专利名称：同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的检测方法。
背景技术：
醋酸甲轻孕酮(medroxyprogesterone acetate, MPA)是一种孕激素类药物，在兽药中被作为促生长剂，广泛用于安情助长和同步发情等方面以促进动物生长、提高饲料转化率、节省成本、提高经济效益，其对人具有广泛的毒副作用，能引起精神抑郁、过敏等不良反应，甚至引起乳腺癌和不孕不育症。欧盟成员国早已明令严禁在食源性动物饲养管理中使用，我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定醋酸甲羟孕酮为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。己烯雌酹(diethylstilbestrol,DES)是一种非留体激素，曾被广泛用于促进动物生长、增加瘦肉率，其药物原形或代谢产物不可避免地残留于食品动物的器官、组织或通过排泄物进入外界环境，成为环境雌激素，具有导致畸胎、癌瘤等严重的毒负作用。美国食品药物管理局(The US Food and DrugAdministration,FDA)早在1979年就已禁止己烯雌酚用于动物催肥。1989年，欧盟对一切含有促生长激素的动物和动物性食品实施封关禁入。我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定该药为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。但是部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用DES的现象仍然存在。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种可同时检测水产品中MPA和DES的方法。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，也为进一步同时检测四个兽药残留指标奠定了基础。该方法的建立可满足水产品中甲孕酮和己烯雌酚检测快速、准确的要求，同时，为我国水产品兽药残留的日常监控提供一种新的适用方法。本发明提供了一种同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，所述方法具体步骤包括以下步骤:(I)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的人工抗原；(2)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的单克隆抗体并纯化；(3)利用步骤⑴得到的人工抗原分别偶联液相芯片荧光微球；(4)利用步骤(2)得到的单克隆抗体进行生物素化；(5)使用步骤(3)得到的偶联的微球以及步骤⑷得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留。所述的步骤(2)中，醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体的腹水效价为1: 2.56X 106。所述的步骤⑵中，己烯雌酚的单克隆抗体1F5的腹水效价为1: 3.2X 106。所述的步骤(2)中，己烯雌酚的杂交瘤2D8细胞腹水效价分别为1: 1.6X 106。
步骤(5)中，所述的检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留的步骤依次为:偶联有MPA和DES的微球加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，随后分别加入生物素化的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。步骤(5)中，包被好的微球一部分加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，另一部分加入系列醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL和 0.4ng/mL。所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminexversion2.1软件分析数据。检测醋酸甲羟孕酮的抗体稀释度为1: 3000。检测己烯雌酚的抗体稀释度为1: 6400。所述的SA-PE的稀释度为1: 100。具体而言，本发明的方法包括如下步骤:I，制备醋酸甲羟孕酮人工抗原；2，醋酸甲羟孕酮单克隆抗体的制备和纯化；3，制备己烯雌酚人工抗原；4，己烯雌酚单克隆抗体的制备和纯化；5，醋酸甲羟孕酮特异性单克隆抗体和己烯雌酚单克隆抗体的生物素化；6，分别制备耦联有醋酸甲羟孕酮抗原和己烯雌酚抗原的液相芯片荧光微球；7，建立同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的液相芯片法。步骤I中，所述醋酸甲羟孕酮抗原的制备方法具体为:将醋酸甲羟孕酮与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。步骤2中，所述的醋酸甲羟孕酮单克隆抗体的制备和纯化方法具体为:采用0_(羧甲基)羟胺法合成醋酸甲孕酮-3-(0-羧甲基)(MPS)半抗原。用二环己基碳化二亚胺偶联法将醋酸甲孕酮-3-(0-羧甲基)与BSA偶联合成人工完全免疫原。免疫小鼠，筛选获得杂交瘤细胞，收集小鼠腹水纯化，获得较纯的醋酸甲羟孕酮单克隆抗体。免疫和纯化的过程具体为:取BALB/C小鼠4只，首次免疫用MPA-BSA与等体积完全弗氏佐剂乳化后足垫注射，剂量为IOOug/只，以后每隔3周加强免疫I次，改用不完全弗氏佐剂依次在皮下、肌肉、腹腔多点注射，剂量为150ug/只。融合前3d强化免疫I次，小鼠尾静脉缓慢直接注射MPA-BSA 250ug/只。按常规方法进行细胞融合:将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌MPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。腹腔注射7周龄的BALB/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，IOd后腹腔接种用不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只分别注射2 X 106个细胞，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时,采集腹水,用硫酸铵沉淀法纯化腹水，并用DEAE纤维素层析柱纯化腹水后，得较纯的MPA单克隆抗体。醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体的腹水效价为1: 2.56X 106。步骤3中，所述的己烯雌酚人工抗原制备的具体方法为:将己烯雌酚与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。步骤4中，所述的己烯雌酚单克隆抗体的制备和纯化的具体方法为:对己烯雌酚分子进行修饰改造，合成己烯雌酚-单-羧基丙基-醚。利用活性酯法制备免疫原(DES-BSA)。免疫小鼠，筛选获得杂交瘤细胞，收集小鼠腹水纯化，获得较纯的己烯雌酚单克隆抗体。免疫和纯化的过程具体为:取6-8周龄健康Balb/c小鼠4只，首次免疫用DES-BSA与等体积完全弗氏佐剂乳化后足垫注射，剂量为IOOug/只，以后每隔3周加强免疫I次，改用不完全弗氏佐剂依次在皮下、肌肉、腹腔注射，剂量为150ug/只。采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法测定血清抗体的效价和特异性。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。取7周龄的Balb/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，7d后腹腔接种有不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每日观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，用12号针头采集腹水，离心取上清，用硫酸铵沉淀法纯化腹水后，再用DEAE纤维素层析柱纯化。己烯雌酚的单克隆抗体的腹水效价为1: 3.2X106。己烯雌酚的杂交瘤细胞腹水效价为 I: 1.6X106。步骤5中，所述的醋酸甲羟孕酮特异性单克隆抗体和己烯雌酚单克隆抗体的生物素化，具体为:分别取醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚单克隆抗体lmg，用45uL IOmMSulfo-NHS-Biotin进行溶解。室温下，搅拌反应4_5h，使抗体充分生物素化。接着用
0.lmol/L,pH7.4的PBS过YM-1O柱，置换缓冲液并除去未反应的小分子BNHS。小量分装各种生物素化抗体，_20°C冷冻保存。步骤6中，所述的制备耦联有醋酸甲羟孕酮抗原和己烯雌酚抗原的液相芯片荧光微球，是将醋酸甲羟孕酮抗原和己烯雌酚抗原分别与不同荧光编码的微球偶联。具体操作步骤为:将4°C保存的微球放置于室温20 30min，涡旋微球(2 3min为宜)，各吸取100 μ L荧光微球加入到2管1.5毫升的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400 μ L 0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。分别加入10 μ L 50mg/mLSulfo-NHS和10 μ L50mg/ml EDC,混匀后37°C作用20min。离心去上清，将微球用900 μ L
0.05Μ MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400 μ L 0.05Μ MES重悬微球，分别加入纯化的醋酸甲羟孕酮人工抗原和己烯雌酚人工抗原，混匀后37°C作用2 3h (期间，每隔15min涡旋混匀一次)。离心去上清，加入900 μ L PBS-TBN(含有0.05% Tween-20,0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.01MPBS)重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200 μ LPBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。步骤7中，所述的液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法包括样品前处理、将微球与样品孵育、加入SA-PE反应以及终止。所述前处理待测样品的步骤包括:匀浆好的组织加入乙酸乙酯和CaCl2 ;离心，移取上清，氮气吹干；残留物用正己烷溶解，再加入PBS-甲醇，离心；吸除上层正己烷，取下层溶液用于检测。具体步骤为:①样品前处理。准确称取已匀浆好的组织3.0g，加入9mL乙酸乙酯，然后加入
0.3CaCl2,最大速度震荡3min ;室温条件下,6000rpm离心5min ;移取6mL上清到另一新的试管，60-70°C水浴氮气吹干，残留物用2.0mL的正己烷溶解，残留物用2.0mL的正己烷溶解，再加入1.0mL的I XPBS-甲醇(3: 2, v/v),镟润振荡2min ;室温条件下，6000rpm离心IOmin,吸除上层正己烧,取50uL下层溶液用于检测。②偶联好的微球放置室温20 30min，涡旋微球(2 3min为宜)，于96孔培养板中分别加入25 μ L/孔配好的系列醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚标准溶液(25ng/mL，12.5ng/mL, 6.25ng/mL, 3.125ng/mL, 1.6ng/mL, 0.8ng/mL, 0.4ng/mL),在另外的微孔中加入处理好的样品溶液25 μ L，随后分别加入偶联有MPA和DES的微球各I μ L/2000个，以及生物素化的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚抗体各25 yL ;还在一孔中加入25 μ L洗涤液作空白对照，其余步骤同样品溶液的操作。37°C振荡作用60min。③加入稀释好的SA_PE，37°C振荡作用30min。④加入100 μ L终止液，通过Luminex 200仪器检测突光强度值(medianfluorescence intensity, MFI),并用 Luminex version 2.I 软件分析数据。样本的前处理方法可以按照常规方法进行，也可以按照如下方法操作:取已匀浆好的组织，加入乙酸乙酯和CaCl2 ;移取上清到另一新的试管，氮气吹干，残留物用正己烷溶解，再加入PBS-甲醇(3: 2, v/v);离心，去上清，取下层溶液用于检测。本发明提供了一种同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的液相芯片的方法。首先制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的人工抗原，同时，制备了醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚单克隆抗体并将之纯化。分别将醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚人工抗原耦联液相芯片荧光微球，分别将醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚单克隆抗体生物素化。根据间接竞争ELISA的原理，建立同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留的液相芯片法，并确定最佳试验条件。本发明方法可以同时检测醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚两种残留指标，整个反应可以在2小时内完成，其快速、敏感、特异和同步检测多个兽药残留的特点可以应用于水产品兽药残留的日常监控，其检测灵敏度为醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的最低检出限均为0.4ng/mL。上述同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的液相芯片方法使用了液相芯片技术，该技术使用了特定的荧光微球，这些微球以聚苯乙烯为基质，在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料(这两种染料各有10种不同区分)，从而可标记上100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100个不同微球的阵列。利用这100种微球，可以分别标记上100种不同的探针分子，不同微球上的探针分子与样品中需要检测的各种目标分子进行特异性结合，报告分子与目标分子特异性结合，即构成了液相芯片系统，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。与传统的检测诊断方法相比，液相芯片技术具有如下优点:①灵敏度高、特异性强、稳定性好、重复性好。液相芯片的灵敏度是常规的ELISA方法的灵敏度10 100倍；液相芯片的反应发生在准均相的液体环境中，在反应中液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性；检测系统中的两束激光同时分别检测微球分类荧光(特异性)和报告荧光(敏感性)，只有与分类荧光同时出现的报告荧光信号才被检测记录，更加提高了结果的特异性。液相芯片技术在对每个指标的检测中，在同一个反应体系中有其相对应的1000 5000颗相同的微球。检测时，抽取其中的100 500颗微球读数，最终的数据是取其所有值的中位数，这样可以把误差减到最小，从而使检测结果重复性好。②样本需要量小，成本相对较低。液相芯片技术的血清用量较ELISA法、化学发光法、电化学发光法要少得多。液相芯片中微球表面积大，单个微球可结合多达约(I 2) XlO6个目标分子，因此只需极少量样品即可同时进行多种成分检测，便于临床采样分析；同时试剂用量少，所需成本较低，可节约成本，减少人力消耗。③反应快速，耗时短。液相芯片技术的反应环境为液相，微球上固定的探针(或抗体)与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ELISA等反应模式可增加10倍以上，反应时间甚至可缩短到十几分钟，因此可提高反应速度。而且微球直径很小(约5 6 μ m)，容易混悬在液体中，为生物分子反应提供近似生理的液相环境，反应快速、充分、需时短。抗原-抗体等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经流式细胞检测系统判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，更节省了反应过程的时间。④高通量，可进行多元化分析，适用范围广。目前商业化微球采用双色荧光编码技术，可同时对100种目标分子进行检测。一次可以同时检测多种指标，这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃；通过对微球表面的修饰，微球表面可以包被抗体、抗原、细胞因子、蛋白质或核酸、配体、受体等各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要，可适用于各种分析研究；强大的软件分析系统和高通量检测系统，更方便快捷直观地获得更多信息。与现有技术相比，本发明可以同时检测MPA和DES并且可以根据需要进行灵活组合，联合检测，且操作简单，用时短，传统的高效色谱法和ELISA方法无法做到这点。利用该发明可以快速、廉价、准确地检测水产品中的兽药残留。
图1是液相芯片检测MPA的标准曲线。图2是液相芯片检测DES的标准曲线。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。实施例1制备醋酸甲羟孕酮人工抗原。将醋酸甲羟孕酮与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。实施例2醋酸甲羟孕酮单克隆抗体的制备和纯化采用0_(羧甲基)羟胺法合成醋酸甲孕酮-3-(0-羧甲基)(MPS)半抗原。用二环己基碳化二亚胺偶联法将醋酸甲孕酮-3-(0-羧甲基)与BSA偶联合成人工完全免疫原。取BALB/C小鼠4只，首次免疫用MPA-BSA与等体积完全弗氏佐剂乳化后足垫注射，剂量为IOOug/只，以后每隔3周加强免疫I次，改用不完全弗氏佐剂依次在皮下、肌肉、腹腔多点注射，剂量为150ug/只。融合前3d强化免疫I次，小鼠尾静脉缓慢直接注射MPA-BSA 250ug/只。按常规方法进行细胞融合:将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌MPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。腹腔注射 周龄的BALB/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，IOd后腹腔接种用不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只分别注射2 X IO6个细胞，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，采集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水，并用DEAE纤维素层析柱纯化腹水后，得较纯的MPA单克隆抗体。双夹心ELISA初步测定抗原效价及血清稀释度。实施例3己烯雌酚人工抗原制备将己烯雌酚与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。实施例4己烯雌酚单克隆抗体的制备和纯化对己烯雌酚分子进行修饰改造，合成己烯雌酚-单-羧基丙基-醚。利用活性酯法制备免疫原(DES-BSA)。取6-8周龄健康Balb/c小鼠4只，首次免疫用DES-BSA与等体积完全弗氏佐剂乳化后足垫注射，剂量为IOOug/只，以后每隔3周加强免疫I次，改用不完全弗氏佐剂依次在皮下、肌肉、腹腔注射，剂量为150ug/只。采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法测定血清抗体的效价和特异性。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。取7周龄的Balb/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，7d后腹腔接种有不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每日观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，用12号针头采集腹水，离心取上清，用硫酸铵沉淀法纯化腹水后，再用DEAE纤维素层析柱纯化。实施例5醋酸甲羟 孕酮特异性单克隆抗体和己烯雌酚单克隆抗体的生物素化分别取醋酸甲轻孕酮和己烯雌酹单克隆抗体Img,用45uL IOmMSulfo-NHS-Biotin进行溶解。室温下，搅拌反应4_5h，使抗体充分生物素化。接着用
0.lmol/L,pH7.4的PBS过YM-10柱，置换缓冲液并除去未反应的小分子BNHS。小量分装各种生物素化抗体，_20°C冷冻保存。实施例6制备耦联有醋酸甲羟孕酮抗原和己烯雌酚抗原的液相芯片微球将4°C保存的微球放置于室温20 30min，涡旋微球(2 3min为宜)，各吸取100 μ L荧光微球加入到2管1.5毫升的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400 μ L 0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。分别加入10 μ L 50mg/mLSulfo-NHS和10 μ L 50mg/ml EDC，混匀后37°C作用20min。离心去上清，将微球用900 μ L
0.05Μ MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400 μ L 0.05Μ MES重悬微球，分别加入纯化的醋酸甲羟孕酮人工抗原和己烯雌酚人工抗原，混匀后37°C作用2 3h (期间，每隔15min涡旋混匀一次)。离心去上清，加入900 μ L PBS-TBN(含有0.05% Tween-20,0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.0lM PBS)重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200 μ LPBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。实施例7样品前处理准确称取已匀浆好的组织3.0g，加入9mL乙酸乙酯，然后加入0.3 CaC12，最大速度震荡3min ;室温条件下,6000rpm离心5min ;移取6mL上清到另一新的试管,60_70°C水浴氮气吹干，残留物用2.0mL的正己烷溶解，残留物用2.0mL的正己烷溶解，再加入1.0mL的I XPBS-甲醇(3: 2, v/v),镟润振荡2min ;室温条件下,6000rpm离心IOmin,吸除上层正己烷，取50uL下层溶液用于检测。
实施例8液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚取偶联好的微球放置室温20 30min，涡旋微球(2 3min为宜)，于96孔培养板中分别加入25 μ L/孔配好的系列醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚标准溶液(25ng/mL，12.5ng/mL, 6.25ng/mL, 3.125ng/mL, 1.6ng/mL, 0.8ng/mL, 0.4ng/mL),在另外的微孔中加入处理好的样品溶液25 μ L，随后分别加入偶联有MPA和DES微球各I μ L/2000个，以及生物素化的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚抗体各25 μ L，还在一孔中加入25 μ L洗涤液作空白对照，其余步骤同样品溶液的操作。37°C振荡作用60min。加入稀释好的SA-PE，37°C振荡作用30min。加入100 μ L终止液,通过Luminex 200仪器检测突光强度值(median fluorescenceintensity, MFI),并用 Luminex version 2.1 软件分析数据。实施例9检测结果判定先计算两种标准样品的平均突光强度(median fluorescence intensity,MFI)为纵坐标，以MPA和DES的浓度的对数值分别做横坐标，做标准曲线。根据每个检测样品的MFI就可从标准曲线上读出其相对应的样品的浓度。再乘以相应的稀释倍数。1)标准曲线与灵敏度以MFI为纵坐标，MPA和DES标准溶液浓度的对数值为横坐标，绘制出标准曲线(图1)。从图1和图2可以看出，该方法绘制出的两种兽药残留液相芯片检测的Logistic回归标准曲线方程，曲线关系良好，决定系数R2 > 0.99。该方法的检测灵敏度为MPA 0.4ng/mL, DES 0.4ng/mL。2)精确度试验
以批内误差和批间误差来表示该方法的精确度。①批内误差:每一标准样品浓度作5次重复，以其批内变异系数表示批内误差。②批间误差:重复已建立的方法操作，连续作5次，以其批间变异系数表示批间误差。检测结果经SPSS检验，批内(见表I)和批间的结果都无显著性差异，重复性好。表I同一批标准品重复结果
权利要求
1.一种同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的人工抗原； (2)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的单克隆抗体并纯化； (3)利用步骤(I)得到的人工抗原分别偶联液相芯片荧光微球； (4)利用步骤(2)得到的单克隆抗体进行生物素化； (5)使用步骤(3)得到的偶联的微球以及步骤⑷得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留。
2.根据权利要求1所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体的腹水效价为1: 2.56X 106。
3.根据权利要求1所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，己烯雌酚的单克隆抗体的腹水效价为1: 3.2X106。
4.根据权利要求1所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，己烯雌酚的杂交瘤细胞腹水效价为1: 1.6X106。
5.根据权利要求1所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留的步骤依次为:偶联有MPA和DES的微球加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，随后加入生物素化的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。
6.根据权利要求5所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，包被好的微球一部分加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，另一部分加入系列醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL>1.6ng/mL、0.8ng/mL和 0.4ng/mL。
7.根据权利要求5所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminexversion2.1软件分析数据。
8.根据权利要求5所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，检测醋酸甲羟孕酮的抗体稀释度为1: 3000。
9.根据权利要求5所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，检测己烯雌酚的抗体稀释度为1: 6400。
10.根据权利要求5所述的同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，其特征在于，SA-PE的稀释度为1: 100。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的液相芯片的方法。该方法包括如下步骤(1)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的人工抗原；(2)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的单克隆抗体并纯化；(3)利用步骤(1)得到的人工抗原分别偶联液相芯片荧光微球；(4)利用步骤(2)得到的单克隆抗体进行生物素化；(5)使用步骤(3)得到的偶联的微球以及步骤(4)得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留。本发明方法可以同时检测醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚两种残留指标，快速、敏感、特异性强，醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的最低检出限均为0.4ng/mL。
文档编号G01N33/577GK103207272SQ20121001138
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者李健, 王艳, 陈沁 , 王权, 陈政晓, 蒋蔚 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局, 上海大学, 中国农业科学院上海兽医研究所