专利名称：观测单个发光粒子的偏振特性的光分析装置、光分析方法以及用于该方法的光分析用计 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及如下一种光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序:能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的技术。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发出光的粒子以及附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是通过照射激励光而发出的萤光、磷光等。
背景技术：
由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或萤光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在萤光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的萤光强度，根据由测量得到的该萤光强度的自相关函数的值所决定的在微小区域内的萤光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，获取萤光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在萤光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的萤光分子等的萤光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算萤光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。并且，在FIDA中还能够通过偏振光成分将所检测的荧光分开来以两个通道进行解析，由此求出作为对象的分子的偏振特性(Fluorescence IntensityDistribution Analysis-Polarization:FIDA_P0)(非专利文献 5)。在 FIDA-P0 中，分别生成突光的P偏振光成分(水平偏振光成分)和s偏振光成分(垂直偏振光成分)的强度的直方图，根据通过使统计性的模型公式拟合这些直方图的分布而计算出的荧光分子等的各偏振光成分的强度的平均值来估算荧光分子等的偏振度。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的萤光信号的时间经过来检测萤光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的萤光微粒子或固定在基板上的萤光微粒子的微弱光，来检测流中或基板上的萤光微粒子的存在。特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的萤光测量技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十UL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，期待成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。专利文献1:日本特开2005-098876专利文献2:日本特开2008-292371专利文献3:日本特开2009-281831专利文献4:专利第4023523号专利文献5:国际公开2008-080417专利文献6:日本特开2007-20565专利文献7:日本特开2008-116440专利文献8:日本特开平4-337446号公报報非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 编，Springer,柏林，2000 年，204-224 页非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))非专利文献5:卡斯柯(Kask)及其他6名，生物物理杂志，2000年，78卷，1703页(P.Kask, K.Palo, N.Fay, L.Brand, U.Mets, D.Ullmann, and J.Jungmann:Biophys.J.78，1703(2000))
发明内容
发明要解决的问题在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光分析技术中，所计量的光是从萤光单分子或多分子发出的光，在该光的解析中执行按时间序列测量出的萤光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的萤光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个萤光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个萤光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对萤光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的萤光分子等的浓度或数密度需要是在平衡状态下在一次的秒级长度的计量时间内能够进行统计性的处理的个数的萤光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的萤光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的萤光分子等的浓度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在萤光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6 8所记载的萤光分子等的检测方法中，不包括萤光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的萤光分子等小于InM也能够对萤光分子等进行检测，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的萤光分子等的浓度或数密度。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含有在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需的样本可以是微量的(例如几十μ L左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，定量地检测其浓度、数密度或其它特性。本发明的主要课题在于，为了进一步扩展在上述的日本特愿2010-044714以及PCT/JP2011/53481中提出的新的光分析技术，而特别提出一种能够利用所述新的光分析技术在测量来自发光粒子的光时测量光的特定的偏振光成分并针对每个粒子分析发光粒子的偏振特性的光分析装置、光分析方法以及用于该方法的光分析用计算机程序。用于解决问题的方案根据本发明，通过以下的装置达成上述的课题，该装置是一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其通过变更显微镜的光学系统的光路，使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光照射部，其向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光；光检测部，其检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及信号处理部，其在一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的光的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个发光粒子的信号，根据检测出的所述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算发光粒子的偏振特性值。在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型的是萤光性粒子，但也可以是通过照射激励光而发光的其它粒子(磷光性粒子等)。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供激励光的情况下，相当于该激励光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。)。另外，可以使用偏振光分束器、偏振板等抽出来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分。“偏振特性值”可以是表示发光粒子的偏振特性的任意的指标值、典型地是偏振度，但也可以是根据其它任意的至少一个偏振光成分的强度所获得的任意的值、例如S偏振光成分或P偏振光成分的强度、它们的强度比、荧光或磷光的各向异性等。“由预先决定的偏振光成分构成的激励光”典型地是实质向一个方向偏振的光，但是依赖于实验条件、作为观测对象的发光粒子的特性，也可以选择包含多个方向的偏振光成分的光、无偏振的光、圆偏振光、椭圆偏振光。此外，在本说明书中，在称为“信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。在上述本发明的装置中，与扫描分子计数法同样地在基本的结构中，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行激励光的照射以及来自光检测区域的光的检测。这样，在移动的光检测区域包含随机运动的发光粒子时，检测来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。在所述结构中，本发明向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光作为激励光，并且测量来自光检测区域的光中的至少一个偏振光成分的强度，根据测量出的所述至少一个偏振光成分的强度计算发光粒子的偏振特性值。根据所述结构，如果发光粒子进入光检测区域的路径，则能够个别观测其偏振特性，因此不需要FIDA-PO等光分析技术中的用于计算荧光强度的波动的统计性的处理，即使在样本溶液中的发光粒子浓度低于通过FIDA-PO等获得良好的测量结果所需要的水平的情况下，也能够观测发光粒子的偏振特性，在这一点上是有利的。在实施方式中，作为由上述的装置检测出的发光粒子的光的至少一个偏振光成分，典型地说可以是通过偏振光分束器等对从光检测区域到来的光进行分割所得到的s偏振光成分和P偏振光成分，可以根据分别测量出的(发光粒子的光的信号的)s偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度来估算偏振特性值。特别地说，估算偏振特性值时所使用的信号的强度可以是发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的峰值、发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值、或者拟合发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值等。此外，在分别检测从光检测区域到来的光的S偏振光成分和P偏振光成分的情况下，有时由于光学系统内的各元件的透射率或反射率根据偏振方向而不同和/或检测光的装置(光检测器)的灵敏度根据偏振方向而不同，而S偏振光成分的检测灵敏度和P偏振光成分的检测灵敏度不同。因此，上述的本发明的装置在一个方式中可以构成为在光检测部分别测量来自光检测区域的光中的S偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度的情况下，信号处理部使用对S偏振光成分的强度的检测灵敏度与P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据发光粒子的光的信号的s偏振光成分的强度的检测值和P偏振光成分的强度的检测值来估算偏振特性值。根据所述的方式，能够获得对在装置内的S偏振光成分的强度的检测灵敏度与P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正后的偏振特性值。关于上述的本发明的结构中的光检测区域的位置的移动，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度，适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解的那样，从发光粒子检测出的光的形态能够根据其特性或样本溶液中的数密度或浓度而变化。特别当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子所能得到的光量降低，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度，使得能够高精度或高灵敏度地计量来自一个发光粒子的光。并且，关于上述的光检测区域的位置的移动，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动引起的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的装置中，对从光检测区域所包含的一个发光粒子发出的光进行检测来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测出(表示其存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子与一个信号相对应。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性适当地变更光检测区域的移动速度。可以通过任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜变更光路来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动，由此由于光检测区域的移动迅速并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到动力作用的影响，能够在(没有伪像的状态且)稳定的状态下进行光的计量(例如在使样本发生流动的情况下难以始终赋以一样的流速，并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加，并且由于流动所造成的流体动力的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能变质或改性。)。而且，不需要使样本溶液流通的结构，因此能够与FCS等的情况同样地以微量(IyL 几十μ L左右)的样本溶液进行计量和分析。另外，在实施方式中，本发明的光分析装置可以对信号处理部个别检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中所检测出的发光粒子的个数进行计数。由此，能够与偏振特性值同时地获取与发光粒子的数密度或浓度有关的信息。通过通用的计算机也能够实现上述的本发明的装置中的以一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行各个发光粒子的光的检测并估算发光粒子的偏振特性值为特征的光分析技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种计算机程序，是用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析用计算机程序，其特征在于，使计算机执行以下步骤:变更光学系统的光路以使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及在检测出的光的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个发光粒子的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度，来估算发光粒子的偏振特性值。在所述的计算机程序中，偏振特性值也可以是表示发光粒子的偏振特性的任意的指标值、例如偏振度、S偏振光成分或P偏振光成分的强度、它们的强度比、荧光或磷光的各向异性等。另外，在检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，可以分别测量来自光检测区域的光中的S偏振光成分和P偏振光成分的强度，在估算发光粒子的偏振特性值的步骤中，可以根据发光粒子的光的信号的S偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度来估算偏振特性值。估算偏振特性值时所使用的信号的强度可以是发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的峰值、发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值、或者拟合发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值等，在检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中分别测量出来自光检测区域的光中的S偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度的情况下，在估算发光粒子的偏振特性值的步骤中，可以使用对S偏振光成分的强度的检测灵敏度与P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据发光粒子的光的信号的S偏振光成分的强度的检测值和P偏振光成分的强度的检测值来估算偏振特性值。并且，在上述的计算机程序中，可以包括以下步骤:对来自个别检测出的发光粒子的光信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置移动过程中所检测出的发光粒子的个数进行计数的步骤和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度的步骤。另外，在变更光学系统的光路以使光检测区域的位置移动的步骤中，可以使光检测区域的位置以规定的速度移动、或者以比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。并且，根据上述的本发明的装置或计算机程序，实现如下的新的光分析方法:一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测各个发光粒子的光，并估算发光粒子的偏振特性值。因而，根据本发明，提供一种方法，是使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析方法，其特征在于，包括以下步骤:通过变更显微镜的光学系统的光路，使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及在检测出的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个发光粒子的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算发光粒子的偏振特性值。在上述的方法中也可以使用偏振光分束器实现来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的抽出，偏振特性值也可以是表不发光粒子的偏振特性的任意的指标值、例如偏振度、S偏振光成分或P偏振光成分的强度、它们的强度比、荧光或磷光的各向异性等。另夕卜，在检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，分别测量来自光检测区域的光中的S偏振光成分和P偏振光成分的强度，在估算发光粒子的偏振特性值的步骤中，可以根据发光粒子的光的信号的S偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度来估算偏振特性值。估算偏振特性值时所使用的信号的强度可以是发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的峰值、发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值、或者拟合发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值等，另外，在检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中分别测量来自光检测区域的光中的S偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度的情况下，在估算发光粒子的偏振特性值的步骤中，可以使用对S偏振光成分的强度的检测灵敏度与P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据发光粒子的光的信号的S偏振光成分的强度的检测值和P偏振光成分的强度的检测值来估算偏振特性值。并且，在上述的方法中也可以包括以下步骤:对来自个别检测出的发光粒子的光信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中所检测出的发光粒子的个数进行计数的步骤和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度的步骤。并且，在变更光学系统的光路以使光检测区域的位置移动的步骤中，可以使光检测区域的位置以规定的速度移动、或者以比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。应该理解为本发明的用于观测发光粒子的偏振特性的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态,这样的情况也属于本发明的范围。发明的效果总之，根据本发明，通过在共焦显微镜或多光子显微镜下利用其光检测区域在样本溶液中进行扫描，来个别检测发光粒子的存在，并且能够观测该发光粒子的偏振特性。而且，发光粒子的偏振特性是反映粒子的构造、大小以及形状的值，通过利用本发明进行的观测，能够进行粒子的同定、检测粒子的构造、大小、形状、以及它们的变化、或者对粒子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象进行检测和分析。上述的本发明中的偏振特性的观测基于新的原理，具有与FIDA-PO不同的特征。在FIDA-PO中，按每个偏振光成分计量在样本溶液中分散且随机运动的多个发光粒子的光，生成强度的直方图，使逻辑公式拟合该直方图来计算每个偏振光成分的强度的平均值，之后计算偏振特性值。因而，在样本溶液中存在种类不同的发光粒子的情况下，运算处理变得复杂，因此在例如对作为观测对象的粒子附加发光探针、通过FIDA-PO对所述粒子进行测量的情况下，可能需要用于去除未与观测对象粒子结合的发光探针的细化处理。另外，如已经记述过的那样，为了通过FIDA-PO以良好的精度运算荧光强度的平均值，需要样本溶液中的发光粒子浓度是在测量时间中始终存在一个以上的发光粒子的水平。与此相对地，根据本发明，能够个别地检测发光粒子的偏振光成分来计算偏振特性值。因而，能够以良好的精度执行测量的样本溶液中的发光粒子浓度也可以大幅地低于FIDA-PO的情况，并且在根据信号的特性等区分发光粒子的种类的情况下，在样本溶液中是否存在种类不同的发光粒子不怎么影响偏振特性值的计算的难易度，因此能够得到在针对附加有发光探针的粒子进行测量的情况下也不必须去除发光探针这样的优点。另外，在本发明中，由于个别地检测发光粒子，因此即使是在样本溶液中浓度相对较低且其光在以前的方法中埋没于来自其它的发光粒子的光的发光粒子，也能够检测出，能够观测其偏振特性。本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清
λ.Μ
/E.ο
图1的(A)是实现本发明的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图2的㈧、⑶分别是说明构成本发明的一部分的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所计量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是示意性地表示从发光粒子释放的偏振光成分的模型图，图2的(D)是各偏振光成分的光强度的时间变化的示意图。图3是以流程图的形式表示依照本发明执行的扩散系数测量的处理过程的图。图4的(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动的方式的模型图，图4的(C)表示在如图4的(B)那样设定了光检测区域的移动速度的情况下的、表示来自一个发光粒子的光的信号(光子计数)的时间变化的例子。图5的(A)是说明用于依照扫描分子计数法根据所计量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。图5的(B)示出所计量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。图6是相对于依照本发明所检测出的各个发光粒子的s偏振光成分强度Is绘制相对应的发光粒子的P偏振光成分强度Ip得到的图。(A)是使用TAMRA作为发光粒子的情况，(B)是使用通过SYTOX Orange染色得到的质粒作为发光粒子的情况。图7是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中所得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的计量精度的程度的情况，⑶是样本内的粒子的浓度相比于⑷的情况大幅降低的情况。附图标记说明1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ；4:准直透镜；4a:激励光偏振元件；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜(condenser lens) ；13:针孔；14a:偏振光分束器；14s、P:屏障滤波器(barrier filter) ； 15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ;16s、P:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
具体实施例方式以下，详细说明本发明的优选实施方式。光分析装置的结构本发明的光分析技术能够通过如下的光分析装置来实现:该光分析装置是在基本结构中如图1的(A)示意性地例示那样组合能够执行FIDA-PO的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成的。参照图1的(A)，光分析装置I由光学系统2 17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，在偏振元件4a中调整成为预先决定的偏振方向的光之后(在此，典型地说是P偏振光和s偏振光中的某一方透过。)，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9,该微板9上排列有注入了 I μ L 几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有萤光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，遮断来自焦点面以外的光。图1的⑶所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL IOfL左右的有效体积的该光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度成为以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是将光强度为l/e2的面作为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光在偏振光分束器14a中被分割为s偏振光成分和P偏振光成分，使它们分别透过屏障滤波器14s、14p (在此只选择特定波长频带的光成分。)，导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16s、16p。在光检测器16s、16p中，分别将依次到来的光转换成按时间序列的电信号后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16s、16p，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个萤光色素分子的微弱光。这样，通过上述的结构，按各偏振方向计量来自发光粒子的光的强度。另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所期望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16s、16p所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动路径(可以设为在计算机18的程序中能够选择各种移动图案。)。此夕卜，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体动力的作用，能够排除动力作用对观测对象物的影响，实现稳定的计量。此外，作为追加的结构，也可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置17a，以变更所观察的皿10。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置I中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。本发明的原理如“发明内容” 一栏所记载的那样，根据本发明的光分析技术，如果清楚地进行描述则如下，即，“扫描分子计数法” 一边使共焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测在样本溶液中分散的发光粒子被包含在光检测区域内时所释放出的光，从而个别地检测发光粒子的存在，在该“扫描分子计数法”中，计量发光粒子的光的至少一个偏振光成分，确定发光粒子的偏振特性。根据所述的结构，个别地检测样本溶液中的各个发光粒子并观测其偏振特性，因此即使在样本溶液中的发光粒子浓度低于能够通过需要用于计算荧光波动的大小的统计性处理的FIDA-PO良好地进行测量的浓度的情况下，也能够测量发光粒子的偏振特性。下面，针对本发明的偏振特性的测量原理进行说明。1.扫描分子计数法的原理FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据萤光强度的波动来估算发光粒子的特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图7的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度是在计量萤光强度的过程中始终在光检测区域CV内存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。在发光粒子的浓度或数密度更低的情况下，例如图7的(B)所描绘的那样，在发光粒子只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在计量时间的一部分内出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精度地估算出光强度的波动。另外，在与计量中始终在光检测区域内存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，并且为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而计量时间变长。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使在发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下也能够检测发光粒子的特性。作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如在图1的(C)中示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0 t2)，在通过存在一个发光粒子的区域(tl)时，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，能够获取与发光粒子的特性有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如萤光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的特性有关的信息。2.本发明的发光粒子的偏振特性的原理在本发明中，特别是在上述扫描分子计数法中，如与图1关联地进行说明的那样，将来自发光粒子的光分割成偏振光成分，分别测量所述偏振光成分的强度，由此进行发光粒子的偏振特性的检测。在所述偏振特性的检测中，典型地说，如图2的(C)示意性地描述的那样，对发光粒子提供向某方向偏振的光作为激励光Ex，分别分开地检测从该发光粒子释放的光的s偏振光成分和P偏振光成分。然后，使用检测出的各偏振光成分的强度、例如信号的积分值(图2的(D)中斜线区域的面积值)或峰值强度(信号的最大值)，计算表示偏振特性的指标值、例如偏振度P。从吸收了激励光Ex的发光粒子释放的光Em由于各种原因、例如因旋转布朗运动而引起的粒子的自转、激励能量移动等而其偏振方向与激励光Ex不同，因此根据表示所述的偏振特性的指标值，来获取发光粒子的旋转布朗运动的速度、有无激励能量移动等的信息，进一步根据这些信息，能够获得粒子的大小、构造、分子间相互作用(结合/离解)等信息。特别地，应该理解到如下一点:在扫描分子计数法中，由于对来自通过光检测区域的单一的发光粒子的光进行测量，因此关于偏振特性值，也能够个别计算单个发光粒子的值。因而，即使使用发光粒子浓度比在FIDA-PO中得到良好的统计性的运算结果所需要的浓度低的样本溶液，也能够获取偏振特性值，能够获得粒子的大小、构造、分子间相互作用等的信息。此外，可以任意地决定提供包含哪种偏振光成分的光来作为激励光并且检测哪种偏振光成分作为检测光。上述的图1的(A)的装置或与图2的(C)相关联的说明的例子构成为向光检测区域照射向一个方向偏振的成分、例如P偏振光成分来作为激励光，将来自光检测区域的光分开为P偏振光成分和S偏振光成分进行检测。然而，也可以例如设为提供没有偏振的光作为激励光，只检测s偏振光和P偏振光中的某一方、或者将S偏振光和P偏振光双方分开进行检测(在发光粒子的旋转布朗运动比较慢而在一个发光粒子的信号中发光粒子的朝向几乎没有变化的情况下或者能够检测出变化的情况下，能够通过上述的结构观测发光粒子的朝向、旋转布朗运动的速度。)。除此以外，在各种方式中，可以对激励光的偏振光设定、检测光的偏振光设定进行选择，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。处理操作讨稈在使用图1的㈧所例示的光分析装置I的本发明的发光粒子的偏振特性的观测方法的实施方式中，具体地说，执行以下的过程，(I)包含发光粒子的样本溶液的调制过程，
(2)样本溶液的光强度的测量处理过程，以及(3)测量出的光强度的分析处理过程。图3示出用流程图的形式表示的本实施方式中的处理过程。(I)调制样本溶液在本发明中，作为观测对象的粒子只要是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型的是水溶液，但并不限于此，也可以是有机溶剂之类的其它任意的液体。)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自发光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了发光标识(萤光分子、磷光分子)的粒子。(2)测量样本溶液的光强度
在本实施方式的扫描分子计数法的光强度的测量处理过程中，一边驱动反射镜偏转器17进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)，一边进行光强度的测量(图3的步骤100)。在操作处理中，典型的是在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(为了使光检测区域的位置在样本溶液内移动而变更光路的过程、向光检测区域照射激励光的过程以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的过程)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射和光强度的计量。在开始计量时，首先在计算机18依照程序进行的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7 (检电镜)来执行光检测区域的位置在皿10内的移动，与此同时，光检测器16s、16p分别将依次检测出的光转换为电信号后发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。典型的是光检测器16s、16p是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此，光的检测是以在规定时间内每隔规定的单位时间(BIN TIME),例如每隔10 μ s依次计量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，按时间序列的光强度的数据可以是按时间序列的光子计数数据。关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，为了定量地高精度地根据计量出的按时间序列的光强度数据个别检测发光粒子，优选的是将光强度的计量过程中的光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。在光检测区 域的位置的移动速度比粒子的因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此，光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是如图4的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域CV，由此，在按时间序列的光强度数据中，与各个粒子对应的光强度的变化的曲线是与图4的(C)所例示的那样的激励光强度分布大致相同的吊钟状，将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动而进行的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间△ τ根据以下的平均平方位移的关系式，(2r)2=6DX Λ τ …(I)成为Λ τ =(2r)2/6D…(2)因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为Vdif=2r/ Δ τ =3D/r...(3)。因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为比其充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D=2.0X l(rlclm2/s左右的情况下，在设r为0.62 μ m左右时，Vdif为1.0X 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的曲线为预想的曲线(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。(3)分析光强度在通过上述的处理得到样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序进行的处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测、偏振特性值的计算。(i)检测与发光粒子对应的信号在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的曲线(参照图4的(C))。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的曲线的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即I=AX exp (_2t2/a2)...(4),在使式(4)拟合有意义的光强度的曲线(能够明确地判断为不是背景的曲线)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的曲线判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异 物的信号，可以在其后的分析等中忽略。)。作为根据时序光强度数据进行发光粒子的统一检测的处理方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图5的(A)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3的步骤110、图5的(A)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、ΒΙΝ ΜΕ，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图5的(A)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值的变化时刻的值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。然后，在时序光强度数据上，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，依次参照时间微分值来搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。在确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图5的(A)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过了光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的曲线的参数所设想的范围内、即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图5的(B)的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图5的(B)的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。可以在s偏振光成分和P偏振光成分各自的时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130 150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。另外，在本实施方式的情况下，能够期待一个发光粒子的光出现在s偏振光成分和P偏振光成分这两个时序光强度数据中。因而，能够在S偏振光成分和P偏振光成分的时序光强度数据中逐个地确定各发光粒子的信号。可以通过参照脉冲存在区域的时间值进行S偏振光成分的时序光强度数据上的信号与P偏振光成分的时序光强度数据上的信号之间的对应。此外，根据时序光强度数据个别检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。(ii)计算发光粒子的偏振特性值(图3的步骤170)这样，当在s偏振光成分和P偏振光成分各自的时序光强度数据中检测发光粒子的信号时，针对每个发光粒子，使用S偏振光成分和P偏振光成分的光强度计算偏振特性值。作为S偏振光成分和P偏振光成分的光强度Is、Ip，例如可以采用在步骤130 160中检测出的发光粒子的信号的峰值强度、光子计数的累积值、或者拟合的吊钟型函数的时间积分值(图2的(D)的斜线区域的面积)。另外，作为偏振特性值，典型地说可以使用偏振度P、即P= (Ip-1s) / (Ip+Is)…(5)。此外，也可以是除此以外的表示偏振特性的指标值、例如s偏振光成分或P偏振光成分或者某特定方向的偏振光 成分的光强度值自身、s偏振光成分和P偏振光成分的光强度比Ip/Is、荧光(或磷光)的各向异性等。另外，也可以使用检测出的发光粒子的S偏振光成分的光强度Is的平均值和P偏振光成分的光强度Ip的平均值来计算偏振特性值。另外，在图1的(A)的装置中的s偏振光成分和P偏振光成分的光的测量中，存在s偏振光成分的检测灵敏度和P偏振光成分的检测灵敏度不同的情况。例如存在光学系统内的各元件的透射率或反射率根据偏振方向的不同而不同的情况，并且由于存在光检测器16s、16p的灵敏度也不同的情况，因此即使从发光粒子释放出在各偏振方向上强度相同的光，s偏振光成分的强度的检测值和P偏振光成分的强度的检测值也有可能不同。因此，优选的是在计算偏振特性值的情况下，可以实施对s偏振光成分的检测灵敏度与P偏振光成分的检测灵敏度之间的偏差进行校正的处理。在进行所述的校正处理的情况下，例如可以通过下述的式子计算上述偏振度P。[数I]
PpIc-1P = ——...(()
tls)C+1在此,C是校正值,是来自发光粒子的光的P偏振光成分和s偏振光成分的强度相等时的强度检测值Iso与强度检测值Ipo之比Iso/Ipo (相当于s偏振光成分的检测灵敏度与P偏振光成分的检测灵敏度之比。)。如果将关于单个发光粒子的值代入式￠)中的(Ip/Is)的值，则计算出该发光粒子的偏振度，如果代入多个发光粒子的、例如检测出的所有发光粒子的强度的总和或平均值，则计算出它们的平均的偏振度。能够如下这样计算出校正值C，例如针对偏振度已知的荧光色素执行上述的光的测量以及发光粒子的信号的检测(步骤100 160)，在估算出各个发光粒子的P偏振光成分强度Ip和s偏振光成分强度Is之后，使用它们的强度比(Ip/Is)的平均值(Ip/IS)av和已知的偏振度Pk，通过[数2]
C=1+pk...( 7 )HP] (1 — pk)来计算。另外，也可以利用作为激励光而使用无偏振的光所计量的强度检测值Iso与强度检测值Ipo之比来确定校正值C。这样，根据上述的本发明的光分析技术，在通过光检测区域对样本溶液中进行扫描来个别检测发光粒子的扫描分子计数法中，能够观测发光粒子的偏振特性。如已经记述的那样，偏振特性是反映粒子的大小、形状的物理量，因此根据本发明，通过对任意想要观测的粒子附加发光标识而形成发光粒子，观测所述发光粒子的偏振特性，能够得到想要观测的粒子的大小、构造或它们的变化、或者与各种分子间相互作用有关的信息。特别是在本发明中，由于个别地检测单个发光粒子的偏振特性，因此期待能够在样本溶液中观测数密度少的发光粒子的偏振特 性。为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于例示本发明的有效性，而并不是限定本发明的范围。实施例1通过本发明验证了能够观测发光粒子的偏振特性。作为发光粒子，使用作为荧光色素的TAMRA和通过作为荧光色素嵌入剂(intercalator)的SYTOX Orange染色后的质粒,观测了这些发光粒子的偏振特性。作为样本溶液，调制出包含IOpM的TAMRA的溶液(TAMRA溶液)和将质粒(pBR322、Takara Bio株式会社、Cat.N0.3035)以其浓度为IOpM的方式溶解于包含IOnM的SYTOX Orange (Invitrogen公司、Cat.N0.S-11368)的磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中所得到的溶液(质粒溶液)。此外，SYTOX Orange是与DNA(质粒)结合时荧光强度增大大约500倍的荧光色素。在光的测量中，作为光分析装置，使用具备共焦点萤光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子萤光测量装置MF20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)测量样本溶液的光强度”中说明的方式，针对上述样本溶液同时且分开地获取s偏振光成分和P偏振光成分的时序光强度数据(光子计数数据)。这时，针对TAMRA溶液和质粒溶液这两种溶液，激励光使用543nm的激光,使用带通滤波器检测出560nm-620nm的波长频带的光。另外，激励光的偏振方向设定为与检测光的P偏振光成分相同的方向。将样本溶液中的光检测区域的移动速度设定为15mm/秒，将BIN ΜΕ设为IOy秒，将测量时间设为2秒钟。在测量光强度之后，依照上述的“(3) (i)检测与发光粒子对应的信号”所记载的处理过程，对针对各样本溶液的各偏振光成分获取到的时序光强度数据实施平滑处理，在平滑后的数据中，确定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只将满足下述的条件的脉冲信号判定为与发光粒子对应的信号，20 μ s〈脉冲宽度〈400 μ s峰值强度>1.0 [pc/10 μ s]…(A)相关系数>0.95，另一方面，将不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略。图6的㈧和⑶分别表示相对于针对TAMRA溶液和质粒溶液检测出的各个发光粒子的信号的s偏振光成分强度Is绘制所对应的信号的P偏振光成分强度Ip得到的图(强度Is、Ip分别设为拟合发光粒子的信号所得到的吊钟型函数的时间积分值。)。参照该图，P偏振光成分强度Ip相对于S偏振光成分强度Is的曲线大致分布在直线上,在TAMRA溶液中，P偏振光成分强度Ip与s偏振光成分强度Is之比Ip/Is的平均值(Ip/Is) av[P偏振光成分强度Ip相对于s偏振光成分强度Is的曲线的斜率]为1.314，在质粒溶液中，(Ip/Is)av是2.902。该 情况暗示了按照本发明检测出的偏振光成分的强度比(偏振特性值的一个例子)是粒子所固有的值，表示发光粒子的偏振特性。并且，已知荧光色素TAMRA的偏振度P是0.034，因此使用所述的偏振度P和根据针对上述TAMRA溶液的测量结果估算出的(Ip/Is)av(=1.314)，通过式⑶估算出式(7)中的校正值C为C=0.815。使用该校正值C，根据基于针对质粒溶液的测量结果估算出的(Ip/Is)av(=2.902)通过式(7)估算出的质粒的偏振度P是0.406。这样，如从上述的实施例的结果所理解的那样，根据上述的本发明的光分析技术，在扫描分子计数法中观测发光粒子的偏振特性。特别地，本发明的光分析技术构成为个别检测单个发光粒子的偏振光成分来估算偏振特性值，因此根据本发明，即使样本溶液中的发光粒子浓度低于FCS、FIDA-PO等光分析技术所要求的浓度区域，也能够观测发光粒子的偏振特性，所述特征在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下是有利的。
权利要求
1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光照射部，其向上述光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及 信号处理部，其在一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的光的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个上述发光粒子的光的信号，根据检测出的上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算上述发光粒子的偏振特性值。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测部分别测量来自上述光检测区域的光中的s偏振光成分和P偏振光成分的强度，根据上述发光粒子的光的信号的上述s偏振光成分的强度和上述P偏振光成分的强度估算上述偏振特性值。
3.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 使用偏振光分束器从来自上述光检测区域的光中抽出来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分。
4.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述偏振特性值是偏振度 。
5.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测部分别测量来自上述光检测区域的光中的s偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度，上述信号处理部使用对上述S偏振光成分的强度的检测灵敏度与上述P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据上述发光粒子的光的信号的上述S偏振光成分的强度的检测值和上述P偏振光成分的强度的检测值来估算上述偏振特性值。
6.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用拟合上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值。
7.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值。
8.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部对个别检测出的上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
9.根据权利要求1 8中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述光检测区域移动部以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动上述光检测区域的位置。
10.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析方法的特征在于，包括以下步骤: 通过变更上述光学系统的光路使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 向上述光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及 在检测出的上述光的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个上述发光粒子的光的信号，根据检测出的上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算上述发光粒子的偏振特性值。
11.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 在检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，分别测量来自上述光检测区域的光中的S偏振光成分和P偏振光成分的强度，在估算上述发光粒子的偏振特性值的步骤中，根据上述发光粒子的光的信号的上述s偏振光成分的强度和上述P偏振光成分的强度来估算上述偏振特性值。
12.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 使用偏振光分束器从来自上述光检测区域的光中抽出来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分。
13.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 上述偏振特性值是偏振度。
14.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 在检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，分别测量来自上述光检测区域的光中的s偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度，在估算上述发光粒子的偏振特性值的步骤中，使用对上述s偏振光成分的强度的检测灵敏度与上述P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据上述发光粒子的光的信号的上述s偏振光成分的强度的检测值和上述P偏振光成分的强度的检测值来估算上述偏振特性值。
15.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用 拟合上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值。
16.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值。
17.根据权利要求10所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下步骤:对个别检测出的上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
18.根据权利要求10 17中的任一项所述的光分析方法,其特征在于， 在移动上述光检测区域的位置的步骤中，以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动上述光检测区域的位置。
19.一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析，该计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤: 变更上述光学系统的光路以使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 向上述光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动，一边检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度；以及 在检测出的上述光的至少一个偏振光成分的强度中个别检测来自各个上述发光粒子的信号，根据检测出的上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算上述发光粒子的偏振特性值。
20.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 在检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，分别测量来自上述光检测区域的光中的s偏振光成分和P偏振光成分的强度，在估算上述发光粒子的偏振特性值的步骤中，根据上述发光粒子的光的信号的上述S偏振光成分的强度和上述P偏振光成分的强度来估算上述偏振特性值。
21.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 上述偏振特性值是偏振度。
22.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 在检测来自上述光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度的步骤中，分别测量来自上述光检测区域的光中的 s偏振光成分的强度和P偏振光成分的强度，在估算上述发光粒子的偏振特性值的步骤中，使用对上述s偏振光成分的强度的检测灵敏度与上述P偏振光成分的强度的检测灵敏度之间的偏差进行校正的校正值，根据上述发光粒子的光的信号的上述s偏振光成分的强度的检测值和上述P偏振光成分的强度的检测值来估算上述偏振特性值。
23.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用拟合上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间变化所得到的吊钟型函数的时间积分值。
24.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 在估算上述发光粒子的偏振特性值时使用上述发光粒子的光的信号的至少一个偏振光成分的强度的时间累积值。
25.根据权利要求19所述的计算机程序，其特征在于， 还包括以下步骤:对个别检测出的上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
26.根据权利要求19 25中的任一项所述的计算机程序，其特征在于， 在变更上述光学系统的光路的步骤中，以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动上述光检测区域的位置。
全文摘要
本发明提供一种使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法来观测发光粒子的偏振特性的方法。在本发明的观测发光粒子的偏振特性的光分析技术中，一边通过变更显微镜的光学系统的光路使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边向光检测区域照射由预先决定的偏振光成分构成的激励光并且检测来自光检测区域的光的至少一个偏振光成分的强度，在检测出的至少一个偏振光成分的强度中个别检测发光粒子的各个信号，根据检测出的发光粒子的信号的至少一个偏振光成分的强度来估算发光粒子的偏振特性值。由此，能够观测样本溶液中的浓度或数密度低的发光粒子的偏振特性。
文档编号G02B21/00GK103210302SQ20118005072
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月5日 优先权日2010年10月19日
发明者山口光城, 田边哲也 申请人:奥林巴斯株式会社