专利名称：一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，同时还涉及一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒的用途。
背景技术：
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，占胃肠道肿瘤的第3位。我国的发病率与死亡率，随着人民生活水平的提高，饮食结构的改变，呈逐年上升的趋势。结直肠癌已经成为威胁人类生命和健康不容忽视的疾病。结直肠癌起病隐匿，早 期症状不明显，许多患者在确诊时已经处于晚期。大约25%的患者初次就诊时就已经发生转移，另外，40% -50%新诊断患者将继续发展出现转移。仅仅少于5%的患者能存活5年以上。因此，深入对结直肠癌的基础研究和提高结直肠癌的诊断率，对提高结直肠患者的生存率、降低其病死率具有相当重要的临床意义。目前用于结直肠癌的诊断的方法包括大便潜血试验、内窥镜检查、影像学检察、分子生物学检查以及病理组织学检查。目前在结直肠癌诊断技术中，不同的检查手段是从不同侧面不同程度反映了区别于正常组织的肿瘤形态。单一的检查手段并不能明确病情，需要结合实际情况，选择多种检查手段才能做出判断。其中病理诊断也是结直肠癌诊断中最可靠的诊断，是明确诊断以拟定治疗方案所必需的依据。常规的病理形态学检查包括脱落细胞学检查和活体组织检查。由于结直肠中脱落细胞常有不同程度的变性，阴性结果并不能否定肿瘤的存在，临床上结直肠癌脱落细胞学检查应用范围非常有限，主要依靠组织病理学检查明确诊断。免疫组化是最近10多年来迅速发展起来的一门新兴技术。它已被广泛运用肿瘤研究和诊断，其原理是利用抗原与抗体的特异性结合反应来检测组织中的未知抗原或者抗体，主要是肿瘤相关抗原(肿瘤分化抗原和肿瘤胚胎抗原)，借以判断肿瘤的来源和分化程度，协助肿瘤的病理诊断和鉴别诊断。目前常用的染色方法有过氧化物酶-抗过氧化物酶法，即PAP法(peroxidaseantiperoxidase technique)和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法，即 ABC 法(avidin-biotin-peroxidase complex technique)。利用免疫组织化学方法已经可以对许多常规方法难以判断其来源的肿瘤加以鉴别。例如检测细胞骨架的中间丝(intermediate filament),其直径平均为IOnm,介于微管和微丝之间。中间丝有五类即神经原纤维、胶质原纤维酸性蛋白、结蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)和角蛋白(keratin)。它们各有生物化学和免疫学特性，并分别存在于不同类型的细胞中，故具有相对的特异性，可用来协助诊断相应的神经细胞、神经胶质细胞、横纹肌和平滑肌、间叶组织和上皮细胞来源的肿瘤。目前能用于肿瘤辅助诊断和鉴别诊断的抗体已不胜枚举。此应用基于本发明人严教授的实验室研究结果和通过用本抗体对一定量的结直肠癌患者的癌组织标本进行免疫组织化学染色，发现其特异性和差异性表达的研究结果，表明可将其做为特异性诊断指标。参考文献列举Targeting of antigens to B cellsaugments antigen-specific T—cell MUCl responses and breaks immune tolerance totumor-associated antigen, Chuanlin Ding, Li Wang, Jose Marroquin and Jun Yan,丨临床研究结果参考本专利的染色实验结果
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，该试剂盒不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞。本试剂盒将MUCl这一在结直肠癌患者的癌变组织中特异性高表达的细胞因子作为用于检测的参考指标。MUCl在癌变细胞上皮中呈阳性表达染色，而在正常结肠组织上皮细胞中呈阴性表达。MUCl蛋白阳性产物主要定位于细胞浆和细胞膜，表现为胞浆内和细胞表面有棕黄色颗粒，本试剂盒检测具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，。本发明的另一个目的是在于提供了一种用于结直肠癌免疫组织化学染色检测的试剂盒，该试剂盒能有效地区分结直肠癌变的上皮细胞和正常细胞，为临床的诊断和治疗提供参考依据。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成a)小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体；b)生物素标记的的羊抗小鼠IgG ；c)亲和素标记的HRP ；d)正常山羊血清封闭液；e)3% (体积比)H202 ;f) DAB 显色液；g)苏木素；在本发明中关键是小鼠来源的抗人MUCl的抗体制备，其步骤为A.用大鼠抗⑶19和人MUCl的抗原肽免疫小鼠，每隔一周进行一次免疫，共进行3次后，收集接受过被动免疫的小鼠血清，用ELISA的方法(所用试剂来自SouthernBiotech,Birmingham, AL 和 BioFX Laboratories, Owings Mills,MD 公司)测定抗 MUCl 应答效价。B.处死并取出接受过被动免疫并产生了高效价(ELISA法检测其抗体浓度)抗MUCl应答的小鼠脾脏细胞，将其与骨髓瘤细胞(provided by Dr Olivera Finn,University of Pittsburgh, PA)进行融合得到杂交瘤细胞,并用ELISA的方法对杂交瘤细胞分泌的MUCl抗体水平进行检测。C.对产生了高效价MUCl抗体的细胞克隆进一步用ELISA的方法检测其亚型，将明确亚型(IgG)的单克隆细胞通过杂交瘤技术进行大量单克隆抗体生产。利用本专利提及的杂交瘤技术获得高纯度的抗体，浓度大于lmg/ml。本发明中的抗MUCl特异性的单克隆抗体，联合免疫组织化学染色常规试剂生物素标记的的羊抗小鼠IgG、亲和素标记的HRP、正常山羊血清封闭液、3%H202、DAB显色液和苏木素，能方便、高效、特异的辅助结直肠癌的病理检测，可作为判断患者预后的一个指标，对结直肠癌的检测，基础研究和检测提供参考，具有临床实用性和科学研究性。一种用于结直肠癌免疫组织化学染色检测的试剂盒，其检测步骤是
I.组织用石蜡包 埋，切片，石蜡切片置于58_62°C烤箱中I小时后，脱蜡至水，用PBS (pH7. 4)冲洗2-4次，每次4-6分钟。2.抗原微波修复10mM pH 5. 8-6. 2枸橼酸钠缓冲液倒入微波修复盒内将切片放入修复液(枸橼酸钠缓冲液)内，海尔牌普通微波炉加热，确保修复温度在95-98°C，并尽量避免沸腾，可采取高火3min —中火7min —低火3min的修复方式。自然冷却后至室温(20-25°C，以下同)，PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。3.切片放入3% (体积比)H202溶液，室温下孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。4.甩去PBS液，滴加质量比为5% BSA,室温静置28_32分钟。5.甩去BSA，将小鼠抗人MUCl的单克隆抗体按I : 200的体积浓度稀释。每张切片加入100 U I稀释液覆盖组织，4°c过夜。PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。6.甩去PBS液，每张切片加100 U I羊抗小鼠的二抗，室温下孵育45分钟。PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。7.甩去PBS液，每张切片加50-100iil新鲜配制的DAB溶液(质量体积比为
0.025% -0. 05% )，室温20-25°C下孵育4_6分钟，显微镜控制显色约lmin。8.显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染l_3min，自来水洗。9.切片经过梯度酒精(70-100%，体积百分比)脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。结果的观察MUCl蛋白阳性产物主要定位于细胞浆和细胞膜，表现为胞浆内和细胞表面有棕黄色颗粒。在癌变的肠上皮细胞中表达，而在正常肠上皮细胞中不表达或低表达。免疫组织化学染色结果采用以下判断标准。将染色程度评分无色记0分、淡黄色记I分、棕黄色记2分和棕褐色记3分；再将阳性细胞所占的百分比评分0分为阴性、阳性细胞数< 10%记I分、11 % 50 %记2分、51 % 75 %记3分、> 75 %记4分，然后计算两者的乘积。乘积<3分为阴性，彡3分为阳性。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果本发明中的小鼠抗人MUCl的单克隆抗体进行了人源化改进，和其他非人源化抗体比较，除具有诊断价值外，还可应用到临床，进行治疗肿瘤，减少非人源化抗体带来的免疫排异反应。目前，该抗体用于结直肠癌的检测具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞。MUCl在癌变细胞上皮中呈阳性染色，而在正常结肠组织上皮细胞中呈阴性。
图I为一种免疫组织化学染色示意IA为癌变病灶区结肠组织切片进行免疫组织化学染色，不加MUCl抗体图；图IB为正常的结肠组织切片进行免疫组织化学染色，不加MUCl抗体图；图IC为癌变病灶区结肠组织切片用MUCl抗体进行免疫组织化学染色图；图ID为正常的结肠组织切片用MUCl抗体进行免疫组织化学染色图。所述的正常的结肠组织切片为病人手术切除标本的末端、远离病灶区的正常组织。所述的癌变病灶区结肠组织为病人手术切除标本的中间、病灶中心区的癌变组织。 图2为一种免疫组织化学染色示意图。表示结肠癌不同分期病人手术切除标本中病灶区域的癌变组织和癌旁正常组织免疫组织化学染色图。图I和图2结果显示癌变组织上皮细胞胞浆和细胞膜高表达MUCl，而正常结肠组织上皮细胞表达量低或是基本不表达MUCl。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995 ;细胞实验指南，吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :一种结直肠癌的免疫组织化学染色试剂盒，包括a)小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体；b)生物素标记的的羊抗小鼠IgG ；c)亲和素标记的HRP ；d)正常山羊血清封闭液；e)3% (体积比)H202 ;f) DAB 显色液；g)苏木素；b-g为武汉博士德生物工程有限公司产品。小鼠来源的抗人MUCl的抗体制备，其步骤是A)用大鼠抗 CD19 (eBioscience)和人 MUCl (Applied Biosystems, Foster City,CA)的抗原肽免疫小鼠，每隔一周进行一次免疫，共进行3次后，收集接受过被动免疫的小鼠血清，用ELISA的方法测定抗MUCl应答效价。B)取接受过被动免疫并产生了高效价抗MUCl应答的小鼠脾脏细胞，将其与骨髓瘤细胞进行融合得到杂交瘤细胞，并用ELISA的方法对杂交瘤细胞分泌的MUCl抗体水平进行检测。C)对产生了高效价MUCl抗体的细胞克隆进一步用ELISA的方法检测其亚型，将明确亚型(IgG)的单克隆细胞通过杂交瘤技术进行大量单克隆抗体生产。实施例2 一种用于结直肠癌的免疫组织化学染色检测的试剂盒，该试剂盒包含a)小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体；b)生物素标记的的羊抗小鼠IgG ；c)亲和素标记的HRP ；d)正常山羊血清封闭液；
e)3% (体积比)的 H2O2 ；f) DAB 显色液； g)苏木素；检测步骤是I.组织用石蜡包埋，切片，石蜡切片置于60°C烤箱中I小时后，脱蜡至水，用PBS (pH7. 4)冲洗三次，每次5分钟。2.抗原微波修复10mM pH 6. 0±0. I枸橼酸钠缓冲液倒入微波修复盒内将切片放入修复液内，海尔牌普通微波炉加热，确保修复温度在95-98°C，并尽量避免沸腾，可采取高火3min —中火7min —低火3min的修复方式。自然冷却至室温(20_25°C )后，PBS冲洗三次，每次5分钟。3.切片放入3% (体积比)11202中，室温下孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗三次，每次5分钟。4.甩去PBS液，滴加质量比5% BSA室温静置30分钟。5.甩去BSA，将抗人MUCl的单克隆抗体按I : 200的浓度稀释。每张切片加入100 u I稀释液覆盖组织，4°C过夜。PBS冲洗三次，每次5分钟。6.甩去PBS液，每张切片加100 U I羊抗小鼠的二抗，室温下孵育45分钟。PBS冲洗三次，每次5分钟。7.甩去PBS液，每张切片加50-100iil新鲜配制的DAB溶液(质量体积比为
0.025% -0. 05% )，室温20-25°C下孵育5分钟，显微镜控制显色约lmin。8.显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染2min，自来水洗。9.切片经过梯度酒精(体积百分比为70-100% )脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果的观察MUCl蛋白阳性产物主要定位于细胞浆和细胞膜，表现为胞浆内和胞膜上有棕黄色颗粒。在癌变的肠上皮细胞中表达，而在正常肠上皮细胞中不表达或低表达(图I和图2)。免疫组织化学染色结果采用以下判断标准。将染色程度评分无色记0分、淡黄色记I分、棕黄色记2分和棕褐色记3分；再将阳性细胞所占的百分比评分0分为阴性、阳性细胞数(10%记I分、11% 50%记2分、51% 75%记3分、> 75%记4分，然后计算两者的乘积。乘积<3分为阴性，>3分为阳性。通过组织芯片技术分析了 75离结直肠癌病人手术切除标本中的表达水平。发现75例结肠癌组织芯片中，癌变组织MUCl的阳性表达水平显著高于正常组织73. 33% 30. 67%。
权利要求
1.一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，该试剂盒含有 a)小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体； b)生物素标记的的羊抗小鼠IgG； c)亲和素标记的HRP； d)正常山羊血清封闭液； e)3%体积比H2O2 ； f)DAB显色液； g)苏木素。
2.根据权利要求I所述的一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，其特征在于所述的小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体的制备步骤是 A.用抗大鼠CD19和人MUCl的抗原肽免疫小鼠，每隔一周进行一次免疫，共进行3次后，收集接受过被动免疫的小鼠血清，用ELISA的方法测定抗MUCl应答效价； B.取接受过被动免疫并产生了高效价抗MUCl应答的小鼠脾脏细胞，将其与骨髓瘤细胞进行融合得到杂交瘤细胞，并用ELISA的方法对杂交瘤细胞分泌的MUCl抗体水平进行检测； C.对产生了高效价MUCl抗体的细胞克隆进一步用ELISA的方法检测其亚型，将明确亚型=IgG的单克隆细胞通过杂交瘤技术进行单克隆抗体生产。
3.一种用于结直肠癌免疫组织化学染色检测的试剂盒，含有小鼠来源的抗人MUCl单克隆抗体、生物素标记的的羊抗小鼠IgG、亲和素标记的HRP、正常山羊血清封闭液、3%体积比H2O2、DAB显色液和苏木素。
全文摘要
本发明公开了一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒及应用，该试剂盒含有a)小鼠来源的抗人MUC1单克隆抗体，b)生物素标记的的羊抗小鼠IgG；c)亲和素标记的HRP；d)正常山羊血清封闭液；e)3%体积比H2O2；f)DAB显色液；g)苏木素。该检测具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞。MUC1在癌变细胞上皮中呈阳性表达染色，而在正常结肠组织上皮细胞中呈阴性表达，有效地区分结直肠癌变的上皮细胞和正常细胞，为临床的诊断和治疗提供参考依据。
文档编号G01N33/577GK102621324SQ20121009737
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者严俊 申请人:武汉康迈生物技术有限公司