专利名称：磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体及构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，主要涉及磷酸受纳蛋白(受磷蛋白，磷酸兰苯，phospholamban)基因反义RNA重组腺相关病毒载体(rAAV-asPLB，rAAV-asPLN，rAAV-asPL)及构建，以及在制备心血管疾病、糖尿病心肌病以及钙调节异常等疾病药物中的应用。
背景技术：
随着人类基因组计划的开展和分子生物学研究的逐步深入，众多疾病的分子机制的阐明和致病基因不断发现，基因治疗已经从单基因遗传性疾病的治疗发展到多基因常见多发病的治疗，尤其在心脑血管疾病及各种肿瘤的治疗中展现出良好应用前景。基因治疗中的三个关键问题为1、人类疾病病因和致病机理的进一步明确，尤其是从分子机制角度来研究并提出有效的基因治疗方案。2、基因治疗及相应的治疗策略的优化和合理配伍，以提高整体上对疾病的治疗效果。3、安全、高效、稳定的基因表达系统即理想的载体的构建和应用。据此，合理的基因治疗方案必须具备三个要素目的基因、靶细胞以及基因传递的方法。选择合适的靶基因、合适的载体以及合适的治疗策略是基因治疗研究中的热点和难点。
心脏收缩和舒张障碍的一个主要原因是由于心肌细胞的兴奋-收缩偶联的异常。钙离子(Calcium，Ca2+)是心肌兴奋-收缩偶联的关键因子，在胞浆钙浓度的调节中，肌浆网Ca2+-ATPase发挥主要作用，而其功能主要受磷酸受纳蛋白(phospholamban，PLB)的调节。心肌收缩时心肌细胞内Ca2+离子浓度会明显影响心肌细胞的收缩能力，增加Ca2+浓度会产生心肌的正性肌力作用。
心肌细胞的收缩时肌浆内质网Ca2+离子释放通道开放，使Ca2+由肌浆内质网进入胞浆中，而舒张时肌浆内质网上的Ca2+-ATPase将钙重新摄取。心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase活性影响了细胞对钙的调控，而肌浆网Ca2+-ATPase的活性受肌浆网磷酸受纳蛋白(phospholamban，PLB)的调节。在非磷酸化状态下，PLB抑制肌浆网Ca2+-ATPase；cAMP依赖性蛋白激酶和钙调蛋白依赖性蛋白激酶则使PLB磷酸化而活化肌浆网Ca2+-ATPase。减少PLB的表达可以减少对肌浆网Ca2+-ATPase的抑制作用，从而增加心肌的收缩和舒张，改善心功能。采用PLB的反义核酸或其突变体的高表达可提高肌浆网Ca2+-ATPase的活性。在扩张性心肌病鼠模型中，敲除该基因可成功预防心功能异常。最近的研究中发现在转基因模型中，随着靶点磷酸栏板PLB的剔除，严重心力衰竭的发展会完全停止。对PLB基因的深入研究，有望为心功能障碍、钙调节异常等疾病的基因治疗提供新的靶基因。
基因治疗是将基因转移到体细胞以治疗和预防疾病的治疗方法。基因治疗的策略主要有以下几种①基因替换用正常功能基因替代原有突变的异常基因；②基因纠正用外源正常基因改变基因突变的缺失部分，并保持基因的正常功能；③基因增强导入外源正常基因，调节原有基因表达水平的不足；④基因抑制转入反义核酸，抑制变异的表达。
反义RNA技术是调节基因表达的一种常用手段，称之为基因封条(geneblocker)。其原理是通过基因重组，构建人工表达载体，基因载体在离体或体内所转录的反义RNA能通过碱基互补与目标RNA特异结合，影响其转录后加工，或阻止核蛋白体在目标mRNA上的移动，导致目标蛋白翻译异常；而且反义RNA与目标RNA结合后会激活内源性RNA酶，导致目标RNA降解；应用覆盖mRNA 5’端的反义RNA可以有效抑制特定基因的表达和功能，从而影响细胞和机体功能。因而，反义RNA技术作为一种基因治疗的手段，具有重要的理论和现实意义。
成功的基因治疗需要安全高效、稳定、持久的转基因载体。非病毒载体所具有安全性高、容量大和易制备等优点可能较病毒载体具有更好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。腺病毒相关病毒(AAV)属于微小病毒科依赖病毒属，是一种对人和动物不致病的单链DNA病毒。将AAV病毒自身的编码基因去除，仅保留基因组两末端的反向末端重复序列(ITR)，使其能装载治疗基因及表达元件而产生重组AAV病毒(rAAV)。AAV病毒可感染多种组织细胞，能稳定的表达外源基因。AAV载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。传统制备重组AAV是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。寻找新的、更安全的制备方法可以使AAV载体进一步推广应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供磷酸受纳蛋白(受磷蛋白，磷酸兰苯，phospholamban)基因反义RNA重组腺相关病毒载体(rAAV-asPLB，rAAV-asPLN，rAAV-asPL)，是一种重组腺相关病毒，SEQ ID NO1是编码上述蛋白质的DNA的核苷酸序列。
本发明的rAAV-asPLB最重要特征在于，是以PLB为靶基因，用重组腺相关病毒作为PLB基因的载体，并且包装(制备)过程中全部使用质粒，避免了传统方法中的腺病毒污染。本发明的靶基因PLB是存在于肌浆网上的调节蛋白，通过控制心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase来调节胞浆内钙浓度，减少PLB的表达可以减少对肌浆网Ca2+-ATPase的抑制作用，从而增加心肌的收缩和舒张，改善心功能。本发明扩增出PLB的基因片断，反向插入腺相关病毒骨架质粒中，与辅助质粒共转染工程细胞(293细胞)，包装(制备)出重组腺相关病毒rAAV-asPLB。重组腺相关病毒载体克服了非病毒载体的低转染效率，也克服了重组腺病毒的免疫原性、表达时间短等缺点，具有高转染效率、安全和持久表达等优势。并且本发明生产过程中全部使用质粒，避免了传统工艺中的腺病毒的污染问题，生物安全性更高。
本发明的rAAV-asPLB滴度较高，本发明把PLB的基因片断反向插入腺相关病毒骨架质粒中，构建pAAV-asPLB，然后将其和质粒pAAV-RC和pHelpe共转染转染工程细胞(293细胞)，收集包装(制备)成功的重组腺相关病毒rAAV-asPLB，进行纯化后，其滴度可以达到3×1013IU/L。
本发明的rAAV-asPLB不仅可以应用于在体外培养的心肌细胞，而且能够在大鼠等动物整体内有作用；同时，给药途径可以采用直接心肌注射，也可以静脉给药和经冠状动脉给药。
本发明的药效实验表明，rAAV-asPLB可以有效的转染心肌细胞和组织，抑制PLB的mRNA和蛋白表达；降低胞浆Ca2+离子浓度，减轻钙超负荷；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高心功能。按照病毒与细胞比值(MOI)为10、50、100、200加入重组腺相关病毒，感染培养的大鼠心肌细胞。PLB基因的mRNA和蛋白水平可以分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法来检测。结果显示MOI为10、50、100时，心肌细胞PLB的mRNA和蛋白水平随着剂量增长而下降，而MOI为200时，PLB的mRNA和蛋白水平与MOI为100时无明显差别。药效实验结果说明rAAV-asPLB可以有效抑制PLB的mRNA和蛋白表达，MOI为100是其对心肌细胞的最有效剂量。
本发明的毒性实验表明，rAAV-asPLB不影响心肌细胞的活力和增殖，安全性好。MTT(甲基噻唑基四唑)可以被活细胞的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色结晶，溶于有机溶剂后，可用比色法测定其吸光度值，从而简便、准确和安全地测定细胞的活力和增殖情况。按照病毒与细胞比值(MOI)为10、50、100、200加入重组腺相关病毒，感染培养的大鼠心肌细胞。采用MTT比色法检测重组病毒对心肌细胞的活力和增殖的影响，结果显示感染各个剂量的心肌细胞与正常心肌细胞的吸光度值无明显变化。药效实验结果说明rAAV-asPLB对心肌细胞的活力和增殖无明显影响，可以安全地作为基因治疗药物感染心肌细胞。
本发明的另一目的是提供磷酸受纳蛋白(受磷蛋白，磷酸兰苯，phospholamban)基因反义RNA重组腺相关病毒载体的制备方法，主要通过以下步骤实现(1)PLB基因片断的扩增；(2)反义PLB重组质粒载体(pAAV-asPLB)的构建和鉴定；(3)腺相关病毒载体rAAV-asPLB的包装(生产)；(4)腺相关病毒载体rAAV-asPLB的收集、纯化、鉴定和滴度测定。
步骤(1)中所说的PLB基因扩增，主要是通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。提取Wistar大鼠心肌中提取RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录为cDNA。设计带有BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)酶切位点的PCR引物，5’端引物序列为5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACTTCA-3’，3’端引物序列为5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’(小写字母为酶切位点)。以下述条件进行PCR反应94℃预变性5min，然后94°变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸min，共30个循环。
步骤(2)中，本发明采用质粒辅助AAV重组系统，主要包括腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS、携带腺相关病毒rep-cap基因的质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper。将步骤(1)的PLB基因PCR产物(695bp)、pAAV-MCS质粒分别经EcoRI和BamHI双酶切后，经T4 DNA连接酶4℃连接过夜；连接产物转化进入感受态菌XL10-Gold，用含氨苄青霉素的LB固态培养基筛选；挑取单克隆，抽提质粒pAAV-asPLB，酶切和测序鉴定插入方向和序列的正确性。
步骤(3)是本发明的基因药物包装(制备)流程的主要部分，以TE缓冲液(pH 7.5)溶解质粒pAAV-asPLB、pAAV-RC和pHelper，然后分别吸取10μg，用磷酸钙共沉淀法转染工程细胞(293细胞)，同时设立重组病毒的阳性对照、阴性对照以及空白对照。293细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％CO2的培养箱中培养，转染6小时后换新鲜培养液，继续培养66～72小时，期间观察培养基颜色变化和293细胞病变情况。若用于包装(制备)rAAV-asPLB和阳性对照的293细胞48小时出现细胞变圆、脱壁等细胞病变，并且培养基逐渐变为橙黄色；同时阴性对照、空白对照的293细胞和培养基没有明显变化，说明有重组病毒产生。
步骤(4)是本基因药物的收集、优化部分。收集步骤(3)的病变细胞，反复冻融4次，离心，即可获得重组腺相关病毒；但是若要提高本发明基因药物的纯度和滴度，可以作进一步的纯化；然后以PCR法作rAAV-asPLB的鉴定和滴度测定取部分纯化后的病毒液进行10倍稀释，Dnase I 37℃30min灭活病毒外基因组DNA，56℃15min后，加等体积2×蛋白酶K，37℃反应1h，酚氯仿抽提后溶于10μl纯水中；然后以此为模板作PCR进行鉴定和滴度测定。
常规制备重组AAV是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。本发明的重组病毒构建方法与常规的方法比较，其显著优点是构建原料都是安全的质粒。用带有辅助作用的质粒代替常规的腺病毒，可以完全避免构建过程中的病毒污染，生物安全性更高。
本发明的再一目的是提供磷酸受纳蛋白(受磷蛋白，磷酸兰苯，phospholamban)基因反义RNA重组腺相关病毒载体在制备治疗心功能不全的基因药物中的应用。
rAAV-asPLB在体外培养的心肌细胞的应用将乳鼠心室肌剪碎，胰酶重复消化，过滤，离心后收集细胞，除去贴壁细胞。将细胞调整至1×106/ml接种于6孔板中培养。按照病毒与细胞比值(MOI)为100加入重组病毒，感染培养的大鼠心肌细胞。
rAAV-asPLB在实验性糖尿病大鼠中的应用大鼠称重后，腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液，制作成功的糖尿病大鼠洁级环境饲养6周后，全身麻醉，气管插管，打开胸腔，暴露心脏。吸取重组病毒100μL(约1×109IU)于心尖和左心室壁各注射重组病毒50μL。关闭胸腔，清洁级环境普通饲料饲养。
rAAV-asPLB在冠状动脉结扎的急性心肌梗死大鼠中的应用大鼠全身麻醉，气管插管，打开胸腔，暴露心脏，结扎冠状动脉的左前降支，造成心肌梗死。吸取重组病毒100μL(约1×109IU)在梗死区周围注射重组病毒。关胸，清洁级饲养。
rAAV-asPLB除了应用于基因治疗外，还能够用于与钙离子相关的研究，例如与激光共聚焦显微镜技术结合研究细胞胞浆Ca2+的变化；与western blot方法和比色法结合来研究肌浆网Ca2+-ATPase的蛋白水平和活性变化。
本发明提供的磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体的有益效果在于1.本发明rAAV-asPLB所用载体AAV是一种安全的病毒，大多数人曾受到过其感染，但从未发现它能引起任何疾病；由于在构建载体时去掉了AAV病毒本身的基因，就避免了病毒带来的免疫反应等副作用。包装(制备)过程中所涉及的质粒等均为药理学可接受材料，安全无毒；2.本发明rAAV-asPLB能够感染多种类型的细胞以及分化和不分化细胞，可以应用于体外的培养细胞，也可以用于整体实验动物或者患者，应用范围广，感染效率高；3.本发明rAAV-asPLB用药途径可以直接注射给药，可以经静脉给药，也可以经冠状动脉给药；可以使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达；4.本发明rAAV-asPLB可应用于心血管疾病、糖尿病心肌病以及钙调节异常等疾病的基因治疗，也可应用于钙调蛋白改变的病理生理机制相关研究，适应证广泛；5.本发明rAAV-asPLB可以有效抑制靶基因PLB的mRNA转录和蛋白翻译；降低胞浆Ca2+离子浓度，减轻钙超负荷；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高心功能。同时对心肌细胞的活力和增殖无影响。
6.本发明rAAV-asPLB设备要求不高，AAV载体的理化性质稳定，在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似，适合推广应用。
图1反义PLB重组质粒(pAAV-asPLB)琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2反义PLB重组质粒(pAAV-asPLB)测序鉴定图。
图3重组病毒rAAV-asPLB抑制培养的乳鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录。
图4重组病毒rAAV-asPLB抑制培养的乳鼠心肌细胞PLB基因蛋白表达。
图5重组病毒rAAV-asPLB抑制糖尿病大鼠心肌PLB基因mRNA转录。
图6重组病毒rAAV-asPLB抑制糖尿病大鼠心肌PLB基因蛋白表达。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。通过下列实施例对本发明的技术特征做详细的描述，但不限制本发明。
实施例1基因药物rAAV-asPLB的构建根据PLB基因序列和质粒pAAV-MCS结构，设计带有BamHI和EcoRI酶切位点(下文序列中的小写字母)的PLB基因引物，PCR反应的上游引物序列为5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACTTCA-3’，下游引物序列为5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’。经过PCR反应扩增PLB cDNA片断(695bp)，连接到质粒pAAV-MCS中，构建质粒pAAV-asPLB质粒，酶切和测序鉴定插入方向和序列正确性。吸取质粒pAAV-asPLB、pAAV-RC和pHelper各10μg，用磷酸钙共沉淀法转染293细胞构建重组PLB基因反义RNA腺相关病毒载体(rAAV-asPLB)；同时设立阳性对照，即pAAV-LacZ、pAAV-RC和pHelper各10μg共转染293细胞构建重组LacZ病毒组(rAAV-LacZ)。收获和纯化重组病毒，测定滴度，参见图1、图2。图1为RT-PCR扩增PLB基因片断和pAAV-asPLB酶切鉴定图，其中1pUCMix Marker；2PLB基因片断PCR产物(695bp)；3重组质粒pAAV-asPLB/EcoR I+BamH I；4Marker。图2为pAAV-asPLB测序鉴定，上图正向测序；下图反向测序；画线处分别为EcoR I、BamH I酶切位点。
实施例2重组病毒rAAV-asPLB在培养的乳鼠心肌细胞中的应用取1-3日龄大鼠心室肌，剪成1mm3左右的小块，0.125％胰酶重复消化，200目钢网过滤，1000rpm离心5min收集细胞，5％CO2细胞培养箱中37℃培养1小时，除去贴壁细胞。将细胞调整至1×106/ml接种于6孔板中培养。按照病毒与细胞比值(MOI)为100加入重组病毒，感染培养的大鼠心肌细胞。结果显示重组病毒rAAV-asPLB抑制培养的乳鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；降低胞浆Ca2+离子浓度，减轻钙超负荷，参见图4、图5。图4为RT-PCR检测心肌细胞感染重组病毒后PLB mRNA的转录，其中MpUC MixMarker；1重组病毒rAAV-asPLB感染的心肌细胞；2空病毒载体感染的对照组细胞；3正常心肌细胞。图5为Western-blot检测心肌细胞感染重组病毒后PLB蛋白的表达，其中1重组病毒rAAV-asPLB感染的心肌细胞；2空病毒载体感染的对照组细胞；3正常心肌细胞。
实施例3重组病毒rAAV-asPLB用于研究糖尿病大鼠钙调节蛋白的量和活性的变化大鼠称重后，按照剂量65mg/kg腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液，制作成功的糖尿病大鼠洁级环境饲养6周后，水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏。吸取重组病毒100μL(约1×109IU)于心尖和左心室壁各注射重组病毒50μL。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后，清洁级环境普通饲料饲养。结果显示重组病毒rAAV-asPLB抑制糖尿病大鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；对肌浆网Ca2+-ATPase的量(mRNA转录和蛋白翻译)无明显影响；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性，参见图6、图7。图6为RT-PCR检测糖尿病大鼠各组PLB mRNA表达水平，其中MMarker；normal正常大鼠；DM未作治疗的糖尿病大鼠；DM-saline injection注射生理盐水作为对照的糖尿病大鼠；DM-rAAV-asPLB injection注射rAAV-asPLB的糖尿病大鼠。图7 Weatern-blot检测各组PLB蛋白表达水平，其中MMarker；normal正常大鼠；DM未作治疗的糖尿病大鼠；DM-saline injection注射生理盐水作为对照的糖尿病大鼠；DM-rAAV-asPLB，injection注射rAAV-asPLB的糖尿病大鼠。
实施例4重组病毒rAAV-asPLB用于糖尿病大鼠基因治疗按照实施例3中的方法复制成功糖尿病大鼠模型，心肌注射rAAV-asPLB，同时设立生理盐水注射组作为对照。基因治疗6周后，大鼠经腹腔注射10％水合氯醛(400mg/kg)全身麻醉，取仰卧位，分离右颈总动脉，插入动脉留置管，100u/mL肝素盐水抗凝。留置管前端进入左心室后，后端连接压力传感器，用多导生理MedLab数据记录系统测量左室收缩压(LVSP)，左室舒张末期压(LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt)。血流状态稳定后，将异丙肾上腺素(ISO)按照剂量0.2mg/kg腹腔注射，再记录上述指标。结果表明rAAV-asPLB能提高糖尿病大鼠的左心室收缩和舒张能力，改善心功能。详见下表1。
表1 异丙肾上腺素刺激后各组血流动力学变化
注*P＜0.05 vs normal control group-ISO。
实施例5rAAV-asPLB在冠状动脉结扎的急性心肌梗死大鼠中的应用大鼠称重后，腹腔注射10％水合氯醛(400mg/kg)全身麻醉，气管插管，打开胸腔，暴露心脏，结扎冠状动脉的左前降支，造成急性心肌梗死。吸取重组病毒100μL(约1×109IU)在梗死区周围注射重组病毒。关闭胸腔，清洁级饲养。6周后检测心肌PLB的mRNA转录和蛋白表达水平；测定心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性；测量左室收缩压(LVSP)，左室舒张末期压(LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt)。结果显示rAAV-asPLB可以抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞PLB基因mRNA转录和蛋白翻译；增强肌浆网Ca2+-ATPase活性；提高左心室收缩和舒张能力，改善心功能。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体，是指受磷蛋白，磷酸兰苯基因反义RNA重组腺相关病毒载体，rAAV-asPLB，rAAV-asPLN，rAAV-asPL，SEQID NO1为是编码上述蛋白质的DNA的核苷酸序列。
2.磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体的构建方法，主要通过以下步骤实现(1)PLB基因片断的扩增，(2)反义PLB重组质粒载体pAAV-asPLB的构建和鉴定，(3)腺相关病毒载体rAAV-asPLB的制备，(4)腺相关病毒载体rAAV-asPLB的收集、纯化、鉴定和滴度测定。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(1)中所说的PLB基因扩增，是通过逆转录-聚合酶链反应的方法，提取Wistar大鼠心肌中提取RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录为cDNA，设计带有5’端BamHI和3’端EcoRI酶切位点的PCR引物，5’端引物序列为5’-cgggatccCGCAGCTGAGCTGAGCTCCCAGACT TCA-3’，3’端引物序列为5’-cggaattcTTTAAATTTCATTTATTCCCCAA-3’。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是进行PCR反应的条件为94℃预变性5分钟，然后94°变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸分钟，共30个循环。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)中，采用质粒辅助AAV重组系统，主要包括腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS、携带腺相关病毒rep-cap基因的质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper，将步骤(1)的PLB基因PCR产物长度695bp、pAAV-MCS质粒分别经EcoRI和BamHI双酶切后，经T4 DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化进入感受态菌XL10-Gold，用含氨苄青霉素的LB固态培养基筛选，挑取单克隆，抽提质粒pAAV-asPLB，酶切和测序鉴定插入方向和序列的正确性。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(3)以pH7.5的TE缓冲液溶解质粒pAAV-asPLB、pAAV-RC和pHelper，然后分别吸取10μg，用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，同时设立重组病毒的阳性对照、阴性对照以及空白对照，293细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％CO2的培养箱中培养，转染6小时后换新鲜培养液，继续培养66～72小时。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(4)是收集步骤(3)的病变细胞，反复冻融4次，离心，即可获得重组腺相关病毒，然后以PCR法作rAAV-asPLB的鉴定和滴度测定，取部分纯化后的病毒液进行10倍稀释，Dnase I 37℃ 30分钟灭活病毒外基因组DNA，56℃ 15分钟后，加等体积2×蛋白酶K，37℃反应1小时，酚氯仿抽提后溶于10μl纯水中，然后以此为模板作PCR进行鉴定和滴度测定。
8.磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体，在制备治疗心功能不全的基因药物中的应用。
9.磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体，在制备治疗糖尿病药物中的应用。
10.磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体，在制备治疗心肌梗死的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明提供磷酸受纳蛋白基因腺相关病毒载体及构建和应用，构建方法为(1)PLB基因片断的扩增，(2)反义PLB重组质粒载体pAAV－asPLB的构建和鉴定，(3)腺相关病毒载体rAAV－asPLB的制备，(4)腺相关病毒载体rAAV－asPLB的收集、纯化、鉴定和滴度测定。本发明构建载体时去掉了AAV病毒本身的基因，避免了病毒带来的免疫反应等副作用，所涉及的质粒等均为药理学可接受材料，安全无毒，应用范围广，感染效率高，使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达，可在制备治疗心功能不全、糖尿病的基因药物中的应用。
文档编号A61P3/10GK1673380SQ200510049238
公开日2005年9月28日 申请日期2005年1月26日 优先权日2005年1月26日
发明者胡申江, 李江 申请人:浙江大学