川崎病的诊断标志物和治疗靶点的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于诊断和治疗川崎病的组合物和方法。更具体地，KD患者的蛋白质组富集安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C，所述蛋白用作KD的生物标志物(和潜在的治疗靶点)。因此，使用本发明中提供的组合物和方法检测这些生物标志物可为递送至受试者的疗法提供信息。
【专利说明】111崎病的诊断标志物和治疗朝点
[0001]联邦政府资助
[0002]本发明是部分地在由国卫卫生研究院授予的项目号U01HL068285、RR02172、U01HL068270、U01HL068269、U01HL068292、U01HL068290、U01HL068288、U01HL068281 和U01HL068279下利用联邦政府资助进行的。美国联邦政府具有本发明的某些权利。
[0003]相关申请的交叉参考[0004]本申请在35U.S.C.§ 119(e)下要求2011年4月15日提交的美国临时申请号61/475，936和2011年12月22日提交的美国临时申请号61/579，007的利益，将所述美国临时申请的每一个的内容通过引用整体并入本文。
【技术领域】
[0005]本发明提供了与川崎病(KD)相关的诊断标志物和治疗靶点。更具体地，KD患者的蛋白质组富集安眠蛋白A(meprin A)、细丝蛋白B和细丝蛋白C,所述蛋白用作KD的生物标志。因此，使用本文中提供的组合物和方法检测这些生物标志物可为递送至受试者的疗法提供fe息。
【背景技术】
[0006]川崎病(KD)是病因学未知的系统性脉管炎。虽然川崎病是发达国家获得性小儿心脏病的最常见病因，并且仍然是主要医学问题，因为其体征和症状模拟许多其它儿童热性疾病。决定性诊断标志物的不存在限制了怀疑的KD的临床评价的准确性，从而发病率显著增加。反过来，其分子发病机制的不完全理解阻碍了需要用来改善疗法的合理靶点的鉴定。
【发明内容】
[0007]本实施方案提供了用于诊断和治疗KD的标志物。KD患者但非具有模拟病况的患者的尿蛋白质组富集细胞损伤蛋白，例如细丝蛋白和踝蛋白、免疫调节剂例如补体调节剂CSMD3、免疫模式识别受体muclin和免疫细胞因子蛋白酶安眠蛋白A。在KD患者的血清和尿中均检测到细丝蛋白C、细丝蛋白B和安眠蛋白A的显著升高。安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C相较于目前在盲法病例-对照研究(blinded case-control study)中使用的疾病标志物显示优良的诊断性能。值得注意地，安眠蛋白A富集在KD的小鼠模型的冠状动脉损伤中。总而言之，尿蛋白组特征谱显示KD的新型分子标志物，包括细丝蛋白C、细丝蛋白B和安眠蛋白A。
[0008]因此，本发明的一个方面提供了至少一种对于有此需要的受试者的KD的诊断和监控是特异性的生物标志物。
[0009]该方面的一个实施方案，提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白C，其在KD患者中
显著升高。
[0010]该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物安眠蛋白A，其在KD患者中显著升高。
[0011]该方面的另一个实施方案提供了尿和血清生物标志物细丝蛋白B，其在KD患者中
显著升高。
[0012]该方面的另一个实施方案提供了一小组生物标志物，其每一个在KD患者中升高，并且在KD的诊断和预后中提供了比较值。在该方面的一个实施方案中，KD生物标志物小组包括细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A。此类实施方案还可包括对于总蛋白质或标准化蛋白(normalizing protein)是特异性的试剂；或可进行测量总蛋白质或标准化蛋白的量或浓度的测定法以提供可针对其对一小组生物标志物进行标准化的量或浓度，以允许各种比较，例如在受试者样品之间，或在一系列在不同时间点分离一个受试者的样品之间的比较。
[0013]在本发明的一个实施方案中，存在于生物样品例如尿或血清中的KD生物标志物水平(例如，细丝蛋白C或安眠蛋白A的量或浓度)通过将测试样品或其制剂与试剂例如基于抗体的试剂接触来测量，所述试剂特异性结合至少一种KD生物标志物或其部分，其中试剂与可在测定法中用于测定生物标志物水平(例如，量或浓度)的生物标志物形成复合物。本领域技术人员已知的任何方法可用于评估生物标志物水平。例如，KD生物标志物水平可利用ELISA、多重珠粒测定法(multiplex bead assay)或质谱来评估。
[0014]一个实施方案提供了用于诊断受试者的KD的测定，包括分析获自受试者的生物样品的至少一种选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的生物标志物的水平，其中生物标志物的水平相较于标准化蛋白的参照水平的大于2倍的升高表示受试者患有KD。
[0015]在另一个方面，本发明提供了最优化KD治疗的治疗效果的方法。因此，在该方面的一个实施方案中，方法包括(a)测量一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中至少一种生物标志物的水平(例如，量或浓度)；(b)将至少一种生物标志物的水平与至少一种生物标志物的参照水平相比较，其中样品的一小组生物标志物(包括安眠蛋白A、细丝蛋白B或细丝蛋白C)中至少一种生物标志物的水平相较于所述至少一种生物标志物的参照水平的升高表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清。
[0016]在该方面的另一个实施方案中，方法包括将生物样品(获自受试者)与至少一种对于一小组生物标志物(包括至少细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A)中的至少一种生物标志物是特异性的试剂接触；(b)使用对于至少一种试剂是特异性的测定测量至少一种生物标志物的量或浓度；和(C)将至少一种生物标志物的量或浓度与至少一种生物标志物的参照水平相比较，其中样品的一小组生物标志物(包括细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A)中的至少一种生物标志物的量或浓度相较于所述至少一种生物标志物的参照量或浓度的增加，表示需要给受试者施用KD的治疗性治疗。在一些实施方案中，生物样品是尿样品。在一些实施方案中，生物样品是血清。
[0017]在另一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于鉴定或测量生物样品的至少一种KD生物标志物例如细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A的工具。试剂盒包括用于装载生物样品(例如，尿样品或血清样品)的容器和至少一种试剂，例如抗体或其部分，所述试剂特异性结合至少一种KD生物标志物以用于测定生物样品例如尿样品或血清样品的至少一种KD生物标志物的量、浓度或存在。[0018]在该方面的一个实施方案中，试剂盒包括至少一种特异性结合至少一种KD生物标志物的抗体或其部分，和用于固定的抗体或其部分。在一个这样的实施方案中，一种抗体被固定在固相上，并且至少一种对于至少一种生物标志物是特异性的抗体被可检测地标记。试剂盒可包括抗-安眠蛋白A、抗-细丝蛋白B或抗-细丝蛋白C抗体或其部分。
[0019]另一个方面涉及计算机可读存储介质，计算机可读存储介质具有在其上记录以定义用于在计算机上执行用于诊断至少一个个体的KD的方法的软件模块的计算机可读指令，计算机可读存储介质包括:(a)用于存储和访问代表针对获自至少一个个体的生物样品测定的至少一种生物标志物的水平和标准化蛋白的水平的数据的指令；(b)用于通过标准化模块将至少一种生物标志物的水平针对标准化蛋白的量标准化，从而产生至少一种生物标志物的标准化水平的指令，(C)用于使用比较模块将至少一种生物标志物的标准化水平与存储在存储装置上的参照数据相比较的指令，其中比较步骤产生被检索的内容，和(d)用于为用户显示一页被检索的内容的指令，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。标准化蛋白可以是总蛋白或特定蛋白质。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在一个实施方案中，生物样品是血清。
[0020]本文中还描述了用于获得获自至少一个个体的生物样品的数据的计算机系统，系统包括:(a)装载生物样品的样品容器；(b)被构造来测定报道分子信息的测定模块，其中报道分子信息包括(I)代表试剂与标准化蛋白的结合的信息，和(2)代表试剂与至少一种生物标志物的结合的信息；(c)被构造来存储来自测定模块的数据输出的存储装置；(d)被构造来将代表试剂与至少一种生物标志物的结合的报道分子信息针对代表试剂与标准化蛋白的结合的报道分子信息标准化的标准化模块；(e)适合于将获自标准化模块的数据与存储装置上的参照数据相比较的比较模块，其中比较模块产生被检索的内容；和(f)用于为用户显示一页被检索的内容的显示模块，其中被检索的内容显示至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。在一个实施方案中，标准化蛋白是特定蛋白质。在一个实施方案中，标准化蛋白是总蛋白。在一个实施方案中，生物样品是尿样品。在另一个实施方案中，生物样品是血清。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1显示KD患者展示与非KD患者或具有通常存在的尿蛋白的患者不同的独特的尿蛋白组。15个个体的尿蛋白组(列)的热图显示相较于非KD患者在KD患者中检测到的前10种蛋白质(行)的贝叶斯分析的结果。阴影梯度表示对应于尿蛋白丰度的MS/MS谱的数目(质谱计数)。
[0022]图2举例说明川崎病患者，但非具有模拟病况的患者具有显著升高的安眠蛋白A和细丝蛋白C的血清和尿水平，这显示了怀疑患有KD的患者的盲法研究的优良诊断性能。图2A-2C:在怀疑患有KD的患者的盲法病例对照研究中使用安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的特异性ELISA测量的尿浓度的箱形图(Box plot)，显示了 KD患者(居中)相较于非KD病况患者(左)和接受静脉内Y球蛋白治疗后的KD患者(IVIg，右)的显著升高的安眠蛋白A和细丝蛋白C的浓度。P〈0.05。水平条表示每一个比较组的平均值。图2D:与常用标志物红细胞沉降率(ESR，第三左线)和血清C反应性蛋白(CRP，右线)相比较的尿安眠蛋白A(第一左线)、细丝蛋白B(第二左线)和细丝蛋白C(第四左线)的受者工作特征曲线。所测量的诊断标志物的受者工作特征曲线下面积(AUC)的值和它们的95%的置信区间(Cl)。图2E-2F:KD患者(右)相较于模拟病况的非KD患者(左)的使用安眠蛋白A(图2E)和细丝蛋白C(图2F)的特异性ELISA测量的血清浓度的箱形图。p〈0.05。
[0023]图3显示与KD患者的疾病活性相关的尿细丝蛋白C和安眠蛋白A。图3A-3B:5个KD患者的尿安眠蛋白A(图3A)和细丝蛋白C(图3B)，如在诊断时、治疗后24-48小时以及完全临床反应后I个月收集的匹配的样品中测量的。图3C:在初始呈现后5.5个月经历KD的复发的一个患者的尿安眠蛋白A水平。图3D:显示对应于初始疗法的患者(左，反应者)对需要重复治疗的患者(右，非反应者)的尿细丝蛋白C水平的散布图。
[0024]图4显示安眠蛋白A在川崎病小鼠模型的冠状动脉损伤中富集。图4A-4B:冠状动脉的苏木精和伊红染色的切片的显微照片显示单核细胞(箭头)在KD-垂死的动物(图4B)但非对照动物(图4A)中的浸润。图4C-4D:冠状动脉的安眠蛋白A免疫组织化学染色的切片的显微照片显示安眠蛋白A在垂死的动物(图4D)但非对照动物(图4C)的冠状动脉的单核浸润物中的富集。图4E:垂死(右)小鼠中安眠蛋白A的血清水平相较于对照(左)小鼠升闻。
[0025]图5显示了使用受者工作特征(ROC)分析获得的反映组合的安眠蛋白A和细丝蛋白C的诊断性能的数据。这些双重KD生物标志物的使用在KD诊断中提供了高水平的灵敏性和特异性。
[0026]图6A-C显示比较KD小鼠模型的安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的血清水平的数据。
【具体实施方式】
[0027]应当理解，本发明不限于本文中描述的特定的方法、方案和试剂等，这样其可变化。本文中使用的技术仅仅是为了描述特定实施方案，并且无意限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求定义。
[0028]如本文和权利要求中使用的，除非明确地另有所指，否则单数形式包括复制所指物，并且反之亦然。除非例如用“任一”修饰，否则术语“或”是包含性的。除在操作实施例中外，或其中另外地指出，否则所有表达本文中使用的成分或反应条件的量的数字应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰。
[0029]确定的所有专利和其它出版物为了描述和公开的目的通过引用明确地并入本文，例如，此类出版物中描述的可能结合本发明使用的方法。在本申请提交日期之前仅提供了这些出版物的公开内容。在这一点上不应当解释为承认发明人不享有先于由于在先发明或出于任何其它原因的此类公开。关于日期的所有声明或关于这些文献的内容的陈述基于对于 申请人:是可获得的信息，并且不构成对这些文献的日期或内容的正确性的承认。
[0030]除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然任何已知的方法、装置和材料可用于本发明的实践或测试，但在这方面的方法、装置和材料描述于本文中。本实施方案提供了用于KD的诊断和治疗的新型生物标志物。简而言之，高精度质谱蛋白质组学用于分析KD患者的临床尿样品的超过2，000种独特蛋白质。分析显示KD患者但非具有模拟病况的患者的尿蛋白质组富集细胞损伤的标志物例如细丝蛋白和踝蛋白、免疫调节剂例如补体调节剂CSMD3、免疫模式识别受体muclin和免疫细胞因子蛋白酶安眠蛋白A。在两个KD患者的独立组群(由总共192个患者组成)的血清和尿中检测到细丝蛋白C和安眠蛋白A的显著升高。在怀疑患有KD的69个患者的盲法病例对照研究中，安眠蛋白A和细丝蛋白C相较于目前使用的疾病的标志物展示更优良的诊断性能，受者工作特征曲线下面积分别为0.99(0.96-1的95%的置信区间)和0.94(0.89至0.99的95%CI)。值得注意地，安眠蛋白A在KD小鼠模型的冠状动脉损伤中富集。总而言之，尿蛋白质组特征谱显示KD的新型分子标志物，包括细丝蛋白C和安眠蛋白A。这些和其它蛋白质可改善怀疑患有KD的儿童的临床评价的诊断准确度，导致新型治疗靶点的鉴定，和允许KD的生物分类的发展。
[0031]KD是病因学未知的系统性脉管炎，其显示延长的发热和皮肤粘膜炎症，包括口腔粘膜的炎症、非渗出性结膜炎、疹、极端变化和通常单侧的颈淋巴结病。Burns等人，118J.Pediatr.680 (1991)。虽然川崎病在美国和欧洲人群中具有约1/10,000的发病率，但其是发达国家的获得性小儿心脏病的最常见病因，并且继续为医学问题，因为其体征和症状模拟许多其它儿童热性疾病。Baker等人，154J.Pediatr.592 (2009) ;Taubert等人，119J.Pediatr279 (1991)。此外，KD的流行在亚洲特别高；2/1，000的5岁以下的日本儿童发生川崎病。Nakamura 等人,20J.Epidemiol.302(2010)。
[0032]准确性诊断的延迟导致增加的来自KD的并发症的死亡率和发病率。Wilder等人，26Pediatr.1nfect.Dis.J.256 (2007) ；Suda 等人，123Circulationl836 (2011)。具体地，在没有及时治疗的情况下，多至25%的患者可产生冠状动脉扩张或微动脉瘤，具有死亡和长期病态的相关风险。McCrindle等人，116Circulationl74(2007)。重要地，在本发明之前，不存在用于KD早期鉴定和诊断的特殊病症测试。Gedalia, 9Curr.Rheumatol.Rep.336 (2007) ；Dedeoglu&Sundel, 33Rheum.Dis.Clin.N.Am.555 (2007)。临床算法的使用已改善了 KD的诊断，但它们准确性仍然有限。Yellen等人，125Pediatrics e234(2010)。改善KD的临床评价的可靠性的尝试集中在炎症的临床和一般实验室标志物上。Lin等人，121 J.Pediatr.924(1992) ;Chow等人，34Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui ZaZhi77 (1993) ;Ebihara 等人，164Eur.J.Pediatr.427 (2005) ;Peng 等人，8Zhongguo DangDai Er Ke Za Zhi208(2006) ;Suganami 等人，50Pediatr.1nt.264(2008)。然而，可能由于KD的病理生理学中的非特异性关系(这被认为是由感染性触发者与夸大的炎症反应之间的相互作用引起的)，性能不足。Rowley等人,6Nat.Rev.Microbiol.394 (2008)。
[0033]本实施方案使用基于发现的方法，所述方法在蛋白质组学规模上鉴定KD病理生理学改变。之所以研究尿是由于尿相较于血清的丰度和相对分析简单性。先前，高精度质谱以充足的深度测量尿蛋白质组，从而鉴定局部和全身性生物标志物，和发现改善的疾病的诊断标志物。Rai 等人,5Proteomics3467 (2005) ；Pisitkun 等人,5Mol.CellProteomicsl760 (2006) ；Adachi 等人,7Genome Biol.R80 (2006) ；fforoniecki 等人,26Am.J.Nephrol.258 (2006) ；0etting 等人,Al km.J.KidneyDis.898 (2006) ;Zimmerli 等人,7Mol.Cell Proteomics290 (2008) ；Kentsis 等人,55Ann.Emerg.Med.62 (2010)。
[0034]本实施方案提供了经验证的KD的诊断标志物(在前瞻性小儿组群中鉴定的)。从怀疑患有KD的儿童收集的尿样品的高精确度质谱蛋白质组表征鉴定了个体尿蛋白质组的差异。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)验证两个独立的患者组群的尿和血清中的候选诊断标志物。随后在怀疑患有KD的儿童的盲法前瞻性研究中评价它们的诊断性能。
[0035]初始受试者研究招募69个受试者，所述受试者显示发热并且担心可能的KD。与KD的流行病学和表现的先前研究一致，研究群体主要是男性，平均年龄3岁，呈现表1中描述的体征和症状。
[0036]表1.显示怀疑患有KD的患者的体征、症状、诊断
【权利要求】
1.一种用于诊断受试者的川崎病(KD)的测定法，其包括: 分析获自受试者的生物样品的至少一种选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的生物标志物的水平； 其中所述生物标志物的水平相较于标准化蛋白的参照水平的> 2倍的升高表示所述受试者患有KD。
2.根据权利要求1所述的测定法，其中所述标准化蛋白的参照水平是(a)未患有KD的个体的生物标志物的水平；(b)所述受试者样品的持家基因蛋白的水平；或(C)生物样品的总蛋白的水平。
3.一种用于监控患有KD的受试者的治疗功效的方法，所述方法包括:(a)从在第一时间点获自受试者的生物样品测定选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的至少一种生物标志物的水平； (b)给所述受试者施用治疗； (c)测定在第二时间点获自所述受试者的样品的所述生物标志物的水平；和 (d)将第二时间点的所述生物标志物的水平与第一时间点的所述生物标志物的水平相比较，其中所述第二时间点的所述生物标志物的水平的降低表明治疗对于所述受试者是有效的，并且其中所述第二时间点的所述生物标志物的水平的升高表示治疗对于所述受试者是无效的。
4.根据权利要求1或2所述的测定法，或根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样品是尿或血清。
5.根据权利要求1或2所述的测定法，或根据权利要求3或4所述的方法，其中所述生物标志物的水平使用特异性结合所述生`物标志物的基于抗体的结合剂来检测。
6.根据权利要求3所述的方法，其还包括给所述KD生物标志物的水平升高的受试者施用额外治疗的步骤。
7.一种用于检测KD的试剂盒，其包括用于检测生物样品中的KD生物标志物的试剂，其中所述KD生物标志物是细丝蛋白C、细丝蛋白B或安眠蛋白A。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述生物样品是尿或血清。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述试剂包括结合细丝蛋白C的试剂或结合安眠蛋白A的试剂，或结合细丝蛋白B的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述试剂是抗体或其部分。
11.根据权利要求7-10所述的试剂盒，其中所述试剂包括标准量的细丝蛋白B、细丝蛋白C或安眠蛋白A。
12.根据权利要求7-11所述的试剂盒，其中所述试剂包括用于标准化的蛋白质标准。
13.根据权利要求9所述的试剂盒，其还包括结合根据权利要求8所述的试剂的第二试剂。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其还包括结合根据权利要求9所述的抗体的第二试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中可检测地标记所述第二试剂。
16.根据权利要求7-15所述的试剂盒，其中所述检测还包括测量检测的生物标志物的水平。
17.根据权利要求7-15所述的试剂盒，其中所述试剂盒是ELISA试剂盒。
18.一种固定的计算机可读存储介质，其具有在其上记录以定义用于在计算机上执行用于诊断至少一个个体的KD的方法的软件模块的计算机可读指令，所述计算机可读存储介质包括:(a)用于存储和访问代表至少一种选自细丝蛋白B、细丝蛋白C和安眠蛋白A的生物标志物的水平，和针对获自至少一个个体的生物样品测定的标准化蛋白的水平的数据的指令；(b)用于通过标准化模块将所述至少一种生物标志物的水平针对标准化蛋白的水平标准化，从而产生所述至少一种生物标志物的标准化水平的指令，(c)用于使用比较模块将所述至少一种生物标志物的标准化水平与存储在存储装置上的参照数据相比较的指令，其中所述比较步骤产生被检索的内容，和(d)用于为用户显示一页被检索的内容的指令，其中被检索的内容显示所述至少一种生物标志物的标准化水平是否存在变化，从而确定至少一个个体是否患有KD。
19.一种治疗川崎病(KD)的方法，其包括: 给在治疗之前至少一种选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的生物标志物的水平相较于标准化蛋白参照水平升高超过2倍的受试者施用有效量的Y球蛋白。
20.一种用于诊断川崎病(KD)的方法，其包括: 分析获自受试者的生物样品的至少一种选自安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C的生物标志物的水平； 其中所述生物标志物的水平相较于标准化蛋白的参照水平的> 2倍的升高表示所述受试者患有KD。
21.根据权利要求20所述的`方法，其中所述生物样品是尿或血清。
【文档编号】G01N33/68GK103562725SQ201280024575
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】亚历克斯·肯特赛斯, 苏姗·金, 汉诺·斯泰恩 申请人:儿童医疗中心有限公司