专利名称：一种适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法
技术领域：
本发明属疾病发病机制研究技术领域，具体涉及一种适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法。
背景技术：
淋巴细胞是人体的免疫细胞之一，机体免疫应答功能的重要细胞成分。在人体约占白细胞的20% -30%。根据淋巴细胞的发育部位、表面抗原、受体及功能等不同，可将淋巴细胞分为T淋巴细胞和B淋巴细胞和NK细胞等多种。成熟淋巴细胞在人体中发挥重要的免疫功能，很多疾病都与淋巴细胞数量和功能异常有关。像感染、血液病、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫性疾病、免疫缺陷等疾病都与淋巴细胞密切相关。随着科学进步，淋巴细胞与越来越的疾病的发病过程相联系。人类基因组计划的实施和推进，已使生命科学研究进入 了后基因组时代，这一转变的标志之一就是蛋白质组学的兴起。蛋白质双向电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一，尽管蛋白质组学研究的技术进展飞速，2-DE仍然是进行蛋白质样品分离的方法之一。蛋白样品的制备是2-DE的关键，也是进行蛋白质组学分析的前提。由于淋巴细胞的分离和培养中含有盐分及其它杂质，使得双向电泳结果的分辨率低，重复性差，难以获得令人满意的2-DE图谱。淋巴细胞蛋白制备已有商品化的试剂盒，但由于价格昂贵，不适用于大批量样本研究。给淋巴细胞蛋白质的进一步分析带来了困难。因此建立适用于电泳分析的淋巴细胞蛋白提取方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目是提供一种具有较高质量并适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法。本发明包括下列步骤I)处死大鼠，分离脾脏，取新鲜脾脏一个，研磨后用200目滤网过滤，4°C 9%氯化钠(生理盐水)2ml稀释，得到淋巴细胞混悬液，并移入试管，将试管倾斜45°，在淋巴细胞混悬液液面上Icm处,沿试管管壁缓慢加入淋巴细胞分离液2ml,要求淋巴细胞分离液与淋巴细胞混悬液不混合，2000rpm/min梯度离心20分钟，吸取淋巴细胞层，再2000rpm/min离心10分钟，得到沉淀的大鼠脾脏单个核细胞；2)将双蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾脏单个核细胞中，轻摇50秒，待RBC裂解后，立即加入I. 8%的氯化钠2ml (恢复等渗状态),2000rpm/min离心10分钟；3)将步骤2)重复1-2次后，生理盐水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴细胞占97%、中性粒细胞占3%的细胞团；4)在细胞团中加入4°C 5%的蔗糖2ml，混匀，2000rpm/min水平离心10分钟，移去
上清液；5)将步骤4)重复2-3次(以除去水相中的氯化钠等盐分)，显微镜下计数，将5 X IO7个淋巴细胞作为一次电泳量；6)将步骤5) —次电泳量的淋巴细胞移到研钵中，室温干燥20分钟，加入水化/裂解缓冲液100 μ I (以促进蛋白的溶解)，超声仪破碎淋巴细胞，超声的时间I秒，间隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C 15000r/min离心30分钟，留取上清液，即得到适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品。步骤6)所述的水化/裂解缓冲液为含有Tris饱和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS2%、DTT40mM、PMSF储存液100 μ M、溴酚蓝O. 002%和IPG2%缓冲液的溶液。本发明采用蔗糖法洗涤淋巴细胞，以除去水相中氯化钠等盐分，可避免盐类物质对双向电泳的影响。本发明的水化/裂解缓冲液中尿素可使蛋白质去折叠暴露疏水核心， 而配合使用硫脲会增加蛋白质的溶解性；二硫苏糖醇DTT还原二硫键，从而使蛋白质达到完全溶解的状态；IPG缓冲液能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀；PMSF可防止蛋白被降解。采用本发明制备淋巴细胞蛋白样品快速、简单易行，成本低，可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于后续进行生物质谱分析鉴定蛋白的研究，本发明可广泛应用于淋巴细胞蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。
图I为大鼠脾脏淋巴细胞蛋白样品双向电泳图谱图2为人血淋巴细胞蛋白样品双向电泳图谱其中丽为蛋白质分子量标准，单位是kDa。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V/V)。实施例I、制备大鼠脾脏淋巴细胞蛋白双向电泳样品并进行双向电泳分析I)收集哮喘大鼠脾脏淋巴细胞。处死大鼠后取脾一个，新鲜脾研磨后，用200目滤网过滤，用2ml 4°C生理盐水稀释，得到淋巴细胞混悬液，并移入试管，将试管倾斜45°，在淋巴细胞混悬液液面上Icm处，沿试管管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(相对密度
I.080) 2ml (要求淋巴细胞分离液与淋巴细胞混悬液不混合)，2000rpm/min梯度离心20分钟，吸取淋巴细胞层；再2000rpm/min离心10分钟,得到沉淀的大鼠脾脏单个核细胞；2)将双蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾脏单个核细胞中，轻摇50秒，待RBC裂解后，立即加入I. 8%的氯化钠2ml, 2000rpm/min离心10分钟；3)将步骤2)重复1-2次后，生理盐水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴细胞占97%、中性粒细胞占3%的细胞团；4)在细胞团中加入4°C 5%的蔗糖2ml，混匀，2000rpm/min水平离心10分钟，移去
上清液；5)将步骤4)重复2-3次，显微镜下计数，将5X107个淋巴细胞作为一次电泳量；6)将步骤5) —次电泳量的淋巴细胞移到研钵中，室温干燥20分钟，加入水化/裂解缓冲液100μ 1，促进蛋白的溶解，超声仪破碎淋巴细胞，超声的时间I秒，间隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C15000r/min离心30分钟，留取上清液，即得到适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品；7)将步骤6)得到的大鼠脾脏淋巴细胞蛋白溶解于水化/裂解缓冲液后，离心留取上清液，得到大鼠脾脏淋巴细胞蛋白双向电泳样品液；所述的水化/裂解缓冲液水化/裂解缓冲液为含有Tris饱和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS 2%, DTT40mM、PMSF储存液100 μ M、溴酚蓝O. 002%和IPG2%缓冲液的溶液；8)通过上述过程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度,结果表明上述得到的用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品中，蛋白浓度为3-4ug/uL ；9)按照如下方法进行双向电泳利用Ettan IPGphor I I Isoelectric FocusingSyStem(通用电气医疗集团，USA)在20°C进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件为在20°C以设定程序进行等电聚焦电泳，设定最大电压8000伏，电流50 μ A/gel，时间10. 5h。实际总电压时间积为42，000Vh。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条(IPG胶条)，在IOmL 平衡缓冲液 I (50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，pH8. 8 ；6mol/L urea ;30%甘油，O. 02g/mL SDS,O. 01g/mL 二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在IOml平衡缓冲液2 (50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8. 8 ；6mol/Lurea ;30%甘油，O. 02g/mL SDS,O. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡 15min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上，第二向电泳利用Ettan DALTsix system(通用电气医疗集团，USA)在12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行，恒流进行电泳，电流IOmA/胶，电压300伏，时间O. 5h，电流20mA/胶，电压300伏，时间12h，待溴酚蓝到达凝胶前沿到约O. 5cm时，终止电泳。凝胶采用硝酸银染色法，结果如图I所示，结果表明淋巴细胞蛋白样品分离效果良好，没有发生明显的蛋白降解。实施例2、制备人血淋巴细胞蛋白样品并进行双向电泳分析
I)采取人血2ml，EDTA抗凝；2)用2ml生理盐水稀释，经4ml淋巴细胞分离液(相对密度I. 077)梯度离心，分离人血淋巴细胞；3)经低渗裂解红细胞，反复洗涤去除血小板，吸取单个核细胞层，4°C，2000rpm/min，离心5分钟，用4°C生理盐水洗3遍后，移去上清液；4)加入4°C 5%的蔗糖2ml，混匀震荡30秒，2000rpm/min水平离心10分钟，移去上清液，反复2-3次；显微镜下计数，5 X IO7个淋巴细胞为一次电泳量进行分装；5)细胞团转移到研钵中室温干燥20分钟,加入水化/裂解液100 μ I促进蛋白的溶解；6)超声仪破碎细胞。超声时间I秒间隔I秒，功率8 9W至溶液清亮，4° C离心(15000r/min,30分)，留取上清液，即得到适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品；7)将步骤6)得到的人血淋巴细胞蛋白溶解于水化/裂解缓冲液后，离心，留取上清液，得到人血淋巴细胞蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有Tris饱和酚40mM，Urea 7M, Thiourea 2M, CHAPS 2%, DTT 40mM, PMSF 储存液 100 μ M，0· 002%溴酚蓝和 2%IPG缓冲液的溶液；8)通过上述过程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度,结果表明上述得到的用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品中，蛋白浓度为3-4ug/uL ；9)按照如下方法进行双向电泳利用Ettan IPGphor I I Isoelectric FocusingSystem(通用电气医疗集团，USA)在20°C进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件为在200C以设定程序进行等电聚焦电泳，设定最大电压5000伏，电流50 μ A/gel，时间10. 5h。实际总电压时间积为42，OOOVh0然后将聚焦后的固定pH梯度胶条(IPG胶条)在IOmL平衡缓冲液 l(50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，ρΗ8· 8 ;6mol/L urea ;30% 甘油，O. 02g/mL SDS,0. 01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在IOml平衡缓冲液2 (50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8. 8 ；6mol/Lurea ;30%甘油，0. 02g/mL SDS,O. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡15min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上，第二向电泳利用Ettan DALTsix system(通用电气医疗集团,USA)在 12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行，恒流进行电泳，电流IOmA/胶，电压300伏，时间O. 5h，电流20mA/胶，电压300伏，时间12h，待溴酚蓝到达凝胶前沿到约O. 5cm时，终止电泳。凝胶采用硝酸银染色法，结果如图2所示，结果表明淋巴细胞蛋白样品分离效果良好，没有发生明显的蛋白降解。
权利要求
1.一种适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤 1)处死大鼠，分离脾脏，取新鲜脾脏一个，研磨后用200目滤网过滤，4°C9%氯化钠2ml稀释，得到淋巴细胞混悬液，并移入试管，将试管倾斜45°，在淋巴细胞混悬液液面上Icm处，沿试管管壁缓慢加入淋巴细胞分离液2ml，要求淋巴细胞分离液与淋巴细胞混悬液不混合,2000rpm/min梯度离心20分钟，吸取淋巴细胞层，再2000rpm/min离心10分钟,得到沉淀的大鼠脾脏单个核细胞； 2)将双蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾脏单个核细胞中，轻摇50秒，待RBC裂解后，立即加A I. 8%的氯化钠2ml, 2000rpm/min离心10分钟； 3)将步骤2)重复1-2次后，生理盐水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴细胞占97%、中性粒细胞占3%的细胞团； 4)在细胞团中加入4°C5 %的蔗糖2ml，混匀，2000rpm/min水平离心10分钟，移去上 清液； 5)将步骤4)重复2-3次，显微镜下计数，将5X107个淋巴细胞作为一次电泳量； 6)将步骤5)—次电泳量的淋巴细胞移到研钵中，室温干燥20分钟，加入水化/裂解缓冲液100 u 1，超声仪破碎淋巴细胞，超声的时间I秒，间隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C 15000r/min离心30分钟，留取上清液，即得到适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品。
2.按权利要求I所述的适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法，其特征在于步骤6)所述的水化/裂解缓冲液为含有Tris饱和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS 2%,DTMOmM、PMSF储存液lOOyM、溴酚蓝0. 002%和IPG 2%缓冲液的溶液。
全文摘要
一种适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品制备方法属疾病发病机制研究技术领域，本发明包括下列步骤取新鲜大鼠脾脏研磨，200目过滤，加4℃氯化钠2ml，入试管，再加淋巴细胞分离液2ml，离心，得单个核细胞；加双蒸水2ml，使RBC快速裂解，再加1.8％氯化钠2ml，恢复等渗状态，4℃生理盐水洗涤细胞后，去上清；加4℃5％的蔗糖2ml混匀，离心、去上清；细胞团室温干燥，加水化/裂解缓冲液，促进蛋白的溶解，超声破碎细胞，取上清，即得适用于双向电泳的淋巴细胞蛋白样品。采用本发明制备淋巴细胞蛋白样品快速、简单，成本低，可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，且便于后续进行生物质谱分析鉴定蛋白研究，可广泛应用于淋巴细胞蛋白质组学研究。
文档编号G01N1/28GK102967496SQ20121049606
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者李善玉, 钱东华, 张海玉, 张影, 金美玉, 曹肖琲, 张文娟 申请人:吉林大学