利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种在使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中容易地设定用于去除噪声的基准的结构。本发明的对样本溶液中的发光粒子的光进行检测的光分析技术的特征在于，通过变更显微镜的光学系统的光路，生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测出的来自光检测区域的光的时序光强度数据，在时序光强度数据中个别地检测发光粒子的信号。在发光粒子的信号的检测中，抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以信号的强度为变量而强度为该变量以上的信号的发生频率的累加值的分布。
【专利说明】利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
【背景技术】
[0002]由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
[0003]特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十yL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量。)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
[0004]专利文献1:日本特开2005-098876
[0005]专利文献2:日本特开2008-292371
[0006]专利文献3:日本特开2009-281831
[0007]专利文献4:日本专利第4023523号
[0008]专利文献5:国际公开2008-080417
[0009]专利文献6:日本特开2007-20565
[0010]专利文献7:日本特开2008-116440
[0011]专利文献8:日本特开平4-337446号公报
[0012]非专利文献1:金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年
[0013]非专利文献2:F.J.Meyer-Alms,突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 编,Springer,柏林,2000 年,204-224 页
[0014]非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页
[0015]非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))
【发明内容】
[0016]发明要解决的问题
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性的处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6?8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于InM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。
[0018]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μ L左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
[0019]在上述的扫描分子计数法中，在一边在样本溶液内移动光检测区域的位置一边测量出的光强度值(或者光子计数值)的按时间序列的数据中观测到相当于来自发光粒子的光的光强度的增大(典型的是吊钟状的轮廓)时，判断为一个发光粒子包含在光检测区域内，由此进行一个发光粒子存在的检测。在该结构中，在实际的按时间序列的光强度数据中，除了存在来自发光粒子的光以外，还存在噪声(光检测器的热噪声、背景光)，因此需要去除噪声来检测表示来自发光粒子的光的信号(发光粒子的信号)的存在。因此，典型的是，参照发光粒子的信号的特性、例如强度的大小、信号的形状等尝试抽出发光粒子的信号。关于该点，发光粒子的信号的特性、噪声的大小或形状根据测量条件(装置和光学系统的调整状态、环境温度、发光粒子的发光特性、样本溶液的状态)的不同而不同，并且从发光粒子的信号中去除噪声的明确的基准并不是显而易见的。因而，典型的是，按每个测量条件针对包含作为观测对象的发光粒子或与其同等的粒子的对称溶液(正控制)和不包含作为观测对象的发光粒子或与其同等的粒子的对称溶液(负控制)获取时序光强度数据，将在这些时序光强度数据中观测到的光强度值进行比较并且通过反复试验进行用于去除噪声的基准的设定。然而，用于去除噪声的基准的设定中的反复试验对于分析的实施者来说是繁杂且需要时间和劳力的作业。
[0020]这样，本发明的一个课题在于提出一种在如上所述的扫描分子计数法中容易地设定用于去除噪声且检测发光粒子的信号的基准或指标的新方法。
[0021]关于该点，本发明的发明人发现了如下情况:根据通过扫描分子计数法在某测量条件下使用任意的样本溶液得到的时序光强度数据中的光强度的发生频率的分布(更详细地说，以在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量，具有该变量以上的强度的信号的发生频率的累加值分布)，能够去除噪声信号而容易地决定用于检测发光粒子的信号的基准。
[0022]如后面更详细地记述的那样，从“扫描分子计数法”利用的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的焦点区域、即“光检测区域”中的单个发光粒子释放并到达检测器的光的强度根据发光粒子在光检测区域内的位置的不同而不同，典型的是，在发光粒子的位置处于光检测区域的大致中心区域时光强度最大(以下将光检测区域内的发光粒子的光强度最大的位置称为“最大强度点”。)，发光粒子的位置越靠近光检测区域的周边，光强度越是逐渐下降。即，在光检测区域内从发光粒子释放并被检测的光强度的分布为具有强度从最大强度点朝向周边下降的大致吊钟状的轮廓的分布。而且，认为发光粒子在包含光检测区域的样本溶液中大致均匀地分散，因此发光粒子的信号的光强度的发生频率的分布由从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布、即从光检测区域到达光检测器的光的强度分布决定。另一方面，噪声随机地产生，噪声的强度分布对于从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布没有依赖性。因而，能够认为在时序光强度数据中的光强度的发生频率的分布中，提供与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布对应的成分的信号是“发光粒子的信号”，提供除此以外的成分的信号是“噪声”。这样，能够以在时序光强度数据上检测出的信号是否为与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布对应的成分为基准，在去除噪声信号的状态下检测发光粒子的信号。
[0023]在本发明中，利用上述的知识，提出了在扫描分子计数法中在去除了噪声信号的状态下容易地决定用于检测发光粒子的信号的基准的结构。
[0024]用于解决问题的方案
[0025]根据本发明的一个方式，通过下述装置来达成上述课题，该装置是使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光的光分析装置，该光分析装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中个别地检测来自各个发光粒子的信号，其中，信号处理部从在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为发光粒子的信号，由此检测来自各个发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的信号的发生频率的累加值的分布。在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，如果是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地由物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子是没有照明光而发光的情况下，例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
[0026]如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。因而，在逐次检测出的光中个别地检测来自发光粒子的光的信号，由此逐个地个别且逐次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。此时，在本发明中，根据上面记述的知识、即通过参照时序光强度数据中的光强度的发生频率的分布容易检测去除了噪声信号后的发光粒子的信号的知识，根据“信号发生频率累加值分布”、即以在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量、具有该变量以上的强度的信号的发生频率的累加值分布，设定应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围。然后，从在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中去除噪声并抽出具有上述光强度范围内的光强度的信号，由此检测出来自各个发光粒子的信号。
[0027]此外，如从后面的【具体实施方式】一栏的说明中理解的那样，认为能够根据信号发生频率累加值分布来估计针对光检测区域内的位置的从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度的分布，发光粒子的信号的强度按照从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度的分布。因而，应该作为上述的发光粒子的信号抽出的信号的光强度范围可以优选为根据信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的信号的强度的分布与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布实质一致的光强度范围。(在此，“实质一致”的意思是允许在被容许的误差范围内的偏差。)
[0028]另外，如已经记述的那样，典型的是，认为从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布是发光粒子的位置从最大强度点起越向光检测区域的周边靠近光强度越下降的具有吊钟状的轮廓的分布，发光粒子的信号的强度的分布也具有相同的吊钟状的轮廓。(特别地，发光粒子是通过被照射激励光而释放光的粒子，在通过激励光的聚光区域划定光检测区域的情况下，从光检测区域中的发光粒子释放并被检测的光的强度分布与光检测区域内的激励光的强度分布一致。)。而且，能够实际观测到的发光粒子的信号的强度大于噪声的强度(在发光粒子的信号的强度分布的吊钟状的轮廓被埋没于噪声强度的情况下，原本就无法观测到发光粒子的信号。)。这样，在上述的本发明的结构中，也可以形成为信号处理部将根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围的边界设定为阈值，抽出强度超过该阈值的按时间序列的光强度数据上的信号作为发光粒子的信号。所述的阈值可以优选被设定为按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限值。
[0029]在上述的本发明的装置中的应该作为发光粒子的信号抽出的信号的光强度范围的设定中，更详细地说，例如可以在决定了根据信号发生频率累加值分布而决定的、针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布之后，使高斯函数、洛伦兹函数等吊钟型函数与针对所述光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布拟合。在此，“光检测区域内的位置的函数值”例如可以是光检测区域内的从最大强度点起的半径或其函数值(如后述的【具体实施方式】一栏中说明的那样，以按时间序列的光强度数据上的信号的强度为变量而强度为该变量以上的发光粒子的信号的发生频率的累加值能够表示为光检测区域内的位置、例如从最大强度点起的半径的函数。)。如已经提及的那样，从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布具有吊钟状的轮廓，能够利用吊钟型函数良好地进行拟合。因而，在信号的强度分布中，利用吊钟型函数进行的拟合中拟合误差大的部位或区域被认为噪声的影响大，这样，应该作为发光粒子的信号抽出的信号的光强度范围能够参照上述的拟合误差并根据所述的误差进行设定。
[0030]另外，如从后面的【具体实施方式】一栏的说明中理解的那样，当参照根据信号发生频率累加值分布而决定的、针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布的形状或者信号发生频率累加值分布自身的形状时，也能够判断这些分布的形状中的、与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布的吊钟状的轮廓存在偏差的区域。因而，应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围也可以根据基于信号发生频率累加值分布而决定的、针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布的形状或者根据信号发生频率累加值分布自身的形状进行设定。并且，根据基于信号发生频率累加值分布而决定的、针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布中的针对位置的函数值的信号的强度的斜率，也能够判断基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布中的、与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布的吊钟状的轮廓存在偏差的区域。因而，应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围也可以根据基于信号发生频率累加值分布而决定的、针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布中的针对位置的函数值的信号的强度的斜率来设定。
[0031]并且，在上述的本发明的装置中，为使装置的使用者能够容易地掌握信号发生频率累加值分布和/或根据信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布，信号处理部可以具有显示部，该显示部能够显示根据信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布和/或信号发生频率累加值分布。而且，可以由装置的使用者在显示部中显示的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布或信号发生频率累加值分布上，设定应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围。根据所述结构，装置的使用者能够在视觉上确认并设定强度范围。该强度范围是应该设定为要作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围，因此光强度范围设定的操作变得容易，是有利的。
[0032]在上述的本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够得到与样本溶液中的同定的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比、或者相对于成为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比，或者使用相对于成为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来决定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法例如以规定的速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体地估算发光粒子的数密度或浓度。
[0033]关于上述的本发明的结构中的光检测区域的位置的移动，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解的那样，从发光粒子检测出的光的形态能够根据其特性或样本溶液中的数密度或浓度而改变。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。
[0034]并且，关于上述的光检测区域的位置的移动，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所引起的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明中，光检测区域对从一个发光粒子发出的光进行检测来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测到(表示该发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性(特别是扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。
[0035]可以通过任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-miiror)变更光路，来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路来使光检测区域的位置移动，由此光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在(没有伪像(artifact)的状态且)稳定的状态下进行光的测量(例如在使样本发生流动的情况下，难以始终赋予一样的流速，并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增力口，并且由于流动所造成的流体动力的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能发生改质或改性。)。而且，不需要使样本溶液流通的结构，因此能够与FCS、FIDA等情况同样地以微量(I?几十μ L左右)的样本溶液进行测量和分析。
[0036]在上述的本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测并个别地检测来自各个发光粒子的信号这种特征性的光分析技术的处理通过通用的计算机也能够实现。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于使计算机执行以下步骤:通过变更光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；在光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程中检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及在按时间序列的光强度数据中个别地检测来自各个发光粒子的信号，从在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为发光粒子的信号，由此检测来自各个发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的信号的发生频率的累加值的分布。
[0037]在所述的计算机程序中也可以包括以下步骤:对个别地检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数，来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。另外，在移动光检测区域的位置的步骤中，可以以规定的速度或比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动光检测区域的位置，可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度设定光检测区域的位置的移动速度。光检测区域的位置的移动轨迹能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。而且，在上述的计算机程序中也可以使根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围是根据信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的信号的强度的分布与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布实质一致的光强度范围，优选的是，在个别地检测来自各个发光粒子的信号的步骤中，强度超过根据信号发生频率累加值分布而决定的阈值的按时间序列的光强度数据上的信号作为发光粒子的信号被抽出，或者在个别地检测来自各个发光粒子的信号的步骤中，根据信号发生频率累加值分布决定按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限。
[0038]另外，在上述的计算机程序中，应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围可以根据使吊钟型函数与基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布拟合时的拟合误差、根据基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布的形状或信号发生频率累加值分布的形状、或者根据基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布中的针对位置的函数值的上述信号的强度的斜率来进行设定。并且，上述的计算机程序可以包括如下步骤:将根据信号发生频率累加值分布而决定的针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布和/或上述信号发生频率累加值分布显示在显示装置上，可以在个别地检测来自各个发光粒子的信号的步骤中，能够在显示装置上所显示的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布或信号发生频率累加值分布上设定应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围。
[0039]并且，根据上述的本发明的装置或计算机程序，是一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测各个发光粒子的光的光分析方法，该光分析方法是通过参照信号发生频率累加值分布来实现执行发光粒子的信号的检测的新方法。因而，根据本发明，提供一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程:通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测量来自光检测区域的光的强度，生成按时间序列的光强度数据；以及在按时间序列的光强度数据上个别地检测表示发光粒子的光的信号，其中，在个别地检测表示发光粒子的光的信号的过程中，从在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为发光粒子的信号，由此检测来自各个发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的信号的发生频率的累加值的分布。
[0040]在上述的方法中也可以包括以下步骤:对来自个别地检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来对在移动光检测区域的位置的过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数，决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。另外，可以在变更光学系统的光路以使光检测区域的位置移动的步骤中，以规定的速度或比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动光检测区域的位置，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择光检测区域的位置的移动轨迹即可。而且，在上述的方法中，根据信号发生频率累加值分布设定的光强度范围也可以是根据信号发生频率累加值分布决定的针对光检测区域内的位置的信号的强度的分布与从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度分布实质一致的光强度范围，优选的是，也可以在个别地检测来自发光粒子的信号的步骤中，抽出强度超过根据信号发生频率累加值分布决定的阈值的按时间序列的光强度数据上的信号作为发光粒子的信号，或者在个别地检测来自发光粒子的信号的步骤中，根据信号发生频率累加值分布决定上述按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限。
[0041]另外，在上述的方法中也是，应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围可以根据使吊钟型函数与基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布拟合时的拟合误差、根据基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布的形状或信号发生频率累加值分布的形状、或者根据基于信号发生频率累加值分布而决定的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布中的针对位置的函数值的上述信号的强度的斜率来进行设定。并且，在根据信号发生频率累加值分布而决定的针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布和/或上述信号发生频率累加值分布显示在任意的显示装置上的情况下，在个别地检测来自发光粒子的信号的步骤中，可以能够在显示装置上所显示的针对光检测区域内的位置的函数值的信号的强度的分布或信号发生频率累加值分布上设定应该作为发光粒子的信号抽出的按时间序列的光强度数据上的信号的光强度范围。
[0042]上述的本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解这种情况也属于本发明的范围。
[0043]发明的效果
[0044]总的来说，在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中利用通过参照时序光强度数据上的信号的发生频率的分布(信号发生频率累加值分布)能够容易地决定噪声的强度范围的知识，大幅地降低了从时序光强度数据中抽出发光粒子的信号所需要的劳力和时间。特别地，对于根据信号发生频率累加值分布而决定的应该作为发光粒子的信号抽出的信号的光强度范围，在理论上，针对亮度相同的发光粒子(在某同一发光条件下发光强度实质相等的发光粒子)是不变的，因此在通过扫描分子计数法对亮度相同的发光粒子的各种样本溶液进行的测量中，只要装置的设定条件等测量条件不变，则针对某一个样本溶液决定的上述光强度范围在针对其它的样本溶液的测量中也能够利用，这样，能够减少用于决定用于检测去除了噪声信号的发光粒子的信号的基准的反复试验。而且，由于迅速地去除噪声，因此扩大了扫描分子计数法可利用的样本溶液的范围，从而能够期待扩大分子间相互作用的观测以及分析等扫描分子计数法的应用范围。
[0045]本发明的其它目的和优点将通过以下的本发明的优选实施方式的说明变得清楚。【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1的(A)是执行本发明的光分析技术的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向来使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。
[0047]图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的光分析技术的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是从显微镜的光的行进方向观察到的光检测区域的截面的示意图，图2的(D)是在(C)的情况下测量到的按时间序列的光强度数据的例子的示意图。图2的(E)是表示针对光检测区域的从最大强度点Imax起的放射方向位置r的发光粒子的信号的强度分布(粗实线)的图。叠加地示意性地示出了噪声信号(虚线)存在时的实际的信号的强度分布(细实线)。
[0048]图3的(A)、(B)是以流程图的形式表示按照本发明的方法执行的扫描分子计数法的处理步骤的图。
[0049]图4的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明按照扫描分子计数法用于根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程例的图。
[0050]图5示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
[0051]图6的(A)是针 对时序光强度数据中的具有光强度(光子计数)I以上的强度的信号数Pd)的平方根p1/2绘制光强度I得到的图。图中还描绘了针对绘制点的拟合曲线。图6的⑶是针对信号数P(I)的平方根P1/2绘制光强度I的绘制点的拟合曲线的误差R2的图，该光强度I是针对图6的(A)中的具有光强度(光子计数)1以上的强度的信号数Pd)的平方根P的光强度I。
[0052]图7的(A)是针对包含各种浓度的发光粒子的样本溶液的、作为通过按照本发明的光分析技术执行的扫描分子计数法(实施例1)测量出的发光粒子的信号而被检测出的脉冲数的图表。用于抽出发光粒子的信号的阈值根据信号发生频率累加值分布而设定为2。图中的实线表示通过最小平方法对针对发光粒子浓度的脉冲数进行近似的近似直线。图7的(B)是将阈值设定为I-3时针对所设定的阈值绘制针对发光粒子浓度的脉冲数的近似直线的斜率(?)和相关系数(口)的图。
[0053]图8是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中所得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，㈧是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，⑶是样本内的粒子的浓度相比于⑷的情况大幅降低的情况。
[0054]附图标记说明
[0055]1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ;4:准直透镜；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光透镜(condenser lens) ；13:针孔；14:屏蔽滤波器；15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
【具体实施方式】
[0056]下面，详细说明本发明的优选实施方式。
[0057]光分析装置的结构
[0058]本发明的光分析技术能够通过如下的光分析装置来实现:在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照图1的(A)，光分析装置I由光学系统2-17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9上排列有注入了 I μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有荧光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光透镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自焦点面以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL?IOfL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度为以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是以光强度为Ι/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光经过分色镜14a后透过屏蔽滤波器14(在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16，在被转换成按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自单个发光粒子的光、例如来自一个或多个荧光色素分子的微弱光。在通过光子计数进行光的检测的情况下，以在规定时间内每个规定的单位时间(BINTIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。
[0059]另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即，光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所期望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此夕卜，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路来使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体动力的作用，能够排除力学作用对观测对象物的影响，实现稳定的测量。
[0060]此外，作为追加的结构，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更所观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。
[0061]在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2?5。并且，可以在光分析装置I中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据波长分别检测来自它们的光。
[0062]本发明的方法的原理
[0063]如“
【发明内容】
” 一栏所记载的那样，在本发明的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则在扫描分子计数法中，尝试参照时序光强度数据中的光强度的发生频率的分布(信号发生频率累加值分布)来去除噪声，从而容易地决定用于检测发光粒子的信号的基准。下面针对本发明的扫描分子计数法和噪声去除的原理进行说明。
[0064]1.扫描分子计数法的原理
[0065]FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图8的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在测量荧光强度的过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，则例如图8的(B)所描绘的那样在发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以估算出高精度的光强度的波动。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。
[0066]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。
[0067]作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如图2的(A)示意性地描述的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0?t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，通过对其个数进行计数，能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
[0068]2.使用了信号发生频率累加值分布的用于抽出发光粒子的信号的光强度范围的决定
[0069]如已经记述过的那样，在通过上述扫描分子计数法由光检测器16随时间的经过获取到的光强度的数据(时序光强度数据)上除了发光粒子的信号以外，还存在光检测器的热噪声、背景光等所引起的噪声。因而，在检测发光粒子的信号时，需要用于从时序光强度数据中抽出发光粒子的信号的处理。作为发光粒子的信号的抽出处理，典型的是进行如下处理:参照时序光强度数据上的信号的强度，抽出具有进入规定的强度范围内的强度的信号、更具体地说抽出具有规定的阈值以上的或超过该阈值的强度的信号作为发光粒子的信号。然而，以往没有发现在去除了噪声的状态下抽出发光粒子的信号的明确的基准，因而，通过反复试验或装置的使用者的经验等决定上述的规定的强度范围或阈值，该情形需要用于检测发光粒子的信号的劳力、时间、或者也可能成为发光粒子的信号的检测结果的精度变差的主要原因。
[0070]关于该点，如已经提及的那样，本发明的发明人等发现当参照时序光强度数据上的信号发生频率累加值分布时，能够分别估计发光粒子的信号的强度范围和噪声的强度范围，根据信号发生频率累加值分布容易地决定用于抽出发光粒子的信号的上述规定的光强度范围或阈值。下面，针对用于使用时序光强度数据的信号发生频率累加值分布抽出发光粒子的信号的光强度范围的决定原理进行说明。
[0071]参照图2的(C)-(E)，在光检测区域CV中，从通过此处的发光粒子释放并到达光检测器的光的强度根据光检测区域CV中的发光粒子的位置的不同而不同，即使是亮度相同的发光粒子(在同一条件下的观测中发光强度实质上相等的发光粒子)，根据发光粒子在光检测区域内的通过位置的不同，所检测出的光强度不同。例如，在某发光粒子是被照射照明光而发光的粒子的情况下，典型地说，照明光在光检测区域内的光强度在光检测区域(聚光区域)的大致中心处最大，从所述的最大强度点向大致放射方向降低。因而，来自发光粒子的光的强度在发光粒子横穿光检测区域的大致中心时最大，发光粒子的位置越向光检测区域的周边靠近，光强度越是逐渐降低。即，在用距最大强度点的放射方向距离(半径r)表示光检测区域内的位置时，从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度的分布如图2的(E)中用粗实线所例示的那样相对于从最大强度点起的半径r成为吊钟状的分布。例如，即使图2的(C)中的发光粒子α、β、Y是相同的亮度的粒子，根据各发光粒子通过的路径的不同，所检测出的光强度也互不相同，在图中，通过光检测区域的大致中心的发光粒子β的光强度高于发光粒子a、y的光强度(参照图2的(D))。
[0072]在从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度的分布具有如图2的(E)中粗实线那样的轮廓时，发光粒子大致均匀地分散在样本溶液中，因而，认为距最大强度点的放射方向距离越大，通过光检测区域的发光粒子的个数越多，因此针对在光检测区域的移动过程中包含在光检测区域内而被检测出的发光粒子的信号的强度的频率分布，与如图2的(E)中粗实线那样从光检测区域内的发光粒子释放并被检测的光的强度的分布对应，成为光强度(图2的(E)的纵轴)越大、频率(横轴)越小的分布。
[0073]更具体地说，首先，在能够通过洛伦兹函数对如图2的(E)中粗实线所例示的那样从光检测区域内的发光粒子释放并被检测到的光的强度分布进行近似的情况下，对于从分布的最大强度点Imax起的半径r处的光强度I，使用光强度分布的最大值Imax (Imax相当于单个发光粒子的最大光强度。)、分布的半值半宽W、强度的背景Ibg,通过下式给出。
[0074][式1]
【权利要求】
1.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光的光分析装置，该光分析装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中个别地检测来自各个上述发光粒子的信号， 其中，上述信号处理部从在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为上述发光粒子的信号，由此检测来自各个上述发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的上述信号的发生频率的累加值的分布。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部抽出强度超过根据上述信号发生频率累加值分布而决定的阈值的、上述按时间序列的光强度数据上的信号作为上述发光粒子的信号。
3..据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 根据上述信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围是根据上述信号发生频率累加值分布而决定的针对上述 光检测区域内的位置的信号的强度分布与从上述光检测区域内的发光粒子释放并被检测到的光的强度分布实质一致的光强度范围。
4.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部能够根据上述信号发生频率累加值分布来决定上述按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限。
5.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部具有显示部，该显示部能够显示根据上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布和/或上述信号发生频率累加值分布。
6.根据权利要求5所述的光分析装置，其特征在于， 上述光分析装置的使用者能够在上述显示部中显示的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布或上述信号发生频率累加值分布上，设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
7.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 能够根据使吊钟型函数与基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布拟合时的拟合误差，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
8.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 能够根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布的形状或根据上述信号发生频率累加值分布的形状，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
9.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 能够根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布中的针对上述位置的函数值的上述信号的强度的斜率，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部根据检测出的上述发光粒子的个数来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
12.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析方法，该光分析方法的特征在于，包括以下过程: 通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域的光的强度，生成按时间序列的光强度数据；以及 在上述按时间序列的光强度数据上个别地检测表示发光粒子的光的信号， 其中，在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，从在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为上述发光粒子的信号，由此检测来自各个上述发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的上述信号的发生频率的累加值的分布。
13.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，抽出强度超过根据上述信号发生频率累加值分布而决定的阈值的、上述按时间序列的光强度数据上的信号作为上述发光粒子的信号。
14.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 根据上述信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围是根据上述信号发生频率累加值分布而决定的针对上述光检测区域内的位置的信号的强度分布与从上述光检测区域内的发光粒子释放并被检测到的光的强度分布实质一致的光强度范围。
15.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，根据上述信号发生频率累加值分布来决定上述按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限。
16.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，在显示装置上显示的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布或上述信号发生频率累加值分布上，设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
17.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，根据使吊钟型函数与基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布拟合时的拟合误差，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
18.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布的形状或根据上述信号发生频率累加值分布的形状，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
19.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在个别地检测表示上述发光粒子的光的信号的过程中，根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布中的针对上述位置的函数值的上述信号的强度的斜率，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
20.根据权利要求12-19中的任一项所述的光分析方法,其特征在于， 使上述光检测区域的位置以比上述样本溶液中的发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
21.根据权利要求12-20中的任一项所述的光分析方法,其特征在于， 还包括以下过程:根据检测出的上述发光粒子的个数来决定该发光粒子的数密度或浓度。
22.一种用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光的光分析用计算机程序，该光分析用计算机程序的特征在于使计算机执行以下步骤: 通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 在上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动的过程中检测来自上述光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及 在上述按时间序列的光强度数据中个别地检测来自各个发光粒子的信号，其中，从在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的群中抽出光强度处于根据信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围内的信号作为上述发光粒子的信号，由此检测来自各个上述发光粒子的信号，该信号发生频率累加值分布是以在上述按时间序列的光强度数据中检测出的信号的强度为变量而强度为该变量以上的上述信号的发生频率的累加值的分布。
23.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 在个别地检测来自各个上述发光粒子的信号的步骤中，抽出强度超过根据上述信号发生频率累加值分布而决定的阈值的、上述按时间序列的光强度数据上的信号作为上述发光粒子的信号。
24.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于，根据上述信号发生频率累加值分布而设定的光强度范围是根据上述信号发生频率累加值分布而决定的针对上述光检测区域内的位置的信号的强度分布与从上述光检测区域内的发光粒子释放并被检测到的光的强度分布实质一致的光强度范围。
25.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 在个别地检测来自各个上述发光粒子的信号的步骤中，根据上述信号发生频率累加值分布来决定上述按时间序列的光强度数据中的噪声强度的上限。
26.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:在显示装置上显示根据上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布和/或上述信号发生频率累加值分布。
27.根据权利要求26所述的计算机程序，其特征在于， 在个别地检测来自各个上述发光粒子的信号的步骤中，在上述显示装置上显示的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布或上述信号发生频率累加值分布上，设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
28.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 根据使吊钟型函数与基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布拟合时的拟合误差，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
29.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布的形状或根据上述信号发生频率累加值分布的形状，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
30.根据权利要求22所述的计算机程序，其特征在于， 根据基于上述信号发生频率累加值分布而决定的、针对上述光检测区域内的位置的函数值的上述信号的强度的分布中的针对上述位置的函数值的上述信号的强度的斜率，来设定应该作为上述发光粒子的信号抽出的上述按时间序列的光强度数据上的信号的上述光强度范围。
31.根据权利要求22-30中的任一项所述的计算机程序，其特征在于， 在使上述光学系统的光检测区域的位置移动的步骤中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
32.根据权利要求22-31中的任一项所述的计算机程序，其特征在于， 还包括以下步骤:根据上述检测出的发光粒子的个数来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
【文档编号】G01N21/64GK103460026SQ201280016619
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月26日 优先权日:2011年3月29日
【发明者】叶梨拓哉, 山口光城, 田边哲也 申请人:奥林巴斯株式会社