利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的制作方法

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的制作方法
【专利摘要】提供了在使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中能够将发光粒子的光的信号的检测结果的偏差抑制得更小并能够提高精度的、检测样本溶液中的发光粒子的光的光分析技术。本发明的光分析技术的特征在于，通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定路径移动至少两轮，在光检测区域的位置沿着规定路径移动多次的期间检测来自光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据，使用光检测区域沿着规定路径巡回移动多次获得的按时间序列的光强度数据来逐个检测表示来自存在于规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
【专利说明】利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测来自单个发光粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
【背景技术】
[0002]由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
[0003]特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十yL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量。)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
[0004]专利文献1:日本特开2005-098876
[0005]专利文献2:日本特开2008-292371
[0006]专利文献3:日本特开2009-281831
[0007]专利文献4:日本专利第4023523号
[0008]专利文献5:国际公开2008-080417
[0009]专利文献6:日本特开2007-20565
[0010]专利文献7:日本特开2008-116440
[0011]专利文献8:日本特开平4-337446号公报
[0012]非专利文献1:金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年
[0013]非专利文献2:F.J.Meyer-Alms,突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 编,Springer,柏林,2000 年,204-224 页
[0014]非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页
[0015]非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【发明内容】

[0016]发明要解决的问题
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非逐个地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性的处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6?8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于InM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。
[0018]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子一个一个地逐个进行检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”。)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μ L左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
[0019]在上述扫描分子计数法中，将随着光检测区域的位置在样本溶液内移动而逐次测量出的光强度值(或者光子计数值)记录为按时间序列的光强度数据，在该数据上检测表示从发光粒子发出的光的光强度值的增大(表示发光粒子的光的信号)。此时，如果使用该光强度值分析所述光的波长特性、偏振特性等各种特性，则能够进行各个发光粒子的特性的检测、种类的确定。例如通过将检测光分割为多个波长频带并参照按每个波长频带检测出的光强度值之比，能够检测发光粒子所释放出的光的波长特性(参照日本特愿2010-202995、日本特愿2010-262267)。另外，通过将检测光分割为偏振成分并参照按每个偏振成分检测出的光强度值之比，能够进行发光粒子所释放出的光的偏振特性的检测和发光粒子的运动特性的检测(参照日本特愿2010-234769)。
[0020]然而，在上述扫描分子计数法中测量出的光是荧光单分子或多分子水平的微弱光，并且一个发光粒子的光的测量时间是该发光粒子通过光检测区域内的期间的短的时间。因而，存在如下情况:从检测光获得的光强度值低、或者光量或光子数少，因此在与发光粒子所释放出的光的波长特性等有关的信息方面偏差变大而只能得到低精度的检测结果。
[0021]因此，本发明的主要目的在于提供如下一种新的光分析技术:使根据通过上述扫描分子计数法测量出的光所获得的、发光粒子所释放出的光的波长特性等的检测结果中的偏差变小，实现检测结果的精度提高。
[0022]用于解决问题的方案
[0023]在本发明中，如果清楚地进行描述，则在如上所述的扫描分子计数法中，光检测区域沿规定的路径多次通过，在该期间重复测量同一发光粒子所释放出的光，由此能够抑制使用测量出的光强度的数据检测各个发光粒子的存在和/或其特性的结果的偏差，提高检测精度。
[0024]这样，根据本发明的一个方式，通过光分析装置达成上述课题，该光分析装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定路径移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，光检测区域移动部使光检测区域的位置沿着规定路径移动至少两轮，信号处理部使用在光检测区域的位置沿着规定路径移动至少两轮的期间获得的按时间序列的光强度数据，来逐个检测表示来自存在于规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
[0025]在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，如果是不固定在基板等上而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型地是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为发光粒子的“信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
[0026]如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边通过变更显微镜的光学系统的光路来使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测一个发光粒子的存在。因而，在逐次检测出的光中逐个检测来自发光粒子的光的信号，由此一个一个地逐个且逐次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。此时，如已经记述的那样，发光粒子的光是微弱的，只能够在发光粒子进入到移动的光检测区域起至离开为止的短的期间内检测发光粒子的光，因此如果光检测区域仅通过发光粒子的存在区域一次，则检测出的光量或光子数比较少，因而从该光量或光子数获得的信息有可能偏差大而精度低。因此，在本发明中，如上述那样，光检测区域移动部使光检测区域的位置沿着规定路径移动至少两轮，通过使光检测区域沿着规定路径巡回，来多次检测来自存在于规定路径内的各发光粒子的光，从各发光粒子获取更多的光量或光子，由此能够检测发光粒子的存在(信号的检测为发光粒子的存在的检测。)以及缩小从该信号获得的信息的偏差和提高精度。
[0027]可以通过任意的方式进行上述的通过变更显微镜的光学系统的光路进行的光检测区域的位置在样本溶液内的移动。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-miiror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置。上述的规定路径可以是任意形状的循环路径(封闭的路径)，例如可以从圆形、椭圆形、矩形中选择即可。根据通过变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的方式，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体力学作用，因此作为检测对象的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。
[0028]另外，在上述本发明的装置的结构中，如果在光检测区域沿着规定路径巡回的期间随机运动的发光粒子由于扩散运动而离开了规定路径，则无法多次检测来自发光粒子的光。因而，在本发明的装置中，优选使光检测区域的位置以比发光粒子由于扩散而离开规定路径的扩散时间短的周期移动。关于该点，应该理解所述光检测区域的位置的移动周期不仅依赖于光检测区域的移动速度，还依赖于规定路径的路径长度。因而，可以适当地调整规定路径的长度和光检测区域的移动速度来使光检测区域能够以比要观测的发光粒子离开规定路径的扩散时间短的周期在规定路径上循环。并且，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所引起的粒子的平均移动速度)高。这是因为如果光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度低于发光粒子的扩散移动速度，则存在发光粒子在被包含在光检测区域的期间也由于布朗运动而位置随机移动的情况，如果这样，则发光粒子的光的强度随机变化，导致光的检测精度下降(检测出的发光粒子的光的强度根据光检测区域中的发光粒子的位置而变化。)。此外，在作为测量对象的发光粒子的扩散速度快，如果保持这种状态则无法对各粒子进行两次以上的观察时，可以提高样本溶液的粘性来降低粒子的平移扩散速度。能够通过添加增稠剂、胶凝剂(高分子化合物、多糖类、硅酮类、甘油、PEG、葡聚糖、蔗糖、藻朊酸钠、多晶硅、水溶性纤维素等)来调整样本溶液的粘性。
[0029]并且，在上述本发明的装置的结构中，优选的是，在光检测区域的位置沿着规定路径的规定轮数的巡回移动结束的情况下，通过移动显微镜的台等来移动样本溶液，在样本溶液内的其它场所，以上述方式执行从光检测到生成时序光强度数据为止的处理，从而能够检测更多数量的发光粒子的信号。如已经提及的那样，如果为了使光检测区域的巡回移动的周期比发光粒子由于扩散而离开规定路径的扩散时间短而使规定路径长度变短，则在一个位置处存在于规定路径内的发光粒子的个数减少。而且，被检测的发光粒子的个数越少，导致从发光粒子的信号获得的信息的精度也越低。因此，在本发明的一个方式中，在样本溶液的多个不同的位置进行如上所述的光检测，使发光粒子的检测数增多，由此能够改善从发光粒子的信号获得的信息的精度。这样，本发明的装置还可以在每次光检测区域的位置沿着规定路径的规定轮数的移动结束时，移动样本溶液的位置，在移动后的样本溶液的位置处重复进行通过由光检测区域移动部变更光学系统的光路来进行的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定路径的至少两轮的移动、由光检测部进行的来自光检测区域的光的检测以及由信号处理部进行的按时间序列的光强度数据的生成，针对样本溶液移动后的每个位置执行按时间序列的光强度数据中的表示来自存在于规定路径内的各个发光粒子的光的信号的逐个检测。换言之，根据该方式，通过组合通过变更光学系统的光路进行的光检测区域的巡回运动和样本溶液的间歇性移动，来执行更高精度的发光粒子的存在的检测以及从其信号得到的信息的获取。此外，关于样本溶液的移动，优选的是，可以如已经提及的那样，通过移动显微镜的台等来移动每个样本溶液的容器。在这种情况下，由于在溶液内不产生流动，因此认为降低了样本溶液对发光粒子的影响。
[0030]在上述本发明的装置中，可以通过大致两个方式中的任一个方式来进行基于所生成的时序光强度数据的发光粒子的信号的检测以及信号的特性的抽出。
[0031]在第一方式中，认为在光检测区域沿规定路径巡回的期间测量出的光的强度数据(时序光强度数据)是将多次执行一个规定路径中的光强度的测量得到的数据连接所得到的数据，在时序光强度数据中，按规定路径上的每个位置，参照与各位置对应的多个光强度值来确定这些光强度值的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最频值，生成由光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据。在此，通常设定成光检测区域的移动速度是固定的，或者在光检测区域的各巡回中通过规定路径上的同一位置时的移动速度相互相等，因此规定路径上的位置对应于时序光强度数据中的各巡回的距开始时刻的时间。因而，具体地说，可以按时序光强度数据中的各巡回的距开始时刻的时间来确定光强度值的代表值，生成按时间序列将所述光强度值的代表值排列而成的时序光强度代表值数据。然后，在时序光强度代表值数据中，逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量(即，信号的特性)。
[0032]在发光粒子的信号的检测以及信号的特性的抽出的第二方式中，在时序光强度数据中，首先逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号，分别检测该信号的特征量。在所检测出的这些发光粒子的信号群中，存在于规定路径内的发光粒子的信号被包含巡回数次，因此按每个发光粒子参照所检测出的信号来计算信号的特征量的代表值。即，作为第二方式，信号处理部在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算信号的特征量的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最频值。
[0033]作为上述信号的特征量，典型地可以是光强度或光子数，在作为检测光被检测出多个成分的情况下，信号的特征量可以是基于多个成分的光强度或光子数之比得到的偏振度、旋转扩散常数、发光频谱等任意的表示发光粒子的特性的指标值。
[0034]在上述本发明的装置的信号处理部的处理中，可以根据时序光强度数据中的信号的形状，基于逐次来自光检测部的检测值的信号判断是否一个发光粒子进入了光检测区域。在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。更具体地说，如后面的实施方式一栏所说明的那样，表示来自发光粒子的光的信号通常在光检测部的按时间序列的检测值、即光强度数据中表现为具有某程度以上的强度的吊钟型的脉冲状的信号，噪声表现为不是吊钟型的脉冲状、或者强度小的信号。因此，本发明的装置的信号处理部可以构成为将时序光强度数据(或时序光强度代表值数据)上具有超过规定阈值的强度的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。
[0035]并且，本发明的装置的检测对象是来自单个发光粒子的光，因此光强度非常微弱，在一个发光粒子是荧光单分子或多分子等的情况下，发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生信号值的缺失。而且，当产生这样的缺失时，难以确定与一个发光粒子的存在对应的信号。因此，信号处理部可以构成为使时序光强度数据平滑化，在对数据进行加工以能够忽略微小时间内的信号值的缺失之后，将在平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0036]在上述本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将所检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被同定的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之t匕，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来确定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等能够确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算发光粒子的数密度或浓度。[0037]通过通用的计算机也能够实现在上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测来逐个检测来自各个发光粒子的信号、且使光检测区域沿规定路径巡回移动来多次检测来自规定路径内的发光粒子的光而由此实现了发光粒子的存在的检测和从其信号获得的信息的偏差的缩小以及精度提高的光分析技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤:光检测区域巡回移动步骤，通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定路径移动至少两轮；时序光强度数据生成步骤，在光检测区域的位置沿着规定路径移动至少两轮的期间，检测来自光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据；以及发光粒子信号检测步骤，使用按时间序列的光强度数据逐个检测表示来自存在于规定路径内的各个发光粒子的光的信号。此外，计算机程序通过存储在计算机可读取的存储介质中来提供。计算机通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现上述步骤。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、CD-R0M、DVD_R0M、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信线路传输到计算机，使接受该传输的计算机来执行程序。
[0038]在所述的计算机程序中，优选的是，使光检测区域的位置以比发光粒子通过扩散而离开规定路径的扩散时间短的周期沿着规定路径移动。在这种情况下，通过变更光学系统的光路所进行的光检测区域的位置在样本溶液内的移动例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，规定路径例如可以从圆形、椭圆形、矩形等任意形状的循环路径中选择即可。另外，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高以防止发光粒子的光的强度的随机变化。并且，在上述计算机程序中也同样，优选包括以下步骤:在每次光检测区域的位置沿着规定路径的规定轮数的移动结束时，移动显微镜的台等来移动样本溶液的位置，其中，在移动后的样本溶液的位置处重复进行光检测区域巡回移动步骤和时序光强度数据生成步骤，针对样本溶液移动后的每个位置执行发光粒子信号检测步骤，从而能够检测更多数量的关于发光粒子的信号。
[0039]在上述计算机程序中的信号处理中，与本发明的装置的情况同样地，可以执行以下步骤:生成由按时间序列的光强度数据中按规定路径上的每个位置确定的光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据，其中，在发光粒子信号检测步骤中，在该时序光强度代表值数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测信号的特征量(第一方式)，或者在发光粒子信号检测步骤中，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算信号的特征量的代表值(第二方式)。作为信号的特征量，可以是从由光强度、光子数、偏振度、旋转扩散常数以及发光频谱构成的群中选择的至少一个。
[0040]另外，在上述计算机程序中也同样地，可以根据按时间序列的信号的形状来逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号。在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。
[0041]并且，在上述计算机程序中也同样，可以包括以下步骤:对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0042]根据上述本发明的装置或计算机程序，实现如下一种新的光分析方法:一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边进行各个发光粒子的光的检测，该方法使光检测区域沿着规定路径巡回移动来多次检测来自规定路径内的发光粒子的光，由此实现了发光粒子的存在的检测和从其信号获得的信息的偏差的缩小以及精度提高。这样，根据本发明，还提供一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程:光检测区域巡回移动过程，通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定路径移动至少两轮；时序光强度数据生成过程，在光检测区域的位置沿着规定路径移动至少两轮的期间，检测来自光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据；以及发光粒子信号检测过程，使用按时间序列的光强度数据来逐个检测表示来自存在于规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
[0043]在所述方法中也同样地，规定路径可以从例如圆形、椭圆形、矩形等任意形状的循环路径中选择即可，典型地是，例如通过使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜等，使光检测区域的位置以比发光粒子通过扩散而离开规定路径的扩散时间短的周期沿着规定路径移动，特别地，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。另外，可以包括以下过程:在每次光检测区域的位置沿着规定路径的规定轮数的移动结束时，移动样本溶液的位置，其中，在移动后的样本溶液的位置处重复进行光检测区域巡回移动过程和时序光强度数据生成过程，针对样本溶液移动后的每个位置执行发光粒子信号检测过程，由此能够检测出更多数量的关于发光粒子的信号。
[0044]并且，关于信号处理，也与本发明的装置的情况同样地，可以生成由按时间序列的光强度数据中按规定路径上的每个位置确定的光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据，其中，在发光粒子信号检测过程中，在该时序光强度代表值数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测信号的特征量(第一方式)，或者在发光粒子信号检测过程中，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算信号的特征量的代表值(第二方式)。而且，信号的特征量可以是从由光强度、光子数、偏振度、旋转扩散常数以及发光频谱构成的群中选择的至少一个。
[0045]并且，在上述方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状来逐个检测表示来自各个发光粒子的光的信号。在实施方式中，典型地是，可以在检测出具有大于规定阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将平滑化后的时序光强度数据中具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。[0046]并且，在上述方法中也同样，可以包括以下过程:对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据所检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
[0047]上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、络合物、胶束(micelles)、金属胶体、塑胶珠等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
[0048]发明的效果
[0049]在作为本发明的对象的扫描分子计数法中，基本上通过在样本溶液中移动的光检测区域包含发光粒子时捕捉来自发光粒子的光，来进行发光粒子的存在和/或其特性的检测。因而，由于难以追踪一个发光粒子而持续检测其光，且一个发光粒子的观测时间短，因此具有来自发光粒子的光量或光子数少、从其获得的信息的偏差大的倾向。然而，根据本发明，通过沿同一规定路径巡回，由此能够多次测量来自一个发光粒子的光，因此能够期待来自发光粒子的光量或光子数的检测精度的提高和从其获得的信息的偏差的降低。另外，如后述的实施例所示的那样，根据本发明的一个方式，能够相对地降低背景噪声相对于发光粒子的信号的大小，改善S/N比。
[0050]通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0051]图1的(A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动样本溶液的位置的机构的示意图。
[0052]图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明本发明中的使光检测区域的位置沿着一个扫描轨道(规定路径)移动的方式的图。图2的(D)是说明样本溶液的位置的移动方式的图。
[0053]图3是说明本发明中的时序光强度数据的信号处理方式的图。(A)是如(B)那样使光检测区域在一个扫描轨道(规定路径)上巡回移动时的时序光强度数据的示意图。(C)说明了在(A)的时序光强度数据中按距光检测区域通过巡回的起点sO的时刻(t0、t3、t6)的时间参照在各巡回中获得的时序光强度数据来如(D)那样确定所参照的所有巡回的数据中的代表值的方式。(E)说明了在(A)的时序光强度数据整体中首先检测发光粒子信号、然后针对每个发光粒子(α、β)确定信号的代表值的方式。
[0054]图4是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的图。
(A)是在生成时序光强度代表值数据后进行信号的检测时的处理过程，(B)是在进行信号的检测后进行每个发光粒子的信号的代表值的计算时的处理过程。(C)是在时序光强度数据或时序光强度代表值数据中进行发光粒子信号的检测的处理过程。[0055]图5的(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及通过以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图5的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
[0056]图6示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
[0057]图7示出了使用被荧光标识的质粒作为发光粒子、通过依照本发明执行的扫描分子计数法获得的发光粒子信号的峰值强度的平均值(直方图表)和CV值(误差条)相对于光检测区域在扫描轨道上的巡回次数的变化。
[0058]图8示出了在依照本发明执行的扫描分子计数法中时序光强度数据上的噪声的量相对于光检测区域在扫描轨道上的巡回次数的变化。 [0059]图9示出了通过依照本发明执行的扫描分子计数法获得的发光粒子的偏振度的平均值(直方图表)和标准偏差(误差条)相对于光检测区域在扫描轨道上的巡回次数的变化。
[0060]图10示出了使用各种发光粒子浓度的样本溶液、通过扫描分子计数法获得的发光粒子的信号的个数。?是在作为巡回三次的时序光强度数据的平均值的时序光强度代表值数据上检测出的粒子数，Λ是在巡回一次的时序光强度数据上检测出的粒子数。
[0061]图11是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中获得的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，
(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。
[0062]附图标记说明
[0063]1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ； ；4:准直透镜；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜(condenser lens) ；13:针孔；14:屏蔽滤波器；14a:分色镜或偏振分束器；15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
【具体实施方式】
[0064]下面，详细说明本发明的优选实施方式。
_5] 光分析装置的结构
[0066]实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置:在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，光分析装置I由光学系统2~17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA确定的角度发散的光而发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型地是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了 I μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型地是荧光性粒子或附加有荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14 (在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的⑶所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL?IOfL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型地是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度Ι/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个规定的单位时间(BIN TIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
[0067]并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17 (变更光路来使光检测区域的绝对位置移动的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，还如图1的(D)所例示的那样，使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置来使光检测区域在样本溶液内的相对位置移动(使样本溶液的位置移动的方式)。如后面详细说明的那样，在本发明中，通过变更上述光路来使光检测区域的绝对位置移动的方式，使光检测区域沿着扫描轨道(规定路径)巡回移动，并且当所述巡回次数达到规定的次数时，通过移动样本溶液的位置的方式，来变更使样本溶液中的光检测区域进行巡回移动的场所。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。
[0068]在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2?5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置I中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，可以在检测光光路上插入分色镜14a,将检测光分割为多个波长频带，由多个光检测器16分别进行检测。根据所述结构，还能够在检测与发光粒子的发光波长特性(发光频谱)有关的信息、包含有多种发光粒子的情况下，根据来自它们的光的波长分别检测该光。并且，关于光的检测，也可以使用向规定的方向偏振的光作为激励光，分别检测检测光的与激励光的偏振方向垂直的方向的成分，从而能够检测发光粒子的光的偏振特性。在这种情况下，在激励光光路中插入偏振片(未图示)，在检测光光路中插入偏振分束器14a。(参照实施例3)。
[0069]计算机18具备CPU和存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的过程。此外，各过程也可以通过硬件构成。本实施方式所说明的处理的全部或一部分可以由计算机18使用存储有实现这些处理的程序的计算机可读取的存储介质来执行。即，计算机18可以通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，来实现本发明的处理过程。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶-R0M、DVD-R0M、半导体存储器等，或者也可以将上述程序通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0070]本发明的光分析技术的原理
[0071]如“
【发明内容】
” 一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中，使光检测区域沿着规定的路径进行多次巡回移动，在其期间重复测量同一发光粒子所释放出的光，由此能够抑制使用所测量出的光强度数据检测各个发光粒子的存在和/或其特性时的偏差，提高检测精度。下面，说明本发明的扫描分子计数法的原理、光检测区域的巡回移动方式以及所测量出的光强度数据的信号处理的概要。
[0072]1.扫描分子计数法的原理
[0073]FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图11的(A)示意性地描绘的那样，样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在荧光强度的测量过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在测量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，例如图11的(B)所描绘的那样，在发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以估算高精度的光强度的波动。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。
[0074]因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。[0075]作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如图2的(A)示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0~t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，一个一个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此逐个检测发光粒子，并对其个数进行计数，从而能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。另外，能够根据信号的强度针对每个发光粒子检测各种发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理而是一个一个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度、特性有关的信息。
[0076]2.光检测区域的巡回移动
[0077]在上述扫描分子计数法中，典型地是，发光粒子所释放出的光量是单分子~多分子程度的荧光色素所释放出的光量的水平，因此非常微弱，另外，仅在样本溶液内移动的光检测区域包含发光粒子时检测发光粒子的光，因此在一个发光粒子仅被光检测区域包含一次的情况下，从该发光粒子获得的光量或光子数非常低，因而有可能发光粒子的光的检测精度变低、或者从发光粒子的光获得的与波长特性有关的信息中的偏差变大。因此，在本发明中，如已经记述的那样，尝试一边使光检测区域在样本溶液内沿着规定的路径进行多次巡回移动一边进行上述光测量，从存在于规定的路径内的同一发光粒子多次检测出光而使来自一个发光粒子的光量增大，来提高发光粒子的存在的检测以及发光粒子的光或发光粒子自身特性的检测的精度。
[0078]图2的(C)是示意性地表示使光检测区域沿着扫描轨道(规定的路径)进行多次巡回移动的方式的图。参照该图，首先在本发明中，驱动图1的反射镜偏转器17来变更光路，使光检测区域的绝对位置沿着规定的路径(扫描轨道)巡回移动。在所述的光检测区域巡回移动的期间，如果扫描轨道内的发光粒子的位置几乎不改变，则在每次光检测区域通过该发光粒子的存在区域时都对该发光粒子的光进行测量，因而能够从该发光粒子获得更多的光量。而且，如果来自一个发光粒子的光量变多，则能够期待提高发光粒子的存在的检测和发光粒子的光或发光粒子自身特性的检测的精度。
[0079]关于该点，为了在多次巡回移动中检测来自同一发光粒子的光，需要在该发光粒子通过扩散移动而离开扫描轨道之前完成期望次数的光检测区域的巡回移动。因而，在本发明中，优选的是，将光检测区域的移动周期设定得比发光粒子通过扩散而离开扫描轨道的扩散时间短。具体地说，在时间t时扩散系数D的发光粒子因平移扩散而产生的平均平方位移<x2>通过下式给出，
[0080]< X2 >= 6Dt...(I)
[0081]因此，该发光粒子离开半径r的光检测区域的时间大致为
[0082]t ~4r2/6D…(2)。[0083]因而，应该将光检测区域的移动周期τ设定成使
[0084]τ < t ~4r2/6D...(3)
[0085]充分成立。即，例如当设扫描轨道为半径R的圆时，移动速度V被确定为
[0086]V = 2 31 R/ τ > 2 n R/ (4r2/6D)…⑷。
[0087]光检测区域的半径通常为0.2 μ m~30 μ m，因此在是扩散系数D为2X 10_1(l[m2/s]~10X10_n[m2/s]的发光粒子的情况下，移动周期τ短于6s即可。另外，在光检测区域的直径为1.6 μ m、发光粒子的扩散系数为1.7X10_1(l[m2/S]的情况下，移动周期τ需要小于10ms。这样，实际上以不超过根据发光粒子的扩散系数D与光检测区域的半径r或根据扫描轨道的半径R而确定的光检测区域的移动周期的上限的方式选择光检测区域的移动速度V和扫描轨道的路径长度(或扫描轨道的半径R)。 [0088]此外，如上述那样，在发光粒子离开扫描轨道之前使光检测区域在一个扫描轨道上巡回的方式中，被检测的发光粒子被限制为扫描轨道内的发光粒子。因而，扫描轨道的路径长度越短，被检测的发光粒子的个数越少，发光粒子的个数越少，从发光粒子信号获得的与各种特性有关的检测值的偏差越大，精度也越低。因此，为了使被检测的发光粒子的个数增多，可以在每次光检测区域沿着扫描轨道的巡回达到规定次数时，例如都如图2的(D)示意性地描绘的那样驱动台位置变更装置17a来移动样本溶液的位置，在移动后的位置处重复进行光检测区域的巡回移动。此时的移动距离只要移动得比光检测区域的直径长即可，因此典型地是I μ m以上。另外，样本溶液的位置的路径也可以是循环路径，在这种情况下，可以将其周期设定得比发光粒子通过扩散而离开扫描轨道的扩散时间长(这是为了能够检测与已经测量过光的发光粒子不同的发光粒子的光。)。
[0089]3.光强度数据的信号处理
[0090]在扫描分子计数法中，当一边使光检测区域移动一边进行光测量时，生成按时间序列的光强度数据。而且，通过后面详细说明的方式，在时序光强度数据上，逐个地检测表示发光粒子的光的信号。关于该点，如上述那样，在将光检测区域的巡回移动的周期设定得比发光粒子通过扩散而离开扫描轨道的扩散时间短的情况下，时序光强度数据如图3的(A)所示那样示出在光检测区域周期性地通过扫描轨道时所检测出的光强度或光子数。即，在图3的㈧的例子的情况下，区间Ι、Π、ΙΙΙ分别是第一轮、第二轮、第三轮的光检测区域沿着扫描轨道巡回移动时的光强度或光子数。而且，在光检测区域巡回移动时的速度固定时，或者在扫描轨道上的相同部位处始终相同时，时序光强度数据的时间周期性地对应扫描轨道上的位置。在图示的例子的情况下，时序光强度数据中的时间t0、t3、t6、t9对应图3的(B)中的扫描轨道的位置s0，时序光强度数据中的时间tl、t4、t5对应扫描轨道的位置Si，时序光强度数据中的时间t2、t5、t8对应扫描轨道的位置s2。因而，能够假定扫描轨道上的发光粒子的光在时序光强度数据中大致周期性地在与扫描轨道的同一位置对应的时间出现。考虑到该情形，可以依照如下两种方式中的任一个方式来执行基于光检测区域在扫描轨道上巡回移动所获得的时序光强度数据进行的发光粒子的信号的检测。
[0091]作为第一方式，如图3的(C)示意性地描绘的那样，按光检测区域的移动周期对如图3的(A)那样的时序光强度数据进行划分，按各分区的距起点的时间参照各分区的对应的时间处的光强度或光子数，来计算或确定它们的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最频值，如图3的(D)所例示的那样生成将光强度或光子数的代表值按时间序列排列得到的时序光强度代表值数据。换言之，时序光强度代表值数据是由光检测区域沿扫描轨道巡回时的扫描轨道上的每个位置的光强度或光子数的代表值构成的时序数据。而且，当生成时序光强度代表值数据时，以后述的方式，在时序光强度代表值数据上通过吊钟型函数的拟合(FC)等处理来检测发光粒子的信号，使用从时序光强度代表值数据获得的发光粒子的信号，来估算或确定发光粒子的光的特性或发光粒子自身的特性。此外，在该方式的情况下，能够得到相对于发光粒子的信号相对降低噪声水平这样的效果。一般地，噪声不依据扫描轨道上的位置而随机地产生，与此相对地，发光粒子的信号始终在与扫描轨道上的大致相同的位置对应的时间处产生，因此在确定光强度的代表值的过程中，噪声的强度相对于发光粒子的信号的强度相对地降低。
[0092]作为第二方式，如图3的(E)所例示的那样，在使光检测区域在扫描轨道上巡回移动而获得的时序光强度数据中，首先执行发光粒子的信号的检测。这样，如已经记述的那样，扫描轨道上的各发光粒子的信号(图中为α、β)大致周期性地在与扫描轨道上的同一位置对应的时间处出现，因此参照每个发光粒子的信号来计算各发光粒子的信号的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最频值，根据所述代表值来估算或确定发光粒子的光的特性或发光粒子自身的特性。
[0093]扫描分子计数法的处理操作过程
[0094]在依照使用了图1的(A)所例示的光分析装置I的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的处理:(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，⑵样本溶液的光强度的测量处理以及(3)测量出的光强度的分析处理。图4示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。此外，(A)是在生成时序光强度代表值数据后进行发光粒子的信号的检测时的处理，(B)示出了在发光粒子的信号的检测之后确定信号的代表值时的处理。另外，(C)示出了发光粒子的信号的检测处理的例子。
[0095](I)样本溶液的调制
[0096]作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。在作为观测对象物的粒子不是发光的粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。样本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。
[0097](2)样本溶液的光强度的测量(图3的(A)、⑶-步骤100)
[0098]本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17和台位置变更装置17a来进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)和样本溶液的移动以外，可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型地是，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，首先，反射镜偏转器17驱动反射镜7 (检电镜)，来执行皿10内沿着扫描轨道的光检测区域的位置的巡回移动，与此同时地，光检测器16将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。然后，当光检测区域的位置的规定次数的巡回移动结束时，台位置变更装置17a移动显微镜的台上的微板9的位置，再次执行沿着扫描轨道的光检测区域的位置的巡回移动，同时进行按时间序列的光强度数据的生成和保存。这样，重复进行任意次数的这些处理，结束一次测量。此外，典型地是，光检测器16是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在通过光子计数进行光的检测的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。
[0099]在光强度的测量过程中光检测区域的位置沿着扫描轨道巡回移动时的移动速度可以是任意设定、例如通过实验或为符合分析目的而设定的规定的速度。在根据检测出的发光粒子的个数来获取与其数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域通过的区域的大小或体积，因此以能够掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，由于测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离具有比例关系更容易解释测量结果，因此优选的是移动速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0100]另外，优选的是，光检测区域的位置的移动速度满足上述式(3)的光检测区域的移动周期τ的条件，并且为了定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据的发光粒子的逐个检测、或者发光粒子的个数的计数，而将光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。本发明的光分析技术的观测对象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且随机运动的粒子，因此由于布朗运动，位置随着时间而移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图5的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图5的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，如图5的(C)最上部所例示的那样与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓大致一致(在发光粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓为与激励光强度分布大致相同的 吊钟型。)，从而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
[0101]具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间根据 以下的平均平方位移的关系式，
[0102](2ffo)2 = 6D.At— (5)
[0103]成为
[0104]At = (2ffo)2/6D— (6),
[0105]因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
[0106]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(7)。
[0107]因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif而设定为与其相比充分快的值。例如在预想观测对象粒子的扩散系数是D=2.0X l(Tlclm2/s左右的情况下，在设Wo为0.62 μ m左右时，Vdif为1.0X 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s等。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型地是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来确定适合的光检测区域的位置的移动速度。
[0108](3)光强度的分析
[0109]当通过上述处理得到时序光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，执行发光粒子的信号的检测、发光粒子的计数、浓度计算等各种分析。另外，如已经记述的那样，特别地，在本发明中，通过在发光粒子的信号的检测之前在时序光强度数据中确定光强度的代表值的第一方式以及在发光粒子的信号的检测之后确定所检测出的信号的代表值的第二方式中的任一个方式来进行信号处理。下面，分别说明(i)在发光粒子的信号的检测之前生成时序光强度代表值数据的情况(图4的(A))以及(ii)在发光粒子的信号的检测之后确定检测信号的代表值的情况(图4的(B))。
[0110]⑴在发光粒子的信号的检测之前生成时序光强度代表值数据的情况
[0111](a)时序光强度代表值数据的生成处理(图4的(A)的步骤20)
[0112]在时序光强度代表值数据的生成处理中，如与图3的(C)相关联的说明中所记述的那样，按光检测区域的移动周期τ对时序光强度数据进行划分，以各分区的起点的时间tsi(i为分区的编号)为基准，按各分区的距起点的时间tsi(i为分区的编号)的时间[t1-1Xtsi]来从各分区 的数据读出光强度值(光子数)，计算或确定这些被读出的所有分区的时间[t1-1Xtsi]处的光强度的代表值、即平均值、中央值、最小值、最大值或最频值。这样，当确定光强度的代表值直到到达了分区的终点的时间tei时，生成将分区的从起点的时间ts至终点的时间te为止的光强度的代表值按时间序列排列而构成的时序光强度代表值数据。
[0113](b)发光粒子的信号的逐个检测(参照图4的㈧的步骤30、图4的(C))
[0114]当通过上述处理生成时序光强度代表值数据时，在所述光强度数据上执行逐个检测发光粒子的信号的处理。如已经提及的那样，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图5的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号在光强度数据上的光强度的变化具有反映由光学系统决定的光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在光强度数据上超过适当设定的阈值Ith的光强度值所持续的时间宽度△ τ处于规定的范围时，判断为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，光强度超过阈值或者时间宽度△ τ不在规定的范围内的信号被判断为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布，即
[0115]= A.eXp (_2t2/a2)...(8)
[0116]时，在使式(8)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判断为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判断为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)
[0117]在光强度数据上的信号的检测处理的一个例子中，首先，对光强度数据(图5的
(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图4的(C)-步骤110、图5的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN --ΜΕ，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
[0118]接着，在平滑处理后的光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光强度数据的时间运算一次微分值(步骤120)。光强度数据的时间微分值如图5的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值变化的时刻值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。
[0119]然后，在光强度数据上逐次检测有意义的脉冲信号(步骤130~160)。具体地说，首先在光强度数据的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图5的(C)的下部“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型地是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。然后，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于对针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型轮廓的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图6的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判断为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图6的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。此外，可以与发光粒子的信号的检测同时地执行信号数的计数、即发光粒子的计数。
[0120]可以在光`强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130~150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。此外，根据光强度数据逐个检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。
[0121](ii)在发光粒子的信号的检测之后确定检测信号的代表值的情况
[0122]如图4的(B)所示那样，在发光粒子的信号的检测处理(步骤20)之后计算或确定所检测出的发光粒子信号的代表值(步骤30)的情况下，首先，在通过步骤10获得的时序光强度数据中，例如直接依照式(8)的拟合或图4的(C)所示的处理，与上述同样地执行发光粒子的信号的检测。此时，可以与发光粒子的信号的检测同时地执行信号数的计数、即发光粒子的计数。然后，如图3的(E)示意性地描绘的那样，按各周期对时序光强度数据进行划分，针对每个发光粒子，从各分区的数据中挑出信号的强度值(例如峰值强度)，来计算或确定它们的代表值、即平均值、中央值、最小值、最大值或最频值。
[0123](iii)发光粒子浓度的确定
[0124]在对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定发光粒子的个数的情况下，如果通过任意的方法能够估算出光检测区域所通过的区域的总体积，则能够根据其体积值和发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度(步骤40)。[0125]光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以如下这样确定:进行实验，例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数，根据通过实验所检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来确定。具体地说，例如当针对发光粒子的浓度C的对照溶液，将对照溶液的发光粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。
[0126]Vt = N/C...(9)
[0127]另外，可以准备发光粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积vt。而且，当给出Vt时，发光粒子的计数结果为η的样本溶液的发光粒子的浓度C通过下式给出。
[0128]c = n/Vt …(10)
[0129]此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，对于所设想的光检测区域的移动图案，可以将关于各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(9))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。
[0130](iv)各种特性的确定
[0131]当进行发光粒子信号的检测时，除了发光粒子浓度以外还能够使用信号的强度值获得各种与发光 粒子的光的特性、发光粒子自身的特性有关的信息(信号的特征量)。例如在检测光的测量中，按偏振方向分别测量检测光，在按偏振方向生成了光强度数据的情况下，能够根据基于这些光强度数据分别获得的信号的强度值来计算表示偏振度、偏振各向异性等偏振特性的任意指标值，根据所述指标值进一步计算发光粒子的旋转扩散特性的指标值。另外，在检测光的测量中，针对检测光分别测量多个波长频带的成分，在按波长频带生成了光强度数据的情况下，能够根据基于这些光强度数据分别获得的信号的强度值来获得与发光粒子的发光波长频谱有关的信息(例如多个波长处的强度比)。在此，应该理解的一点在于在作为本发明的对象的扫描分子计数法中，能够针对每个发光粒子确定如上所述的与发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性有关的信息。另外，在本发明中，针对每一个发光粒子获得通过多次测量得到的光强度值并确定它们的代表值，因此能够期待(与对每一个发光粒子都只执行一次测量的情况相比)降低与发光粒子的光的特性、发光粒子自身的特性有关的信息的偏差，改善检测精度。
[0132]这样，根据上述本发明，在扫描分子计数法中，光检测区域多次通过规定的路径而在该期间重复测量同一发光粒子所释放出的光，由此能够抑制使用所测量出的光强度数据检测各个发光粒子的存在和/或其特性时的偏差，提高检测精度。
[0133]为了验证上述所说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，下面的实施例例示本发明的有效性，应该理解不是限定本发明的范围。
[0134]实施例1
[0135]依照上述扫描分子计数法，从光检测区域沿着规定路径巡回移动的期间通过光测量获得的时序光强度数据中检测发光粒子的信号，对发光粒子信号的峰值强度的偏差与光检测区域的巡回次数的关系进行了评价。
[0136]作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中溶解IOnM的荧光色素 SYTOX Orange (Invitrogen 公司、Cat.N0.S-11368)和 IpM 的质粒 pbr322 (takara-bio株式会社、Cat.N0.3035)得到的溶液。SYTOX Orange是DNA嵌入剂色素，当与DNA结合时，荧光强度增大500倍左右。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20 (奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“ (2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光，利用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光。将样本溶液中的光检测区域的位置的扫描轨道设为半径为大约24μ m的圆，移动速度设为15mm/秒，巡回移动的周期设为IOms (=6000rpm) JfBIN --ΜΕ设为10 μ s，进行了两秒钟的测量。
[0137]在光测量后的数据处理中，依照与图3的(C)相关联地说明的在检测发光粒子的信号之前生成时序光强度代表值数据的方式，按作为移动周期的IOms对时序光强度数据进行划分，按各分区的距起点的时间(按BIN TIME)计算光子计数值的平均值，生成按时间序列的光子计数值的代表值数据。然后，在所述代表值数据中进行发光粒子的信号的逐个检测。发光粒子的信号的检测依照“(b)发光粒子的信号的逐个检测”和图4的(C)的步骤110~160所记载的要领，对时序光子计数代表值数据实施平滑处理，在平滑后的数据中确定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只抽出满足下述的条件的脉冲信号作为发光粒子的信号，
[0138]20 μ s< 脉冲宽度〈400 μ S
[0139]峰值强度>1 [pc/ΙΟ μ s]...(A)`[0140]相关系数>0.95
[0141]计算所抽出的发光粒子信号的峰值强度(峰值强度是信号的特征量之一。)的平均值和CV值。
[0142]图7示出在变更生成时序光子计数代表值数据(按时间序列的平均值数据)时的数据的分区数、即光检测区域在一个扫描轨道中的巡回次数的情况下(在时序光子计数代表值数据上)检测出的发光粒子信号的峰值强度的平均值和CV值的变化。如从图中理解的那样，峰值强度的平均值本身在巡回次数I~9中看不到太大的变化，但是当巡回次数增加时，作为值的偏差的指标值的CV值下降。特别地，相对于巡回次数为一次时的CV值为110%，巡回次数为17次时的CV值下降到55%，值的偏差得到抑制。[当巡回次数增加时峰值强度的平均值下降，考虑是因为发光粒子的位置逐渐移动而光子计数值分散在之前或之后的时间中。]其结果，示出了根据本发明的方法，发光粒子信号的特征量的偏差被进一步降低、检测精度得到改善。
[0143]实施例2
[0144]作为样本溶液，使用实施例1的磷酸缓冲液(不包含发光粒子)，在通过与实施例1相同的方式进行光检测和时序光子计数代表值数据的调制之后，作为背景噪声的大小的指标值，计算对代表值数据的整个区域的光子数的平均值加上其标准偏差的3倍的值而得到的参照值(噪声水平)。图8示出变更生成时序光子计数代表值数据时的数据的分区数、即光检测区域在一个扫描轨道中的巡回次数的情况下的上述噪声水平的变化。如参照该图理解的那样，巡回次数越多，噪声水平越降低。如已经提及的那样，背景噪声不依据光检测区域在扫描轨道上的位置而随机地产生。即，背景噪声在与扫描轨道上的同一位置对应的时间处重复产生的可能性极低，因此认为在生成时序光子计数代表值数据时进行参照的分区数越多，相比于在与扫描轨道上的大致同一位置对应的时间处产生的发光粒子的信号的强度，背景噪声的强度越是相对地降低。通过图8的结果确认出该情形。
[0145]实施例3
[0146]在光分析装置中，在激励光光路上插入偏振片来使激励光向一个方向偏振，在检测光光路上插入偏振分束器，作为检测光而分别检测与激励光的偏振方向垂直的方向的成分Iv和平行的方向的成分IH，除此之外，以与实施例1相同的条件进行光测量、数据处理，进行了发光粒子的信号的检测。然后，使用获得的发光粒子的信号，针对每个发光粒子计算偏振度(Iv-1h) / (Iv+Ih)，并计算出其平均值和CV值。
[0147]图9示出变更了生成时序光子计数代表值数据时的数据的分区数、即光检测区域在一个扫描轨道中的巡回次数的情况下的发光粒子信号的偏振度的平均值和CV值的变化。如从图中理解的那样，偏振度的平均值本身在巡回次数I~17中看不到太大的变化，但是当巡回次数增加时，作为值的偏差的指标值的CV值下降。特别地，相对于巡回次数为一次时的CV值为35%，巡回次数为17次时的CV值下降到16%，值的偏差得到抑制。其结果，示出了根据本发明的方法，发光粒子信号的特征量的偏差被进一步降低、检测精度得到改善。
[0148]实施例4
[0149]将各种浓度的荧 光色素溶液作为样本溶液，依照本发明通过扫描分子计数法执行发光粒子的信号的检测，确认了能够通过本发明的扫描分子计数法确定的发光粒子浓度的下限。
[0150]作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中包含IaM~IOpM的荧光色素ATT0647N(Sigma-Aldrich)的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20 (奥林巴斯株式会社)，依照上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述的包含荧光色素的色素溶液和不包含荧光色素的缓冲液分别获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光,利用带通滤波器测量660nm-700nm的波长频带的光,生成时序光子计数数据。样本溶液中的光检测区域的位置的扫描轨道设为半径为大约72 μ m的圆，移动速度设为90mm/s，巡回移动的周期设为5ms (=12000rpm)，将BIN --ΜΕ设为10 μ s，进行了 600秒钟的测量。
[0151]在光测量后的数据处理中，依照与图3的(C)相关联地说明的在检测发光粒子的信号之前生成时序光强度代表值数据的方式，按作为移动周期的5ms对时序光强度数据进行划分，按各分区的距起点的时间(按BIN TIME)计算巡回三次的数据的光子计数值的平均值，生成了按时间序列的光子计数值的代表值数据。然后，在所述代表值数据中，与实施例I的情况同样地进行发光粒子的信号的逐个检测，对检测出的发光粒子信号的个数进行了计数。
[0152]图10示出使用各浓度(横轴)的色素溶液时的发光粒子信号的检测数(纵轴)。图中分别对在通过三次600秒钟的测量得到的巡回三次的数据的平均值数据中检测出的粒子数(有重叠处理.)和在巡回一次的数据中检测出的粒子数(无重叠处理Λ)进行了绘制。参照该图，在无重叠处理的情况下，在IfM以下失去了检测粒子数与色素浓度的线性，与此相对地，在有重叠处理的情况下，直到IOOaM位置能够获得检测粒子数与色素浓度的线性。由此，示出了根据本发明，容易对发光粒子信号和噪声信号进行识别，测量灵敏度得到改善。
[0153]这样，如从上述实施例的结果理解的那样，依照本发明的教导，在使光检测区域沿着同一规定路径巡回来多次测量来自一个发光粒子的光的情况下，发光粒子信号的特征量的偏差降低，由此检测精度得到提高。另外，在生成时序光强度代表值数据的情况下，背景噪声相对地降低，能够期待S/N比的改善。
【权利要求】
1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定路径移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号， 其中，上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置沿着上述规定路径移动至少两轮，上述信号处理部使用在上述光检测区域的位置沿着上述规定路径移动上述至少两轮的期间获得的上述按时间序列的光强度数据，来逐个检测表示来自存在于上述规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 在每次上述光检测区域的位置沿着上述规定路径的规定轮数的移动结束时，移动上述样本溶液的位置，在移动后的上述样本溶液的位置处重复进行通过由上述光检测区域移动部变更上述光学系统的光路来进行的上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定路径的至少两轮的移动、由上述光检测部进行的来自上述光检测区域的光的检测以及由上述信号处理部进行的上述按时间序列的光强度数据的生成，针对上述样本溶液移动后的每个位置执行上述按时间序列的光强度数据中的表示来自存在于上述规定路径内的各个发光粒子的光的信号的逐个检测。
3.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于， 使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子通过扩散而离开上述规定路径的扩散时间短的周期沿着上述规定路径移动。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部生成由上述按时间序列的光强度数据中按上述规定路径上的每个位置确定的光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据，在该时序光强度代表值数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测信号的特征量。
5.根据权利要求1至3中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算上述信号的特征量的代表值。
6.根据权利要求4或5所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号的特征量是从由光强度、光子数、偏振度、旋转扩散常数以及发光频谱构成的群中选择的至少一个。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部在检测出表不具有大于规定阈值的强度的光的信号时检测为一个发光粒子进入了上述光检测区域。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述信号处理部根据所检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
11.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程: 光检测区域巡回移动过程，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定路径移动至少两轮； 时序光强度数据生成过程，在上述光检测区域的位置沿着上述规定路径移动上述至少两轮的期间，检测来自上述光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据；以及 发光粒子信号检测过程，使用上述按时间序列的光强度数据来逐个检测表示来自存在于上述规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
12.根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:在每次上述光检测区域的位置沿着上述规定路径的规定轮数的移动结束时，移动上述样本溶液的位置， 其中，在移动后的上述样本溶液的位置处重复进行上述光检测区域巡回移动过程和上述时序光强度数据生成过程，针对上述样本溶液移动后的每个位置执行上述发光粒子信号检测过程。
13.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于， 使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子通过扩散而离开上述规定路径的扩散时间短的周期沿着上述规定路径移动。
14.根据权利要求11至13中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:生成由上述按时间序列的光强度数据中按上述规定路径上的每个位置确定的光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据， 其中，在上述发光粒子信号检测过程中，在该时序光强度代表值数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测信号的特征量。
15.根据权利要求11至13中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测过程中，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算上述信号的特征量的代表值。
16.根据权利要求14或15所述的光分析方法，其特征在于， 上述信号的特征量是从由光强度、光子数、偏振度、旋转扩散常数以及发光频谱构成的群中选择的至少一个。
17.根据权利要求11至16中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
18.根据权利要求11至17中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测过程中，在检测出表示具有大于规定阈值的强度的光的信号时检测为一个发光粒子进入了上述光检测区域。
19.根据权利要求11至18中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测过程中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
20.根据权利要求11至19中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 还包括以下过程:根据所检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
21.一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤: 光检测区域巡回移动步骤，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定路径移动至少两轮； 时序光强度数据生成步骤，在上述光检测区域的位置沿着上述规定路径移动上述至少两轮的期间，检测来自上述光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据；以及 发光粒子信号检测步骤，使用上述按时间序列的光强度数据逐个检测表示来自存在于上述规定路径内的各个发光粒子的光的信号。
22.根据权利要求21所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还包括以下步骤:在每次上述光检测区域的位置沿着上述规定路径的规定轮数的移动结束时，移动上述样本溶液的位置， 其中，在移动后的上述样本溶液的位置处重复进行上述光检测区域巡回移动步骤和上述时序光强度数据生成步骤，针对上述样本溶液移动后的每个位置执行上述发光粒子信号检测步骤。
23.根据权利要求21或22所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子通过扩散而离开上述规定路径的扩散时间短的周期沿着上述规定路径移动。
24.根据权利要求21至23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还包括以下步骤:生成由上述按时间序列的光强度数据中按上述规定路径上的每个位置确定的光强度值的代表值构成的时序光强度代表值数据， 其中，在上述发光粒子信号检测步骤中，在该时序光强度代表值数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测信号的特征量。
25.根据权利要求21至23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测步骤中，在上述按 时间序列的光强度数据中逐个检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号并检测该信号的特征量，按每个发光粒子计算上述信号的特征量的代表值。
26.根据权利要求24或25所述的光分析用计算机程序，其特征在于，上述信号的特征量是从由光强度、光子数、偏振度、旋转扩散常数以及发光频谱构成的群中选择的至少一个。
27.根据权利要求21至26中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:对逐个检测出的表示来自上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置的移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
28.根据权利要求21至27中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测步骤中，在检测出表示具有大于规定阈值的强度的光的信号时检测为一个发光粒子进入了上述光检测区域。
29.根据权利要求21至28中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述发光粒子信号检测步骤中，使上述按时间序列的光强度数据平滑化，将平滑化后的上述按时间序列的光强度数据中具有超过上述规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个上述发光粒子的光的信号。
30.根据权利要求21 至29中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 还使计算机执行以下步骤:根据所检测出的上述发光粒子的个数来确定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
【文档编号】G01N21/64GK103765196SQ201280041770
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年7月26日 优先权日:2011年8月26日
【发明者】田边哲也, 山口光城 申请人:奥林巴斯株式会社