专利名称：一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水体中氟含量的方法。
背景技术：
氟污染主要来源于主要来源于铝的冶炼、磷矿石加工、磷肥生产、钢铁冶炼和煤炭燃烧过程的排放物，以及电镀、金属加工等工业的含氟废水的排放。含氟烟尘沉降或受降水淋洗，会使土壤、地表水和地下水受污染。氟可以抑制脂肪酶、骨质磷酸酶和尿素酶等酶的活性，引起物质代谢紊乱。氟还可使甲状旁腺代偿性增生，干扰骨的钙磷代谢。骨骼氟中毒表现为骨硬化，韧带、关节囊钙化，椎管及椎间孔变窄后，可压迫脊髓神经根而导致麻痹、瘫痪。氟还可抑制内分泌作用，对生殖腺、肾上腺和胰腺产生不良影响。高浓度氟污染可刺激皮肤和粘膜，弓I起皮肤灼伤、皮炎、呼吸道炎症。我国国标规定的氟含量环境监测方法主要为类氟试剂比色法、茜素磺酸锆目视比色法、离子选择性电极法以及离子色谱法。这些化学分析和仪器检测一般都需要量药品或者昂贵设备，前处理步骤繁琐，操作复杂，而且往往由于缺乏特异标样而无法获得精确数值。化学分析中包括过硫酸铵分光光度法、高碘酸银钾分光光度法和甲醛肟分光光度法等测定氟的方法，这些方法都需要大量药品，步骤繁杂，工作量大，而且误差也较大。大肠杆菌(Escherichia coli)作为水质卫生学指标，在环境水质监测中起着非常重要的指示作用，其实验方法规范，生长培养操作简易，存在多种突变体菌株，可通过有绿色荧光蛋白胨GFP表达的0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液指示水体污染程度并量化表征，并通过培养基扩散的变化，评价其生存条件的优劣，因此广泛应用于环境水质监测领域。
发明内容
本发明是为解决现有的检测水体中氟含量的方法存在的对设施要求高、操作复杂、成本昂贵的技术问题，而提供一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法。本发明的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行一、配置LB液体培养基；二、将菌液浓度为IO6 109Cuf/mL的0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为(f2):1000混合，在温度为34 40°C的条件下，培养扩llh，至平台期，得到平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液；三、将步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为I :(9(Γ110)混合，得到检测水体中氟含量的培养菌液；四、将不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液按体积比为(f2):1000分别混合，在温度为3Γ40 的条件下，震荡培养4 6h，得到不同浓度的含氟菌液；然后取每个浓度的含氟菌液，在荧光显微镜下进行荧光强度检测，利用图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x为含氟水样的氟浓度，y为含氟菌液的荧光强度；不同氟含量的水样中氟浓度分别为 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、IOmg/L、20mg/L 和 50mg/L ；五、取待测水样，加入到步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液中，在温度为3Γ40 的条件下，震荡培养4 6h，测量菌液荧光强度，利用步骤四获得的回归方程计算待测水样中的氟含量；其中待测水样的与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液的体积t匕(I 2) 1000o本发明有益效果 本发明的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法的优点在于，在较短时间内，通过细菌生长检测含氟水体的浓度并评价其毒性，与化学检测方法和仪器分析等传统技术相比成本低、步骤少、操作简单。本发明的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，利用发光细菌荧光敏感度强于传统的OD值的优点，通过荧光显微镜和图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，然后建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程，利用回归方程可快速计算出待测水样中氟的含量，与传统的琼脂扩散法比较，本发明的利用发光细菌检测水体中氟含量的方法更快捷和准确，且实验操作方便，精确度高，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，可应用于环境水质监测领域。
图I是实施例I中菌液荧光强度与氟含量的关系曲线图。
具体实施例方式本发明的技术方案不局限于以下具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行一、配置LB液体培养基；二、将菌液浓度为IO6 109Cuf/mL的0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为(f2):1000混合，在温度为34 40°C的条件下，培养扩llh，至平台期，得到平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液；三、将步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为I :(9(Γ110)混合，得到检测水体中氟含量的培养菌液；四、将不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液按体积比为(f2):1000分别混合，在温度为3Γ40 的条件下，震荡培养4 6h，得到不同浓度的含氟菌液；然后取每个浓度的含氟菌液，在荧光显微镜下进行荧光强度检测，利用图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x为含氟水样的氟浓度，y为含氟菌液的荧光强度；不同氟含量的水样中氟浓度分别为 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、IOmg/L、20mg/L 和 50mg/L ；五、取待测水样，加入到步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液中，在温度为3Γ40 的条件下，震荡培养4 6h，测量菌液荧光强度，利用步骤四获得的回归方程计算待测水样中的氟含量；其中待测水样的与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液的体积t匕(I 2) 1000o本实施方式的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法的优点在于，在较短时间内，通过细菌生长检测含氟水体的浓度并评价其毒性，与化学检测方法和仪器分析等传统技术相比成本低、步骤少、操作简单。本实施方式的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，利用发光细菌荧光敏感度强于传统的OD值的优点，通过荧光显微镜和图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，然后建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程，利用回归方程可快速计算出水样中氟的含量，与传统的琼脂扩散法比较，本实施方式的利用发光细菌检测水体中氟含量的方法更快捷和准确，且实验操作方便，精确度高，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，可应用于环境水质监测领域。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基的体积比为I. 5 :1000，其它步骤与参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中培养温度为37°C，培养时间为10h，其它步骤与参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一的是步骤三中步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与LB液体培养基的体积比为I :100，其它步骤与参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的是步骤四中不同氟含量的水样中的水为蒸馏水，其它步骤与参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤四中不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液的体积比为I. 5 :1000，其它步骤与参数与具体实施方式
一或五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一的是步骤四和步骤五中振荡培养的温度条件均为37°C,时间为5h,其它步骤与参数与具体实施方式
一至六之一相同。用以下试验验证本发明的有益效果实施例I、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行一、配置LB液体培养基称取Ig酵母膏，2g蛋白胨和2g NaCl，加入到IOOOmL蒸馏水中，在温度为120°C条件下，加热20min，进行灭菌，得到LB液体培养基；二、取2mL菌液浓度为109cuf/mL的0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液，加入到步骤一的LB液体培养基中，在温度为37°C的条件下，培养10h，至平台期，得到平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液；其中0P50-GFP大肠杆菌菌株购买自美国NIH资助的国际线虫种质中心(CGC)；三、将步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为1:100混合，得到检测水体中氟含量的培养菌液；四、将不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液按体积比为I. 5 1000分别混合，在温度为37°C的条件下，震荡培养5h，得到不同浓度的含氟菌液；然后取O. ImL每个浓度的含氟菌液，分别滴于载玻片上，用盖玻片平铺封盖，在型号为AxioObserverAl的zeiss突光显微镜下进行突光强度检测,利用AxioVision LE图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线如图I所示、回归方程y=_8. 6575x+994. 36 (x为含氟水样的氟浓度,y为含氟菌液的荧光强度)；其中不同氟含量的水样中水为蒸馏水，水样中氟浓度分别为O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. lmg/L、
O.5mg/L、lmg/L、5mg/L,、10mg/L、20mg/L和50mg/L,设置标准参考生活饮用水水质标准和污水排放浓度；
五、取已知氟浓度为O. 05mg/L的待测水样，将其加入到步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液中，在温度为37°C的条件下，震荡培养5h，测量菌液荧光强度，利用步骤四得到的回归方程计算待测水样中的氟含量；其中待测水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液按体积比为I. 5 1000o通过本实施例的方法，计算出待测水样的氟含量为O. 048mg/L,与实际值相差无几，准确度高。本实施例的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法的优点在于，在较短时间内，通过细菌生长检测含氟水体的浓度并评价其毒性，与化学检测方法和仪器分析等传统技术相比成本低、步骤少、操作简单。本实施例的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，利用发光细菌荧光敏感度强于传统的OD值的优点，通过荧光显微镜和图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，然后建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程，利用回归方程可快速计算出水样中氟的含量，与传统的琼脂扩散法比较，本实施例的利用发光细菌检测水体中氟含量的方法更快捷和准确，且实验操作方便，精确度高，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，可应用于环境水质监测领域。实施例2、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为O. lmg/L，其他过程及参数与实施例I相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为O. 116mg/L，与实际值相差无几，准确度高。实施例3、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为O. 5mg/L，其他过程及参数与实施例I相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为O. 485mg/L，与实际值相差无几，准确度高。实施例4、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为lmg/L，其他过程及参数与实施例I相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为I. 212mg/L，与实际值相差无几，准确度高。实施例5、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为5mg/L，其他过程及参数与试验一相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为5. 626mg/L，与实际值相差无几，准确度高。
实施例6、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为10mg/L，其他过程及参数与实施例I相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为11. 302mg/L，与实际值相差无几，准确度高。实施例7、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为20mg/L，其他过程及参数与实施例I相同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为21. 446mg/L,与实际值相差无几，准确度高。实施例8、一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法按以下步骤进行本实施例与实施例I不同的是步骤七中待测水样浓度为50mg/L，其他过程及参数与实施例I相 同。利用实施例I的回归方程，计算出待测水样的氟含量为52. 181mg/L，与实际值相差无几，准确度高。
权利要求
1.一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行 一、配置LB液体培养基； 二、将菌液浓度为IO6 109cuf/mL的0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为(Γ2)1000混合，在温度为3Γ40 的条件下，培养扩llh，至平台期，得到平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液； 三、将步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基按体积比为I :(9(Γ110)混合，得到检测水体中氟含量的培养菌液； 四、将不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液按体积比为(1 2) :1000分别混合，在温度为34 40°C的条件下，震荡培养4 6h，得到不同浓度的含氟菌液；然后取每个浓度的含氟菌液，在荧光显微镜下进行荧光强度检测，利用图像软件显微分析系统量化荧光强度以表征细菌生长状况，建立菌液荧光强度与氟含量的关系曲线和回归方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x为含氟水样的氟浓度，y为含氟菌液的荧光强度；不同氟含量的水样中氟浓度分别为 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L 和 50mg/L ； 五、取待测水样，加入到步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液中，在温度为3Γ40 的条件下，震荡培养4 6h，测量菌液荧光强度，利用步骤四获得的回归方程计算待测水样中的氟含量；其中待测水样的与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液的体积t匕(I 2) 1000o
2.权利要求I所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤二中0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与步骤一的LB液体培养基的体积比为I. 5 1000ο
3.权利要求I或2所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤二中培养温度为37°C，培养时间为IOh。
4.权利要求3所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤三中步骤二得到的平台期0P50-GFP大肠杆菌菌株菌液与LB液体培养基的体积比为I :100。
5.权利要求3所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤四中不同氟含量的水样中的水为蒸馏水。
6.权利要求3所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤四中不同氟含量的水样与步骤三得到的检测水体中氟含量的培养菌液的体积比为1.5 :1000。
7.权利要求3所述的一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，其特征在于步骤四和步骤五中振荡培养的温度条件均为37°C，时间为5h。
全文摘要
一种利用发光细菌检测水体中氟含量的方法，它涉及一种检测水体中氟含量的方法，本发明是为解决现有的检测水体中氟含量的方法存在的对设施要求高、操作复杂、成本昂贵的技术问题，该检测方法过程如下一、配置LB液体培养基；二、培养OP50-GFP大肠杆菌菌株菌液至平台期；三、在含菌液的新鲜LB液体培养基中加入不同含量的氟进行培养；四、通过荧光强度表征细菌生长状况；五、建立菌液发光强度和氟含量的关系曲线和回归方程；六、在含菌液的新鲜LB液体培养基中加入待测水样，检测其荧光强度，计算水样中的氟含量，本发明具有用时少，成本低，准确度、感度高，直观便捷，操作简单等优点，因此广泛应用于环境水质监测领域。
文档编号G01N21/64GK102914528SQ20121040063
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者侯晓丽, 王云彪, 张风君 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所