专利名称：鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法
鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法技术领域
本发明属于分析化学领域，更具体涉及鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法。
背景技术：
四环素类药物为并四苯衍生物，具有十二氢化并四苯基本结构，该类药物有共同 的四个环的母核，其中尤以土霉素、四环素、金霉素的抗菌谱最广，对革兰氏阳性菌、阴性菌均具有较强的抗菌作用。四环素类药物可在动物体内残留，并随 鱼类、乳制品、蛋等食品进入人体，危害人体健康，具体表现为对人的肺、胃肠、肾脏、皮肤和 骨骼造成损害，尤其是对儿童的牙齿损害最大。
四环素类(TCs)药物作为一种可治疗动物疾病的药物或饲料添加剂被广泛使用， 用于防治肠道感染和促进生长，容易诱导耐药菌株和导致食品残留。研究发现该类药物具 有致突变性和潜在的致癌性，被许多国家列为限量药物。为此，世界各国针对进出口动物 组织及相关产品中四环素类残留量作出了明确的最高残留限量规定，以保障公众健康。
近年来，日本、澳大利亚等对畜、禽肉中抗生素残留问题进行了大量研究，日本厚生省要求进口畜禽肉中四环素族残留量不得超过O. 05mg/kg。澳大利亚规定 四环素类总量不得大于O. 3mg/kg。欧盟一律标准为0.01mg/kg。我国早在1991年就出台 国标对蜂蜜中四环素类的最高残留量进行规定不得大于O. 05mg/kg，也针对它们在畜禽 肉及水产品中的最高允许残留量进行规定。
鉴于上述原因，有必要研究掌握四环素类药物残留检测的有效检测方法，达到有 效监控其在环境中残留，减少对于人类危害的目的。现阶段对于四环素类药物残留的检测 方法多样，但都包含了样品前处理过程。前处理方法多为使用提取剂多次提取或有机溶剂 萃取，之后使用层析柱或者具有吸附性填料的柱子进行清洗。此类前处理技术的关键缺点 是提取过程繁琐、处理过程耗时较长。发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单有效的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前 处理方法。
本发明的一种鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法，包括以下步骤(1)称取样品5.00 g，精确至O. 01 g，置于50mL离心管中；(2)加入柠檬酸缓冲溶液20mL，混匀，10000转/分钟离心10分钟；(3)准确吸取上清液10mL于离心管中，备用；(4)C18固相萃取柱的活化过程如下a.5mL甲醇淋洗，b.5mL柠檬酸缓冲溶液除杂，c.5mL蒸馏水平衡；(5)将步骤(3)中的上清液过柱，先用2mL柠檬酸缓冲溶液淋洗，弃去全部淋洗液；(6)再用O.8ml甲醇，以l-3mL/min的流速洗脱，收集洗脱液；(I)往洗脱液中加入O.1mol/mL乙酸铵缓冲溶液定容至lmL，然后用O. 22mm微孔滤膜 过滤，所得滤液即可上机检测；上述柠檬酸缓冲溶液的PH = 3. 5±0.05。
所述柠檬酸缓冲溶液的配制为称取4. 20g柠檬酸，用蒸馏水溶解，定容至200mL ； 称取2. 84g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解，定容至IOOmL ;取160mL柠檬酸溶液与IOOmL磷酸 氢二钠溶液混合，用盐酸调节PH = 3. 5±0. 05制备缓冲溶液，称取9. 68g乙二胺四乙酸二 钠放入上述缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。
所述乙酸铵缓冲溶液的配制为称取O. 385g乙酸铵，加入ImL甲酸溶液，用蒸馏水 溶解，定容至500mL。
所述四环素类药物包括土霉素、四环素、金霉素、强力霉素。
本发明的前处理方法与现有方法相比，具有操作简单有效、成本低、重现性好等优 点，具有很强的可操作性，经该方法处理后的待测样品能够直接用液相色谱-串联质谱法 进行检测。
本发明的显著优点为1)目前报导的大部分四环素类药物提取方法是针对动物源性食品中设计，而本方法 是针对鳗鱼中四环素类药物残留检测的一种提取方法；2)目前报导的大部分提取剂均为EDTA-Mcllvainc缓冲溶液，而本方法采用 EDTA-Mcllvainc缓冲溶液的特定PH值，使四环素类药物残留能够得到充分的提取，从而能 够有效的检测四环素类药物残留；3)国标方法用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液(PH=4.O)冰水浴超声提取三次；而本方法用 EDTA-Mcllvainc缓冲溶液(PH=3. 5)室温下提取一次，从而节省了提取时间。
4)国标方法用HLB固相萃取柱来提取四环素类药物，洗脱液氮吹浓缩至干；而在 本发明中用C18固相萃取柱来提取四环素类药物，洗脱液直接上机检测。
具体实施方式
按照本发明的发明内容实施本发明，所需试剂溶液的配制方法如下 EDTA-Mcllvainc缓冲溶液4. 20g柠檬酸于200mL蒸馏水中+ 2. 84g磷酸氢二钠于IOOmL 蒸馏水中充分溶解后，取将160mL柠檬酸溶液与IOOmL磷酸氢二钠溶液混合，调节PH = 3. 5±0. 05，加入9. 68gEDTA;乙酸铵缓冲溶液0. 385g乙酸铵+ImL甲酸，用蒸馏水定容 至500mL ;标准储备液分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素各10mg，用甲醇定溶于 IOOml棕色容量瓶中，制成lOOmg/mL的标准储备液；混合标准工作液用甲醇稀释标准储 备液，配制成土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为5mg/mL的混合标准溶液；定量曲线用 甲醇配制定量曲线标液，各个组分的浓度O. 05mg /mL、0.1mg /mL、0. 15 mg/mL、0. 2mg /mL、 0. 25mg/mL ;基质混合校准曲线分别取浓度为5mg/mL的混合标准溶液10mL、20mL、30mL、 40mL、50mL的标准溶液对空白样品进行洗脱过柱，过滤得基质混合校准溶液。本方法对空白 鳗鱼样品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的测定下限为10.0 mg/kg,达到国内外检测 四环素类抗生素的残留的标准。
实施例1(1)称取5.00 g(精确至O. 01 g)样品于50 mL离心管中；(2)往上述离心管中加入提取剂(EDTA-Mcllvainc缓冲溶液)20ml；(3)尚心管加盖振荡I分钟,在10000转/分钟尚心10分钟；(4)准确吸取上清液IOml于离心管中，备用；(5)固相萃取柱(SPE小柱C18-200mg/3mL)活化过程a.5ml甲醇活化b.5ml提取剂活化c.5ml蒸馏水活化(6)将4步骤中的上清液过柱,l-3ml/min；(7)准确吸取2ml提取剂洗脱C18固相萃取柱；(8)准备吸取O.8ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；(9)往洗脱液中加入O.2ml IOmmoI/L乙酸铵缓冲溶液定容至1ml，洗脱液用O. 22mm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机检测。
本发明的提取方法较EDTA-MclIvainc缓冲溶液(PH=4. O)提取检测的四环素类药物回收率高(见表1)，说明本发明使四环素类药物残留能够得到充分的提取，从而能够有效的检测四环素类药物残留。且本发明重复性好(见表2)，具有很强的可操作性。
表1:EDTA_MclIvainc缓冲溶液PH3. 5与PH4. O的回收率比较
权利要求
1.一种鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法，其特征在于所述的前处理方法包括以下步骤(1)称取样品5.00 g，精确至O. 01 g，置于50mL离心管中；(2)加入柠檬酸缓冲溶液20mL，混匀，10000转/分钟离心10分钟；(3)准确吸取上清液10mL于离心管中，备用；(4)C18固相萃取柱的活化过程如下a.5mL甲醇淋洗，b.5mL柠檬酸缓冲溶液除杂，c.5mL蒸馏水平衡；(5)将步骤(3)中的上清液过柱，先用2mL柠檬酸缓冲溶液淋洗，弃去全部淋洗液；(6)再用O.8ml甲醇，以l-3mL/min的流速洗脱，收集洗脱液；(7)往洗脱液中加入O.1mol/mL乙酸铵缓冲溶液定容至lmL，然后用O. 22mm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机检测；上述柠檬酸缓冲溶液的PH = 3. 5±0.05。
2.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法，其特征在于所述柠檬酸缓冲溶液的配制为称取4. 20g柠檬酸，用蒸馏水溶解，定容至200mL ;称取2.84g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解，定容至IOOmL ;取160mL柠檬酸溶液与IOOmL磷酸氢二钠溶液混合，用盐酸调节PH = 3. 5±0. 05制备缓冲溶液，称取9. 68g乙二胺四乙酸二钠放入上述缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。
3.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法，其特征在于 所述乙酸铵缓冲溶液的配制为称取O. 385g乙酸铵，加入ImL甲酸溶液，用蒸馏水溶解，定容至500mL。
4.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法，其特征在于 所述四环素类药物包括土霉素、四环素、金霉素、强力霉素。
全文摘要
本发明提供了鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法,属于分析化学领域。该方法包括待测样品的称量、pH=3.5±0.05柠檬酸缓冲溶液的提取、固相萃取柱的活化、固相萃取柱的洗脱等操作。本发明操作简单有效，制备出的样品溶液可以直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。该前处理方法与现有方法相比,具有操作简单有效、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性，有望在商检及出入境检验检疫等行业大规模推广应用，具有显著的经济效益。
文档编号G01N30/06GK102998159SQ201210552028
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者邱彬, 周平, 林振宇, 郭隆华, 陈国南 申请人:福州大学