成1×107/ml细胞悬液，采用ConA诱导的MTT掺入法检测T淋转功能]。
3.结果(见表9)表9 蜂胶水溶液对正常小鼠免疫功能的影响(X±SD)
注*表示与水对照组比较P＜0.05。
由表1可见，蜂胶水溶液三个剂量组与水对照组比较血清溶血素含量均有明显升高，其中高剂量组蜂胶水溶液与水对照组比较有显著差异(P＜0.05＝。而蜂胶水溶液三个剂量组对正常小鼠T淋巴细胞转化功能无明显影响(P＞0.05)。
4.结论蜂胶水溶液有明显提高体液免疫功能的作用，而对细胞免疫功能无明显的影响。
(四)蜂胶水溶液的降血脂作用实验测试1.材料与条件 供试品蜂胶水溶液乳黄色液体，黄酮含量为8.5mg/ml，由本实验室制备。动物SD大鼠，体重200-250g，雌雄兼用，由浙江省实验动物中心提供。测试仪器721型分光光度计，胆固醇(TC)；甘油三脂(TG)测定试剂盒，均由宁波慈城生化试剂厂生产。
大鼠高脂饲料制备高脂饲料配方 胆固醇1.5％，猪油10％，甲基硫氧嘧啶0.2％，基础饲料88.3％。先将胆固醇和甲基硫氧嘧啶混匀后，加入到熔化的猪油中，再与基础饲料混匀后备用。
2.方法取SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，设第一组，蜂胶水溶液高剂量组(30ml/kg)；第二组，蜂胶水溶液中剂量组(20ml/kg)；第三组，蜂胶水溶液低剂量组(10ml/kg)；第四组，模型组(20ml/kg)；第五组，正常组。除第五组喂基础饲料外其余各组分别喂高脂饲料，同时灌胃相应药物。每日一次，连续30天。未次给药后各组动物禁食16h，股动脉取血，分离血清按TC、TG测定试剂盒说明测TC、TG含量，结果见表10。
3.检验结果(见表10)表10、蜂胶水溶液对实验性高脂血症大鼠的降血脂作用(X±SD)
注*、***表示与水对照组比较P＜0.05、0.001。
由表10可见隈高脂饲料大鼠TC、TG明显高于正常大鼠(P＜0.001)，显示造型成功，而喂高脂饲料大鼠同时给予蜂胶水溶液可降低血清中TC、TG含量，其中蜂胶水溶液高剂量组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。
4.结论表明蜂胶水溶液对实验性高脂血症大鼠的血脂有明显的下降作用。
(五)蜂胶水溶液急性毒性试验对蜂胶水溶液进行急性毒性试验，即半数致死量(LD50)的测定、最大耐受量(MTD)的测定。受试药物蜂胶水溶液，蜂胶水溶液乳白色液体，黄酮含量为8.5mg/ml，由本实验室制备。实验动物ICR种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，浙江省中医药研究院实验动物室提供。实验方法蜂胶水溶液以最大容积的剂量一次性灌胃给药40ml/kg，观察5天，30只小鼠均无死亡。故此无法测出LD50，改为最大耐受量测定。
最大耐受量测定取小鼠30只，雌雄各半，禁食12小时后，灌胃给蜂胶水溶液，一日三次，总剂量为120ml/kg，连续观察7天小鼠的活动和死亡情况。
实验结果灌胃给药后小鼠无异常反应，7天内小鼠均无死亡，经计算小鼠最大耐受量为120ml/kg，为人体推荐食用量(0.33ml/kg)的364倍。
权利要求
1.一种蜂胶水溶液制备工艺，包括(1)将蜂胶加入95％乙醇中，充分搅拌使其溶解后边搅拌边缓慢加入到50-100℃热水中，得蜂胶-乙醇-水混合液，混合液中乙醇含量为20％-60％，冷却至室温、静置，过滤；滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液；(2)将上述过程中的滤渣和沉渣再加入95％乙醇中，充分搅拌使其溶解后边搅拌边缓慢加入到50-100℃热水中，得蜂胶-乙醇-水混合液，混合液中乙醇含量达到20％-60％，冷却至室温、静置，过滤；滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液；(3)重复上述醇溶水提过程若干次，将获得的滤液合并，80℃浓缩或用水调至溶液相对密度为1.01-1.04，冷却、过滤，即得蜂胶水溶液。
2.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液制备工艺，其特征在于所述的蜂胶-乙醇-水混合液中乙醇含量为40％-60％。
3.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液制备工艺，其特征在于所述的醇溶水提过程为2-4次。
4.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液制备工艺，其特征在于所述的温浴温度为80℃。
5.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液在制备降血糖制品中的应用。
6.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液在制备降血脂制品中的应用。
7.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液在制备抗炎制品中的应用。
8.根据权利要求1所述的蜂胶水溶液在制备免疫调节制品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种蜂胶水溶液的制备工艺，包括将蜂胶加入95％乙醇中，充分搅拌使其溶解后边搅拌边缓慢加入到50－100℃热水中温浴，得蜂胶－乙醇－水混合液，混合液中乙醇含量为20％－60％，冷却至室温、静置，过滤；滤液回收乙醇至无醇味，过滤，得滤液；将滤渣和沉渣重复上述醇溶水提过程，获得的滤液合并，80℃浓缩或用水调至相对密度1.01－1.04，冷却、过滤，即得蜂胶水溶液。该工艺采用醇溶水提法进行，工艺简单、黄酮含量高，不含有机溶剂或添加剂，制备成本低，生物学效应好。本发明还提供了上述蜂胶水溶液在制备降血糖、降血脂、抗炎、免疫调节制品中的应用，其应用前景广阔。
文档编号A61P3/00GK1682770SQ20051004932
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月10日 优先权日2005年3月10日
发明者杨锋, 戴海关 申请人:浙江省中医药研究院