专利名称：用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于评估肺腺癌化疗效果功能的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
肺癌是世界范围内常见的癌症且是导致癌症患者死亡的主要原因之一。在我国肺癌发病率和死亡率高居各恶性肿瘤之首。根据世界卫生组织国际肿瘤研究所(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)统计，我国 2008 年肺癌发病率为35/10万人，并且该机构估计至2025年，我国将每年新增肺癌100万例。根据卫生部2010年卫生统计年鉴，截止2009年，全国肺癌死亡率为30. 83/10万人，高于第二高死亡率的肝癌逾4/10万人。肺癌一般分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两种组织学类型。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数的85%，并进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等。在过去的30年中，我国肺癌组织学类型发生改变，自1970年起，腺癌发病率快速增长，并逐步取代鳞癌，成为我国肺癌最常见类型。在肺癌治疗效果方面，生物标志物变得尤为重要。在肺癌患者中，目前对单次化疗或抗肿瘤药物治疗的反应率普遍低于其它疾病的治疗效果。另外，化疗药物的有效浓度往往接近甚至与毒性浓度重合。因此，针对肺癌患者进行分层，同时筛选出对特定治疗方案最为敏感的人群，对患者和医生而言都具有非常重要的临床价值。因此，探索具有化疗效果评估价值的新型简易生物标记物不仅有益于肺癌患者的个性化治疗和早期干预，还会带来巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有评估肺腺癌化疗效果的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照组血清组成；其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体21，趋化因子配体28，嗜酸性粒细胞趋化因子_3，血液滤过CC趋化因子-1，白血病抑制因子，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞炎性蛋白_3a，中性粒细胞趋化蛋白-2，人重组的巨噬细胞炎性蛋白-4，基质细胞衍生因子-I a在内的10种细胞因子。优选地，所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. 0克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。优选地，所述的终止液为2M硫酸溶液。优选地，所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75vol %的过氧化氢水溶液混合而得；其中，所述pH值为5.0的底物缓冲液为含0.2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。本发明的优点是I、本发明首次提出包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的10种细胞因子或与其它临床指标组合可成为评估肺腺癌化疗效果的主要指标。 2、包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的10种细胞因子作为预测指标较目前用于评估肺腺癌化疗效果的电子计算X射线断层扫描指标及其它临床指标更为客观，而且测定此类蛋白表达水平简单易行可靠。
具体实施例方式为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。实施例一种用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的细胞因子是包括趋化因子配体21，趋化因子配体28，嗜酸性粒细胞趋化因子_3，血液滤过CC趋化因子-1，白血病抑制因子，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞炎性蛋白_3a，中性粒细胞趋化蛋白-2，人重组的巨噬细胞炎性蛋白-4，基质细胞衍生因子-I a在内的10种细胞因子。所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。所述PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. 0克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。所述的终止液为2M硫酸溶液。所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75V01%的过氧化氢水溶液混合而得，所述pH值为5. 0的底物缓冲液为含0. 2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。上述试剂盒的使用方法如下I、包被用0. 05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为l-10ug/mL。在每个聚苯乙烯的反应孔中加0. ImL,于4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。2、加样分别加一定血清蛋白稀释液稀释后的待检样品、正常人血清和阳性对照血清0. ImL至上述已包被的反应孔中，置37°C孵育I小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。3、加辣根过氧化物酶标抗体在各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标抗体0. ImL, 37°C孵育0. 5-1小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。4、加底物液显色在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液0. lmL，37°C下孵育10-30分钟。5、终止反应在各反应孔中加入2M硫酸0. 05mL。6、结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。若大于规定的阴性对照OD值2. I倍，即为阳性。以肺腺癌化疗前蛋白表达水平作为衡量标准，肺腺癌化疗后患者血清蛋白谱表达量除以此标准，从而确定患者蛋白谱相对于化疗前的表达比例。其中，大于或等于2. 4为增 高，小于2. 4为降低。本发明通过收集经过临床病理诊断确诊肺腺癌有276例患者，根据首次治疗方案，接受化疗的有223例，通过随机化方法抽样了其中10例腺癌癌患者血清，并分别于化疗前和化疗后21天或42天采血；同时在992名健康志愿者的血清库中，通过随机化方法抽样了 14例正常人血清。应用蛋白质芯片技术检测血清内40种细胞因子，同时以正常人血清中蛋白表达水平作为衡量标准，筛选肺腺癌患者在化疗过程中血清蛋白谱中上调或下调的细胞因子(P < 0. 05)。最终确定腺癌患者血清蛋白谱中有10种细胞因子化疗前后比较存在差异，包括7种细胞因子异向变化和3种细胞因子同向变化(如表I所示)。表I多种细胞因子在肺腺癌患者化疗前、后及正常人血清中的表达变化正靈组....
___pjt_比值p 值
异向改变
嗜酸性粒细胞趋化因子-3 0.2316 0.0739 1.1110 0,0002 血液滤过 CC 趋化因子-I 0.3319 0.4599 2.8497 0.0048 巨噬细胞源性細胞因子 0.5802 0.1976 2.3380 0.0178 巨噬编胞炎性蛋白-3a0.5555 0.6164 1.7482 0.0143
中性粒鲴胞趋化蛋白-20.3557 0.1236 3.9910 ■ 0.0006
人重组的巨■細胞炎性蛋白-4 0.4056 0.1236 2.9758 0.0019 基质细胞衍生因子-I a2.9463 0.0068 0.0407 0.0008
同向改变
趋化因子配体 21 2.7842 0.0039 1.2718 0.0074趋化因子 体 28 1.4608 0.0402 2.0579 0.0143_白血病抑制因子_1.2672 0.1137 L8894 0.014权利要求
1.一种用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照组血清组成； 其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体21，趋化因子配体28，嗜酸性粒细胞趋化因子_3，血液滤过CC趋化因子-1，白血病抑制因子，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞炎性蛋白_3a，中性粒细胞趋化蛋白_2，人重组的巨噬细胞炎性蛋白_4，基质细胞衍生因子-I a在内的10种细胞因子。
2.如权利要求I所述的用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述PH值为9.6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。
3.如权利要求I所述的用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述PH值为 7.4的磷酸盐缓冲液为将0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. 0克氯化钠，0. 2克氯化钾，0. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。
4.如权利要求I所述的用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀释液为将0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。
5.如权利要求I所述的用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M硫酸溶液。
6.如权利要求I所述的用于评估肺腺癌化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述的四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5mL溶液浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmLPH值为5. 0的底物缓冲液与32uL体积浓度为0. 75V01%的过氧化氢水溶液混合而得； 其中，所述pH值为5. 0的底物缓冲液为含0. 2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种用于评估肺腺癌化疗效果功能的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照组血清组成；所述的细胞因子为包括趋化因子，炎症相关因子，免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的10种细胞因子。本发明可协助评估肺腺癌的化疗效果。
文档编号G01N33/574GK102749448SQ20121026236
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者杨达伟, 王向东, 白春学 申请人:复旦大学附属中山医院