专利名称：一种将盐酸丙美卡因中间体Ⅳ与其它中间体的高效液相色谱分离的方法
技术领域：
本发明提供了一种将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法。
背景技术：
盐酸丙美卡因为一种表面麻醉剂，用于各种眼科手术及眼科检查的表面麻醉，与其它麻醉剂相比，具有快速、高效，对角膜毒副作用轻等优点。盐酸丙美卡因中间体IV分子式=C13H17NO5，化学名为3-硝基-4-丙氧基苯甲酸丙酯，中间体I，II，III，IV结构式分别如下
中间体I
O八—
HO—(;, N;>—COOH
\- /
中间体II
_ ο
H3C-^~I—o 八v/1 3
中间体III
OjN'9
IlZ\ CH3 o—(7 Y cr ^ 3
\—/
中间体IV
为了准确地控制盐酸丙美卡因中间体的质量，需要将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体进行有效地分离，但是目前采用的高效液相等度洗脱方式还不能实现盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的有效分离。
发明内容
本发明提供了一种将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，它可以实现盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离质量的准确控制。本发明采用了以下技术方案一种将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，包括以下步骤步骤一，取盐酸丙美卡因样品，用有机溶剂溶解盐酸丙美卡因样品，配制成每Iml含盐酸丙美卡因O. 5 I. Omg的样品溶液；步骤二，设置液相色谱仪的流动相，流动相的流速O. 6 I. 2mL/min、检测波长232±3nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱20°C 40°C ；
步骤三，取步骤一中的样品溶液5-20μ1注入经步骤二中设置的液相色谱仪，完成盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离。本发明步骤一的有机溶剂为甲醇或乙醇。本发明步骤二种液相色谱仪的流动相为Α泵为有机改性剂，B泵为缓冲盐溶液，以及设置液相色谱仪的梯度洗脱程序如下
时间(min)A泵流动相(%)B泵流动相(％)
5-100-30100-70
10-2030-6070-40
20-306040
30-5060-040-100
50-60O100,
有机改性剂与缓冲溶液的体积比随时间变化而变化，5分钟到10分钟，流动相A泵的体积逐渐从0%变化到30%，同时流动相B泵的体积逐渐从100%变化到70%，A泵流动相B泵流动相为0-30 100-70 ； 10分钟到20分钟，流动相A泵的体积逐渐从30%变化到60%，同时流动相B泵的体积逐渐从70%变化到40%，A泵流动相B泵流动相为30-60 :70-40 ；20分钟到30分钟，流动相A泵的体积保持60%不变，同时流动相B泵的体积保持40%不变，A泵流动相B泵流动相为60 40 ；30分钟到50分钟，流动相A泵的体积逐渐从60%变化到0%，同时流动相B泵的体积逐渐从40%变化到100%，A泵流动相B泵流动相为60-0 :40-100 ；50分钟到60分钟，流动相A泵的体积保持0%不变，同时流动相B泵的体积保持100%不变，A泵流动相B泵流动相为O :100。本发明步骤二中的液相色谱仪采用碳十八烷硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱的规格为长度250mm、内径4. 6mm、粒度5Mm。所述的有机改性剂为乙腈或甲醇。所述的缓冲盐溶液为90%的磷酸盐溶液，90%的磷酸盐溶液是将O. 05M磷酸二氢钾和O. 02M庚烷磺酸钠加水溶解后，再加三乙胺调将PH至
5.2o本发明具有以下技术效果本发明采用碳十八烷硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱，能有效分离盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体；选择甲醇为溶剂，确保样品能完全溶解；选择进样体积 ομ ，柱温为室温25°C，提高了色谱峰的对称性；选择流速I. OmL/min,能提高分离度；选择A泵为有机改性剂，有机改性剂为甲醇，B泵缓冲盐溶液为90%的磷酸盐(O. 05M磷酸二氢钾，O. 02M庚烷磺酸钠，三乙胺调PH至5. 2)，采用梯度洗脱实现盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的完全分离，实现了盐酸丙美卡因中间体纯度的检测，对实现盐酸丙美卡因中间体在盐酸丙美卡因药物合成和制剂生产过程的质量控制方面具有现实意义。
图I为实施例一的高效液相色谱图。图2为实施例二的高效液相色谱图。图3为实施例三的高效液相色谱图。
具体实施例方式通过以下实施例进一步说明本发明。实施例一
采用安捷伦LC-1200型号高效液相色谱仪、Apollo品牌碳十八硅烷键和硅胶为填充剂、的色谱柱，色谱柱的规格为长度250mm、内径4. 6mm、粒度5Mm。步骤一，分别取盐酸丙美卡因样品，样品内的中间体IV及中间体I、II、III各5mg，置于IOmL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每Iml含盐酸丙美卡因
O.5 I. Omg的样品溶液，作为供试品溶液；
步骤二，设置液相色谱仪的流动相，即A泵为有机改性剂，B泵为缓冲盐溶液，以及设置液相色谱仪的梯度洗脱程序如下
梯度一时间(min)A泵流动相(%)B泵流动相(％)
5-101090
10-204060
20-406040
40-607030
601090，
当5-10分钟时，A泵流动相B泵流动相为10:90，当10-20 分钟时，A泵流动相B泵流动相为40:60，当20-40分钟时，A泵流动相B泵流动相为60:40，当40-60分钟时，A泵流动相B泵流动相为70 30,当60分钟时，A泵流动相B泵流动相为10 90，设置液相色谱仪的流动相流速O. 6mL/min、检测波长230nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱20°C ；
步骤三，取步骤一的供试品溶液20μ1注入经步骤二设置的液相色谱仪，完成盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离，记录色谱图，结果见附图I。在图I中，保留时间为5. 577min、21. 500min、29. 475min的色谱峰分别为中间体II、I、111的色谱峰，保留时间为33. 798min为盐酸丙美卡因中间体IV的色谱峰。中间体III与中间体IV的分离度达到25. 69，完全符合《2005版中国药典》分离度不小于I. 5的规定，表明盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体可以在同一色谱条件下达到很好的分离。
实施例二
采用安捷伦LC-1200型号高效液相色谱仪、Apollo品牌碳十八烷硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱的规格为长度250mm、内径4. 6mm、粒度5Mm。步骤一，分别取盐酸丙美卡因样品，样品内的中间体IV及中间体I、II、III各10mg，置于IOmL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每Iml含盐酸丙美卡因
0.5 I. Omg的样品溶液，作为供试品溶液；
步骤二，设置液相色谱仪的流动相，即A泵为有机改性剂，B泵为缓冲溶液，以及设置液相色谱仪的梯度洗脱程序如下梯度二 时间(min)A泵流动相(%)B泵流动相(％)
5-10O100
10-203070
20 -307030
30 -507030
50 -601090 601090，
当5-10分钟时，A泵流动相B泵流动相为0:100，当10-20 分钟时，A泵流动相B泵流动相为30:70，当20-30分钟时，A泵流动相B泵流动相为70:30，当30-50分钟时，A泵流动相B泵流动相为70 30,当50 —60分钟时，A泵流动相B泵流动相为10: 90，当60分钟，A泵流动相B泵流动相为10 :90，设置液相色谱仪的流动相流速I. 2mL/min、检测波长237nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱40°C ；
步骤三，取步骤一的供试品溶液5μ1注入经步骤二设置的液相色谱仪，完成盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离，记录色谱图，见图2.
在图2中，保留时间为5. 667min、16. 374 min、22. 059min的色谱峰分别为中间体II、I、111的色谱峰，保留时间为28. 384min为盐酸丙美卡因中间体IV的色谱峰，中间体III与中间体IV的分离度达到25. 78，完全符合《2005版中国药典》分离度不小于I. 5的规定，表明盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体可以在同一色谱条件下达到很好的分离。
实施例三
采用安捷伦LC-1200型号高效液相色谱仪、Apollo品牌碳十八烷硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱的规格为长度250mm、内径4. 6mm、粒度5Mm。步骤一，分别取盐酸丙美卡因样品，样品内的中间体IV及中间体I、II、III、IV各8mg,置于IOmL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每Iml含盐酸丙美卡因
0.5 I. Omg的样品溶液，作为供试品溶液；
步骤二，设置液相色谱仪的流动相，即A泵为有机改性剂，B泵为缓冲溶液，以及设置液相色谱仪的梯度洗脱程序如下
梯度三时间(min)A泵流动相(%)B泵流动相(％)
5-10O100
10-203070
20 -306040
30 -506040
50 -60O100
60O100，
当5-10分钟时，A泵流动相B泵流动相为0:100，当10-20 分钟时，A泵流动相B泵流动相为30:70，当20-30分钟时，A泵流动相B泵流动相为60:40，当30-50分钟时，A泵流动相B泵流动相为60 40,当50 —60分钟时，A泵流动相B泵流动相为O: 100，当60分钟，A泵流动相B泵流动相为O : 100，设置液相色谱仪的流动相流速
1.OmL/min、检测波长232nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱25°C ；
步骤三，取步骤一的供试品溶液10μ1注入经步骤二设置的液相色谱仪，完成盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离，记录色谱图，结果见附图3。在图3中，保留时间为3. 580min、12. 858 min、21. 715min的色谱峰分别为中间体
II、I、111的色谱峰，保留时间为27. 501min为盐酸丙美卡因中间体IV的色谱峰，中间体III与中间体IV的分离度达到27. 26，完全符合《2005版中国药典》分离度不小于I. 5的规定， 表明盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体可以在同一色谱条件下达到很好的分离。
权利要求
1.一种将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，包括以下步骤 步骤一，取盐酸丙美卡因样品，用有机溶剂溶解盐酸丙美卡因样品，配制成每Iml含盐酸丙美卡因O. 5 I. Omg的样品溶液； 步骤二，设置液相色谱仪的流动相，流动相的流速O. 6 1.2mL/min、检测波长232±3nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱20°C 40°C ； 步骤三，取步骤一中的样品溶液5-20μ1注入经步骤二中设置的液相色谱仪内，完成盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的分离。
2.根据权利要求I所述的将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，其特征是步骤二种液相色谱仪的流动相为Α泵为有机改性剂，B泵为缓冲盐溶 液，以及设置液相色谱仪的梯度洗脱程序如下 时间(min)A泵流动相(%)B泵流动相(％)5-100-30100-7010-2030-6070-40 20-30604030-5060-040-100 50-60O100, 有机改性剂与缓冲溶液的体积比随时间变化而变化，5分钟到10分钟，流动相A泵的体积逐渐从0%变化到30%，同时流动相B泵的体积逐渐从100%变化到70%，A泵流动相B泵流动相为0-30 100-70 ； 10分钟到20分钟，流动相A泵的体积逐渐从30%变化到60%，同时流动相B泵的体积逐渐从70%变化到40%，A泵流动相B泵流动相为30-60 70-40 ；20分钟到30分钟，流动相A泵的体积保持60%不变，同时流动相B泵的体积保持40%不变，A泵流动相B泵流动相为60 40 ；30分钟到50分钟，流动相A泵的体积逐渐从60%变化到0%，同时流动相B泵的体积逐渐从40%变化到100%，A泵流动相B泵流动相为60-0 :40-100 ；50分钟到60分钟，流动相A泵的体积保持0%不变，同时流动相B泵的体积保持100%不变，A泵流动相B泵流动相为O :100。
3.根据权利要求I所述的将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，其特征是所述步骤一的有机溶剂为甲醇或乙醇。
4.根据权利要求I所述的将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，其特征是所述的步骤二中的液相色谱仪采用碳十八烷硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱的规格为长度250mm、内径4. 6mm、粒度5Mm。
5.根据权利要求2所述的将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，其特征是所述的有机改性剂为乙腈或甲醇。
6.根据权利要求2所述的将盐酸丙美卡因中间体IV与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，其特征是所述的缓冲盐溶液为90%的磷酸盐溶液，90%的磷酸盐溶液是将O. 05M 磷酸二氢钾和O. 02M庚烷磺酸钠加水溶解后，再加三乙胺调将PH至5. 2。
全文摘要
本发明公开了一种将盐酸丙美卡因中间体Ⅳ与其它中间体的高效液相色谱分离的方法，包括以下步骤步骤一，取盐酸丙美卡因样品，用有机溶剂溶解盐酸丙美卡因样品，配制成每1ml含盐酸丙美卡因0.5～1.0mg的样品溶液；步骤二，设置液相色谱仪的流动相，流动相的流速0.6～1.2mL/min、检测波长232±3nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱20℃～40℃；步骤三，取步骤一中的样品溶液5-20μl注入经步骤二中设置的液相色谱仪内，完成盐酸丙美卡因中间体Ⅳ与其它中间体的分离。
文档编号G01N30/60GK102721775SQ20121015576
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月19日 优先权日2012年5月19日
发明者王爱霞, 陈妍 申请人:泰州市产品质量监督检验所