专利名称：用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断非小细胞肺癌功能的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
肺癌是世界范围内常见的癌症且是导致癌症患者死亡的主要原因之一。在我国肺癌发病率和死亡率高居各恶性肿瘤之首。根据世界卫生组织国际肿瘤研究所(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)统计，我国 2008 年肺癌发病率为35/10万人，并且该机构估计至2025年，我国将每年新增肺癌100万例。根据卫生部2010年卫生统计年鉴，截止2009年，全国肺癌死亡率为30. 83/10万人，高于第二高死亡率的肝癌逾4/10万人。肺癌一般分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两种组织学类型。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数的85%，并进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等。在过去的30年中，我国肺癌组织学类型发生改变，自1970年起，腺癌发病率快速增长，并逐步取代鳞癌，成为我国肺 癌最常见类型。尽管肺癌的5年生存率只有15%，但仅占16%的早期诊断为肺癌的患者其5年生存率可达到49%，可见早期诊断是提高生存率的重要因素。影像学和细胞学筛查用于肺癌的早期检测，尽管具有一定敏感性，但对降低肺癌患者病死率的作用不大；而发展特异性细胞因子标志物作为影像技术的补充可能会降低肺癌患者的病死率。因此，探索具有诊断价值的新型简易生物标记物不仅有益于肺癌患者的早期诊断和早期干预，还会带来巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒。为了达到上述目的，本发明提供了一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体21，酪氨酸蛋白激酶7，β细胞素，趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，粒细胞趋化蛋白2，人生长调节致癌基因，血液滤过CC趋化因子I，血液滤过CC趋化因子-2，白介素-9，白介素-18-结合蛋白a，白血病抑制因子，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子_3，单核细胞趋化因子_4，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞刺激蛋白α，中性粒细胞趋化蛋白-2,骨桥蛋白，人重组的巨噬细胞炎性蛋白-4,血小板因子4,基质细胞衍生因子-I α，胸腺表达趋化因子在内的23种细胞因子。优选地，所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将O. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. O克氯化钠，O. 2克氯化钾，O. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。优选地，所述的血清蛋白稀释液为O. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmLPH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。优选地，所述的终止液为2M硫酸溶液。优选地，所述的四甲基联苯胺底物溶液为O. 5mL浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. O的底物缓冲液与32uL浓度为O. 75vol %的过氧化氢水溶液混合而得；
其中，所述pH值为5.0的底物缓冲液为含O. 2M磷酸氢二钠和O. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。
本发明的优点是I、本发明首次提出包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的23种细胞因子或与其它临床指标组合可成为非小细胞肺癌诊断的主要指标。2、包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的23种细胞因子作为预测指标较目前用于诊断非小细胞肺癌的胸部X射线指标及其它临床指标更为客观，而且测定此类蛋白表达水平简单易行可靠。
具体实施例方式为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。实施例一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体21，酪氨酸蛋白激酶7，β细胞素，趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，粒细胞趋化蛋白2，人生长调节致癌基因，血液滤过CC趋化因子I，血液滤过CC趋化因子-2，白介素-9，白介素-18-结合蛋白a，白血病抑制因子，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子_3，单核细胞趋化因子_4，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞刺激蛋白α，中性粒细胞趋化蛋白-2,骨桥蛋白，人重组的巨噬细胞炎性蛋白-4,血小板因子4,基质细胞衍生因子-I α，胸腺表达趋化因子在内的23种细胞因子。所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。所述PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为将O. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. O克氯化钠，O. 2克氯化钾，O. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。所述的血清蛋白稀释液为O. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。所述的终止液为2M硫酸溶液。所述的四甲基联苯胺底物溶液为O. 5mL浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为5. O的底物缓冲液与32uL浓度为O. 75Vol%的过氧化氢水溶液混合而得，所述pH值为5. O的底物缓冲液为含O. 2M磷酸氢二钠和O. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。上述试剂盒的使用方法如下
I、包被用O. 05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为l-10ug/mL。在每个聚苯乙烯的反应孔中加O. ImL,于4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。2、加样分别加一定血清蛋白稀释液稀释后的待检样品、正常人血清和阳性对照血清O. ImL至上述已包被的反应孔中，置37°C孵育I小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。 3、加辣根过氧化物酶标抗体在各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标抗体O. ImL, 37°C孵育O. 5-1小时后用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。4、加底物液显色在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液O. lmL，37°C下孵育10-30分钟。5、终止反应在各反应孔中加入2M硫酸O. 05mL。6、结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。若大于规定的阴性对照OD值2. I倍，即为阳性。以正常对照品蛋白表达水平作为衡量标准，非小细胞肺癌患者血清蛋白谱表达量除以此标准，从而确定患者蛋白谱相对于正常人的表达比例。其中，大于或等于2. 4为增高，小于2. 4为降低。本发明通过收集经过临床病理诊断确诊为肺癌的有482例患者，再根据病理类型区分，确定为非小细胞肺癌的患者383例，通过随机化方法抽样了 50例非小细胞肺癌患者血清；同时在992名健康志愿者的血清库中，通过随机化方法抽样了 14例正常人血清。应用蛋白质芯片技术检测血清内40种细胞因子，同时以正常人血清中蛋白表达水平作为衡量标准，筛选非小细胞肺癌患者血清蛋白谱中上调或下调的细胞因子(P<0. 05)。最终确定非小细胞肺癌患者血清蛋白谱中有23种细胞因子表达与正常人比较存在差异，包括15种细胞因子上调和8种细胞因子下调的联合表达改变(如表I所示)。表I多种细胞因子在非小细胞肺癌患者、鳞癌患者、腺癌患者及正常人血清中的表达变化
权利要求
1.一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH值 为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成； 其中，所述的细胞因子为包括趋化因子配体21，酪氨酸蛋白激酶7，β细胞素，趋化因子配体28，皮肤T细胞虏获趋化因子，粒细胞趋化蛋白2，人生长调节致癌基因，血液滤过CC趋化因子1，血液滤过CC趋化因子-2，白介素-9，白介素-18-结合蛋白a，白血病抑制因子，可与糖蛋白D竞争疱疹病毒进入T细胞位点的TNF样诱导蛋白，单核细胞趋化因子_3，单核细胞趋化因子_4，巨噬细胞源性细胞因子，巨噬细胞刺激蛋白α，中性粒细胞趋化蛋白-2，骨桥蛋白，人重组的巨噬细胞炎性蛋白-4，血小板因子4，基质细胞衍生因子-Ia，胸腺表达趋化因子在内的23种细胞因子。
2.如权利要求I所述的用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，所述PH值为9.6的碳酸盐缓冲液为将I. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL蒸馏水中而得。
3.如权利要求I所述的用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，所述PH值为7.4的磷酸盐缓冲液为将O. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷酸氢二钠，8. O克氯化钠，O. 2克氯化钾，O. 5mL吐温-20加至IL蒸馏水中而得。
4.如权利要求I所述的用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀释液为O. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液而得。
5.如权利要求I所述的用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M硫酸溶液。
6.如权利要求I所述的用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的四甲基联苯胺底物溶液为O. 5mL浓度为10mg/5mL的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，IOmL pH值为、5.O的底物缓冲液与32uL浓度为O. 75V01%的过氧化氢水溶液混合而得； 其中，所述PH值为5. O的底物缓冲液为含O. 2M磷酸氢二钠和O. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；所述的细胞因子为包括趋化因子、炎症相关因子，以及免疫细胞因子等多种细胞因子类别在内的23种细胞因子。本发明可协助诊断非小细胞肺癌。
文档编号G01N33/574GK102759620SQ20121026237
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者杨达伟, 王向东, 白春学 申请人:复旦大学附属中山医院