测定钙化倾向的方法

测定钙化倾向的方法
【专利摘要】本发明涉及测定流体钙化倾向的方法。所述方法的特征在于下列步骤：(i)向所述流体的样品中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐；(ii)在允许形成钙蛋白粒子(CPPs)的条件下培育所述样品；和(iii)测定下列的一种或多种：(a)初级和/或次级CPPs的生成速率；(b)初级和/或次级CPPs的量；和/或(c)初级CPPs转变为次级CPPs的速率，其中步骤(iii)的(a)、(b)和/或(c)中的一种或多种的提高表明所述流体的钙化倾向提高。
【专利说明】测定钙化倾向的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种测定流体钙化倾向的方法。
【背景技术】
[0002]在自然界中，钙盐沉积是在生物和非生物环境中、在体内和在体外大量出现的现象。其可以在包含钙盐的流体接触表面时发生或甚至可以在溶液中发生。高度钙化会损害体外的技术装置，当其发生在体内，特别是在心血管系统和软组织中发生时会对患者造成伤害。
[0003]今天，心血管和软组织钙化是一个主要健康问题，且为世界性的死亡主要原因之一。钙化是一个普遍和非常重要的过程，其特征在于钙盐沉积可以遍及整个身体。钙盐沉淀的典型实例是磷酸钙、碳酸钙及其复合物的沉淀。
[0004]有趣的是，在体内，钙和磷酸根浓度通常在全身的大多数组织和体液中是过饱和的，由此产生了对钙化的持续的化学压力。但是在生理条件下，钙和磷酸根仅在骨骼和牙齿中沉淀，而健康患者体内的软组织不会或仅略微和缓慢地钙化。这表明在体内，钙沉淀是充分受控且为位置特异性的过程。
[0005]但是，钙化也会发生在其它组织与器官中，并由此是病理性的。例如，钙化会导致软组织如皮肤、棕色脂肪、肺、肾脏、心脏和关节硬化。这里，钙化会导致病理组织和潜在地导致相应的病理状况，包括其临床症状。此外，钙化会在某些器官如肾脏特别是肾盂、输尿管、膀胱、胆囊和胆管的内腔中发生。其中，分别会发生肾结石(肾石)和胆结石。
[0006]然而，最常见的病理钙化是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化的温和形式大多发生在老年人体内，而不引起任何临床症状。但是，心血管钙化会增加许多疾病的风险，例如，高渗压、心肌梗死、肢体缺血和脑卒中(中风)。这些心血管疾病已经成为死亡的首要原因和全球医疗系统的主要挑战(Yusuf等人，2001)。钙化的高度显著形式会进一步导致肢体如腿、胳膊、脚或手的截肢的必要性。体内的心血管与软组织钙化的过程迄今为止尚不完全清楚。几种化学因素被认为在钙化中起到了重要的作用。此类化学因素尤其可以是维生素D、草酸、皮质醇和钙结合多肽。
[0007]心血管和软组织钙化可以视为导致血管平滑肌细胞转化为成骨细胞样细胞的活性调节细胞过程的结果(Reynolds等人，2004 ；ReynoIds等人，2005)。这些细胞被认为处理和控制过剩量的钙与磷酸根并将其以作为无机骨物质的主要组分的结晶羟基磷灰石(Ca10 (PO4) 6 (OH) 2)形式在细胞外沉积。
[0008]作为病理性生物矿化的附加概念观点，钙化过程也被认为具有被动和非受控性质，并且其优选在通过钙化的血清结合因子的不利相互影响而表征的情况下发生(Jahnen-Dechent 等人,2001 ； Schafer 等人,2003 ；Heiss 等人,2008)。血清成分可以共同承担防止过饱和的钙和磷酸根浓度沉淀的任务。钙可以结合在含钙粒子中(Wald等人，2011 ；Heiss等人，2003)，该粒子可以在与粒径增加相关的过渡性熟化步骤中自发地转化为次级含钙粒子(Wald等人，2011)。在本文中，胎球蛋白A已知充当钙化基质代谢的调节剂(Jahnen-Dechent 等人,2011)。
[0009]由于钙化可能具有的严重后果，开发一种将流体中抑制和促进钙化的所有已知和未知的因素考虑在内的用于测定体液对钙化的总体倾向的可靠方法是非常重要的。这对于在具有发展的钙化斑或存在发展钙化斑风险的患者体内诊断钙化风险而言特别重要。在肾脏(矿物代谢的主要器官)功能降低或缺失的患者体内钙化风险尤其高。因此，透析患者具有高发病率与死亡率的血管和瓣膜钙化的异常高的风险。
[0010]在现有技术状态下，通过测定患者血清中的磷酸根浓度或磷酸钙产物评估可能存在发展钙化斑风险的个体内的钙化倾向。如果该浓度超过某一阈值，施用磷酸盐结合剂以减少磷酸根摄入并由此防止钙沉淀。
[0011]但是，血清中的磷酸根浓度不一定与钙化倾向相关。事实上，存在具有正常的血清磷酸根浓度但仍具有严重提高的发展钙化斑风险或甚至已经具有发展的钙化斑的个体。另一方面，还存在具有提高的血清磷酸根浓度但却从未发展任何钙化斑的个体。
[0012]考虑到上面的因素，现有技术中已知的测定流体的钙化倾向的方法并不可靠，因为它们不能提供所述流体对钙化的总体倾向的任何信息。
[0013]因此，如今，对测定流体对钙化的总体倾向的可靠方法仍存在未满足的需要。这对诊断具有已发展的钙化斑或存在发展钙化斑风险的患者体内的钙化风险而言特别重要。
[0014]令人惊讶地，我们发现，流体对钙化的总体倾向可以通过基于测定初级CPP和/或次级CPP的生成速率、初级CPP和/或次级CPP的量和/或初级CPP转变为次级CPP的速率的方法来测定。

【发明内容】

[0015]本发明涉及一种测定流体的钙化倾向的方法，其中所述方法的特征在于以下步骤:
[0016](i)向所述流体的样品中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐；
[0017](ii)在允许形成I丐蛋白粒子(calciprotein particles) (CPPs)的条件下培育(incubating)所述样品；和
[0018](iii)测定下列的一种或多种:
[0019](a)初级和/或次级CPPs的生成速率；
[0020](b)初级和/或次级CPPs的量；和/或
[0021](c)初级CPPs转变为次级CPPs的速率，
[0022]其中步骤(iii)的(a)、(b)和/或(C)中的一种或多种的提高表明所述流体钙化的倾向提高。
[0023]本文中所用术语“钙化”可以在广义上理解为在体内和体外的难溶性或不溶性钙盐的沉积和/或沉淀和/或钙蛋白粒子(CPPs)的形成。本文中所用术语“钙化”、“沉钙”、“钙沉积”和“钙沉淀”可以互换理解。任选地，钙化会导致形成钙化斑，可以是微钙化和/或可以是溶液中钙盐的沉淀，由此形成不溶性或难溶性的含钙粒子，包括但不限于初级和/或次级CPPs。
[0024]本发明中所用的术语“难溶性”在一定意义上可以理解为盐在20°C下在水中的溶解度小于10mM、小于ImM、小于0.1mM、小于10 μ M、小于I μ Μ、小于0.1 μ M或小于ΙΟηΜ。术语“不溶性”在一定意义上可以理解为盐在20°C下在水中的溶解度小于ΙΟηΜ、小于InM或小于0.1nM0
[0025]优选地，钙化是体内钙化。这意味着当流体在体内时，钙化发生在该流体内，并通过本发明的方法测定所述体内钙化的倾向。钙化可以是体内钙化的事实不排除该方法可以在体外实施。本发明中通篇所用的术语“实施”和“进行”可以互换理解。优选地，该方法本身在体外实施，因此不在人体或动物体上实践。但是，通过该方法获得的结果可用于患者的诊断。
[0026]在体内钙化方面，钙化还可以理解为形成一个或多个钙化斑。在这方面，术语“钙化斑”和“钙化性病变”可以互换理解。斑块形成可以在患者身体的多个区域内发生。更优选地，钙化是血管钙化、瓣膜钙化、心血管钙化或一种或多种软组织的钙化。最优选地，钙化
是心血管钙化。
[0027]本文中所用的心血管钙化可以在广义上理解为形成一个或多个位于一条或多条血管中、更优选位于内膜和/或中膜处的斑块。血管中的斑块形成还可称为形成血管内斑块。这种血管内斑块可以是称为“心血管钙化”的患者体内血管钙化的一个原因。心血管钙化，由此在心血管系统中形成钙化性病变，可以提高大量疾病的风险，如高渗压、心肌梗死和脑卒中(中风)。钙化的高度明显形式会进一步导致肢体如腿、胳膊、脚或手的截肢的必要性。病理性心血管钙化的一种严重形式是“门克伯格氏动脉粥样硬化”，也称作“中膜钙化性硬化”。其中，当钙沉积物形成于中等尺寸血管壁的中层(中膜)中，血管硬化。因此，脉压病理性提高。斑块形成(plaque formation)可表征为脂肪条纹。这些脂肪条纹通常表征为脂肪酸、胆固醇和/或一种或多种其它类固醇的积聚。通常，这些斑块形成(斑块)进一步表征为混入低密度脂蛋白(LDL)和/或白血细胞，尤其是已经吸收氧化的低密度脂蛋白(LDL)的巨噬细胞。在这些白血细胞已经积聚大量胞质膜时，它们也被称为泡沫细胞。在斑块形成的晚期，可以形成细胞外脂质核心。此外，斑块更靠外和/或更老的部分可以随时间变得更为钙化、代谢活性更低和物理上更为僵硬(stiff)。该斑块会进一步包含各种量的细胞碎片、钙和/或纤维结缔组织。任选其可以形成纤维帽。最后，斑块可以潜在地导致血小板凝血、动脉粥样硬化和/或狭窄。
[0028]在本发明中，体内钙化还可以理解为在某些器官如肾脏特别是肾盂、输尿管、膀胱、胆囊和胆管的内腔中的钙化。结果，分别会发生肾结石(肾石)和胆结石。肾结石和胆结石普遍发生并会导致严重的症状。此外，钙化会在软组织中发生，并会造成软组织硬化。这里，钙化会导致病理性组织并潜在地导致相应的病理状况，包括可能严重的临床症状。几种类型的肿瘤，如某些类型的脑瘤带有显著的局部钙化(钙斑)，尽管不同尺寸的钙斑也会在大脑中出現而不引起任何临床症状或显示任何病理状况。
[0029]如在本发明中所用，钙化还可以是与主要由一种或多种有机材料组成的任何沉积物相关的钙化。例如，这种沉积物可以是例如肾结石、胆结石、斑块形成和/或上述之一的前体。优选地，这些沉积物可以是斑块形成。
[0030]或者，钙化是体外钙化。本文中所用术语“体外”和“离体”可以互换理解。体外钙化可以在身体外的任何环境中发生。示例性地，本发明中的体外钙化可以在得以接触流体、优选含水流体的任何中空装置中发生。在医药方面，所述中空装置可以示例性地为针头、夕卜科针、软管、注射器、透析机、透析膜、或血液或血浆储器。或者，所述中空装置还可以是管子(a tube)、管道(a pipe)(例如水管)、洗衣机、洗碗机、热水锅炉、水壶、罐、盘、咖啡机、茶机、洗盆、浴盆、马桶、尿壶或得以与钙化流体(calcifying fluid)接触的任何机器或机器部件。
[0031]本发明中所用的术语“流体”可以在广义上理解为可以导致钙化的任何流体。本文中所用术语“流体”、“液体”和“溶液”可互换理解。该流体优选是含水流体，因此是包含超过50% (w/w)的水、超过60% (w/w)的水、超过70% (w/w)的水、超过80% (w/w)的水、超过90% (w/w)的水或超过95% (w/w)的水的流体。该流体可以是体液或是技术性流体(technical fluid)。
[0032]本发明中所用的术语“流体的钙化倾向”可以在广义上理解为流体承受钙化的倾向性(tendency to bear calcification)。钙化倾向可以在最广义上理解为钙化压力并因此是流体承受钙化的效力。因此，在流体的钙化倾向高的情况下，该流体在提高钙和/或磷酸根浓度时将可能显示钙化，而在流体的钙化倾向低的情况下，该流体在提高钙和/或磷酸根浓度时将可能不显示钙化或显示极少的钙化。在本发明中，流体的钙化倾向优选是流体对钙化的总体倾向，因此，是从宏观来看由该流体作为整体介导的钙化的倾向。
[0033]流体的钙化倾向与流体防止钙化的倾向相对。因此，本发明还涉及一种测定流体防止钙化的倾向的方法。在这方面，防止或抑制钙化还可以被称为“体液防线(humoralline of defense)”。这种体液防线会被提高的钙和/或磷酸根浓度打垮。
[0034]本文中所用的术语“测定”可以在广义上理解为表征流体的钙化倾向的状态与强度。在这方面，术语“测定”可以任选包括但不限于检验、测试、测量、研究、化验、探索和评估流体的钙化倾向的任意一种步骤。在测定获自患者的样品中流体的钙化倾向方面，所述测定还可以与术语“诊断 ”互换理解。
[0035]本发明中所用的术语“所述流体的样品”可以在广义上理解为包含该流体的任何组合物。在本发明中，术语“所述流体的样品”、“该流体的样品”和“样品”可以互换理解。优选地，该样品是流体样品。本文中所用术语“液体”和“流体”可以互换理解。最优选地，该样品是含水样品。该样品可以包含少于5% (v/v)、超过5% (v/v)、超过10% (v/v)、超? 20% (ν/V)、超过 30 % (ν/V)、超过 40 % (v/v)、超过 50 % (v/v)、超过 60 % (v/v)、超过70% (v/v)、超过80% (v/v)、超过90% (v/v)的该流体,或甚至可以仅由流体组成。优选地，该样品可以包含25% (v/v)至75% (v/v)的流体,最优选包含30% (v/v)至60% (ν/ν)的流体。但是，本领域技术人员将注意到样品中流体的量取决于流体的类型、采用的读取方法以及样品中的钙与磷酸根的浓度。
[0036]术语“加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐”可以在广义上理解为向样品中加入钙和磷酸根离子。
[0037]本文中所用术语“可溶性钙盐”是指可溶于水的包含钙阳离子(Ca2+)的任何盐。
[0038]如在本发明中，术语“可溶性盐”可以在广义上理解为在20°C的水中其溶解度超过ΙΟηΜ、超过0.1 μ Μ、超过I μ Μ、超过10 μ Μ、超过0.1mM、超过ImM或超过IOmM的盐。
[0039]本文中所用术语“可溶性钙盐”是指包含钙阳离子(Ca2+)的任何可溶性盐。示例性地，该可溶性钙可以是氯化钙(CaCl2)。本领域技术人员将理解，采用的钙阳离子浓度将取决于样品中流体的量、流体的类型、采用的读取方法以及样品中的磷酸根的浓度。优选地，将钙离子以在水中或在合适的缓冲液中的水溶液形式添加到该样品中，其中可溶性钙盐可溶于例如在广泛中性pH下的!fepes缓冲液中。或者，钙盐还可以直接溶解在该流体的样品中。
[0040]本文中所用术语“可溶性磷酸盐”是指包含磷酸根(P043_)、磷酸氢根(ΗΡ042_)和/或磷酸二氢根(H2PCV)阴离子中的至少一种的任何可溶性盐。示例性地，该可溶性磷酸盐可以是磷酸氢二钠(Na2HPO4)和/或磷酸二氢钠(NaH2PO4)15优选地，该可溶性磷酸盐以在水中或在合适的缓冲液中的水溶液形式添加到该样品中，其中钙阳离子也是可溶于例如在广泛中性PH下的Hepes缓冲液中。或者，该可溶性磷酸盐还可以直接溶解在该流体的样品中。
[0041]事实上，在一定范围内选择可溶性钙和磷酸盐的使用浓度，在该范围内，可以充分观察到不同样品之间的差异。因此，钙和磷酸根的整体浓度，即固有的和加入的钙与磷酸根的浓度之和优选可以超过磷酸钙在水中或缓冲液中的溶度积(solubility product)。在另一方面，所述钙与磷酸根的整体浓度优选应不超过该样品中所含流体的抑制沉淀性质的最大容量(the maximal capacity)的五个数量级以上，四个数量级以上、三个数量级以上、二个数量级以上或一个数量级以上。优选独立地将钙和磷酸根添加到该样品中以避免在与样品接触如在溶液中形成憐Ifef丐沉淀。
[0042]优选地，钙和磷酸根的浓度在样品中可以是过饱和的。由此，钙X磷酸根的积在该样品中是过饱和的。
[0043]除了该流体和可溶性钙和磷酸盐之外，该样品可以进一步包含不会干扰该方法的任何其它无机和/或有机组分。该样品可以进一步包含不会干扰该方法的缓冲液，如Hepes缓冲液。该PH可以调节为任何 pH。优选地，该pH可以在广泛中性的pH下，即pH5.5至ρΗ8.0、更优选ρΗ6.0至ρΗ8.0、再更优选ρΗ6.5至ρΗ7.8、再更优选ρΗ7.2至ρΗ7.6、最优选在生理pH下，即在大约7.4的pH下。
[0044]该样品可以手工或自动混合。样品体积取决于所用的检测方法，并通常为对小型微阵列设置的纳升范围至对宏观阵列，如基于离心或基于柱的方法的毫升范围不等。
[0045]该样品通常自其来源(例如来自患者或来自技术装置)获得而立即使用，或在几分钟或几天内使用。当样品储存超过几小时时，样品可以优选在室温下储存或储存在冰箱中。或者，该样品还可以以冷冻、深冷或冷冻干燥状态储存，并随后可以储存在低于凝固点(freezing point)的任何温度下，例如在_20°C下、在_80°C下或在液氮中。冷冻干燥粉末也可以在环境温度下储存。
[0046]本文中所用术语“培育”可以在广义上理解为对流体的样品施以允许形成CPPs的条件。
[0047]本文中所用术语“允许形成CPPs的条件”是指其中可以形成CPPs的任何条件。通常所述CPPs可以包含难溶性磷酸钙。
[0048]该样品优选可以在广泛中性pH下培育，即在pH5.5至pH8.0、更优选pH6.0至pH8.0、再更优选pH6.5至pH7.8、再更优选pH7.2至pH7.6、最优选在生理pH，即在大约7.4的PH的条件下。
[0049]由于沉淀反应通常是温度敏感的，为了将不同样品与另一样品比较和/或与校准曲线比较，将该温度或温度曲线设定在可比较范围内。最优选地，该样品在恒定温度下培育，并且相互比较的样品之间的温度差值应小于5°C、小于4°C、小于:TC、小于2°C、小于1°C、小于0.5°C、小于0.25°C或甚至小于0.1°C。该恒定温度优选可以为0°C至100°C，更优选为(TC至45°C，再更优选为4°C至42°C，再更优选为20°C至40°C，再更优选为36°C至38 °C，再更优选为36.(TC至37.5 °C，且最优选为36.5°C至37.(TC。
[0050]或者，该温度可以在测量过程中以温度曲线形式变化。该温度曲线在所有要与另一样品比较的样品中是可比的。
[0051]本发明所用的术语“钙蛋白粒子”、“钙蛋白质粒子”、“钙化蛋白质粒子”和“CPP(或CPPs) ”可以在广义上理解为包含钙阳离子的任何粒子。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本发明通篇中可以互换理解。在本发明中，术语“粒子”、“纳米球”、“沉淀”、“胶体”和“团聚体”可以互换理解。在形成CPPs方面，该粒子优选通过在样品溶液中分子的积聚形成。优选地，在该CPPs中，该钙阳离子构成难溶性盐。示例性地，所述难溶性盐可以是磷酸钙和/或其一种或多种复合物。任选地，所述难溶性盐可以形成晶体，优选纳米或微米范围内的晶体，最优选为纳米范围内的晶体。可任选地通过混入一个或多个多肽或其它分子来中断该规则晶体结构。但是，该CPP可进一步包含存在于该流体中和/或添加到该样品中的任何其它无机或有机分子和/或离子，如一种或多种可以与钙相互作用的多肽(例如，胎球蛋白多肽(如胎球蛋白A)、白蛋白多肽(例如，血清白蛋白)、钙结合蛋白、S-100蛋白、骨钙蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽)、有机阴离子(例如草酸根)、无机阴离子(例如，碳酸根和/或焦磷酸根)、有机阳离子、无机阳离子(例如，镁和/或矿离子)、维生素(例如，维生素D)、激素(例如，类固醇、甲状腺素)。本领域技术人员将理解的是，CPP通常优选包含与钙阴离子和/或钙盐相互作用的组分以及与所述与钙阴离子和/或钙盐相互作用的组分相互作用的组分。但是，其它分子特别是疏水性分子也可以在沉淀物中间积聚。
[0052]在本发明中，CPP优选是固体或半固体粒子。因此，在流体样品中形成CPPs导致形成悬浮体。CPP可以具有任何尺寸。优选地，CPP具有纳米或微米范围内的尺寸。本文中所用术语“尺寸”指的是该沉淀物的平均直径。
[0053]任选地，该CPPs可以进一步被荧光染色，例如通过混合荧光多肽(例如，蓝绿色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、mCherry等等)、小分子染料(例如，Cy染料(例如，Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy 7)、Alexa染料(例如，AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750)、Visen 染料(例如 VivoTag680、VivoTag750)、S 染料(例如，S0387)、DyLight 荧光团(例如，DyLight750、DyLight 800) ,IRDye (例如，IRDye 680,IRDye 800)、荧光素染料(例如，荧光素、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC))、罗丹明染料(例如，罗丹明、四甲基罗丹明(TAMRA))或H0ECHST染料、量子点或其两种或更多种的组合。但是，优选不对该CPPs进行荧光染色。
[0054]取决于其组分，本发明的CPP可以是广泛球形粒子、纺锤形粒子、无规形状粒子或结晶粒子。初级CPPs是广泛球形的(参照图5A)，而次级CPPs具有纺锤形或无规形状(参照图5B)。取决于所用的方法，不同的形状可以对该粒子的光散射性质具有或不具有影响。优选其对光散射具有影响。
[0055]在CPPs方面,本领域技术人员将区分初级与次级CPPs (参照Jahnen-Dechent等人，2011)。初级CPPs具有比次级CPPs更小的直径。此外，初级CPPs具有广泛球形的形状，而该次级CPPs具有相当无规的形状。
[0056]在这方面，术语“初级钙蛋白粒子”和“初级CPPs”可以在广义上理解在向流体样品中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐后几秒或几分钟的短时间内初始形成的粒子。初级CPPs的平均直径小于lOOnm。初级CPPs的尺寸优选为50nm至lOOnm，最通常为大约60nm至75nm。但是，本领域技术人员要理解的是该尺寸还将取决于该方法中使用的具体浓度与条件。通常，作为蛋白质组分，初级CPPs主要包含胎球蛋白A和白蛋白。
[0057]在这方面，术语“次级钙蛋白粒子”和“次级CPPs”可以在广义上理解为在培育时通过过渡熟化步骤中初级CPPs的自发转变所形成的粒子。该步骤还可以以同步和协调的方式(timed and coordinated manner)发生。通常，该转变还与粒径增大相关联(Wald等人，2011)。该转变步骤可能需要比初始形成初级CPPs多得多的时间。本领域技术人员将注意到，转变速率取决于反应条件。通常，该转变步骤的广泛完成可能需要几分钟、几小时、几天、几周或甚至几个月的时间。该转变步骤的广泛完成可能需要超过I分钟、超过5分钟、超过10分钟、超过30分钟、超过I小时、超过2小时、超过6小时、超过12小时、超过一天、超过两天、超过一周、超过一个月、超过六个月或甚至超过一年。该次级CPPs的平均直径大于lOOnm。通常，该次级CPPs可以具有IOOnm至500nm、最通常大约IOOnm至200nm的尺寸。但是，本领域技术人员将理解，该尺寸将取决于该方法中使用的具体浓度和条件。通常，作为蛋白质组分，次级CPPs包含胎球蛋白A、白蛋白和其它高分子量或低分子量组分。优选地，这些其它蛋白质组分具有5至150kDa、更优选10至IOOkDa的分子量。此外，可能会出现具有大于150kDa的分子量的高分子量复合物。
[0058]本发明中所用的术语“初级CPPs的生成速率”可以在广义上理解为在流体中经时生成初级CPPs的速率。这可以示例性地量化为特定流体或样品体积中的初级CPPs的量、量化为特定流体或样品体积中的初级CPPs的体积或量化为特定流体或样品体积中的初级CPPs的质量。通常，该初级CPPs将初始在流体或样品中形成，并在初级CPPs转变为次级CPPs时在数量上消失或减少。初级CPPs的生成通常将取决于该流体的钙、磷酸根、镁和质子浓度以及钙化抑制剂与促进剂的浓度。
[0059]本发明中所用的术语“次级CPPs的生成速率”可以在广义上理解为在流体中经时生成次级CPPs的速率。这可以示例性地量化为特定流体或样品体积中的次级CPPs的量、量化为特定流体或样品体积中的次级CPPs的体积或量化为特定流体或样品体积中的次级CPPs的质量。通常，该次级CPPs将通过初级CPPs转变为次级CPPs而形成。类似于初级CPPs的形成，次级CPPs的形成通常也将取决于该流体的钙、磷酸根、镁和质子浓度以及钙化抑制剂与促进剂的浓度。
[0060]本发明中所用的术语“测定生成速率”可以在广义上理解为观察和量化生成CPPs中的变化。如上所述，CPPs的生成通常造成溶液浊度的提高。溶液的吸收和溶液的光散射性质提高。该生成速率可以通过本领域已知的任何装置测定。示例性地，其可以借助于本领域已知的任何方法测定。
[0061]本发明中所用的术语“初级和/或次级CPPs的量”指的是包含在特定体积的流体或样品中的初级和/或次级CPPs的数量，包含在特定体积的流体或样品中的初级和/或次级CPPs的质量或包含在特定体积的流体或样品中的初级和/或次级CPPs的体积。包含在特定体积的流体或样品中的初级和/或次级CPPs的质量可以作为干粒子的质量或溶液中的粒子的质量来测定。
[0062]本发明中所用的初级CPPs转变为次级CPPs，术语“转变”可以在广义上理解为含钙粒子，即钙蛋白粒子(CPPs)在培育时的重排，即一种类型的CPPs (即初级CPPs)转化为另一种类型的CPPs(即次级CPPs)。在本文中，术语“转变”、“转化”和“重排”可以互换理解。转变还可以理解为过渡性熟化步骤。该步骤可以以同步和协调的方式发生。通常，该转变与颗粒直径的增大相关。
[0063]本发明中所用的术语“转变速率”可以在广义上理解为初级CPPs转变为CPPs的动力学。通常，转变速率量化为初级CPPs转变为次级CPPs的半数最大转变时间(T5tl)的时间点。在本发明中，已经显示，转换速率优选在镁(Mg2+)的存在下被延迟，而在磷酸根(PO广、HPO42' H2PO4O的存在下被加速(参照图2A)。
[0064]本发明中所用的术语“测定转变速率”可以在广义上理解为观察和量化CPPs的平均尺寸的改变。如上所述，在本发明中，转变通常意味着CPPs的尺寸的增大。该转变速率可以通过本领域中已知的任何方法测定。示例性地，其可以借助光学方法测定(例如，测量吸收，检测光散射的变化，检测激光衍射的变化和/或相关光谱法)。
[0065]本发明中所用的术语“提高的生成速率”可以在广义上理解为出现初级和/或次级CPPs的更快生成。
[0066]本发明中所用的术语“提高的量”可以在广义上理解为出现更高数量(number)、量(amount)或体积的初级和/或次级CPPs。
[0067]本发明中所用的术语“提高的转变速率”可以在广义上理解为出现初级CPPs向次级CPPs的更快转变。在这方面，对流体样品测得的转变速率T5tl可以与一种或多种对照物样品进行比较。
[0068]本文中所用术语“提高的钙化倾向”可以在广义上理解为出现更高的流体的钙化倾向。因此，具有提高的钙化倾向的流体将更倾向于沉淀不溶性或难溶性钙盐。因此，提高的钙化倾向还意味着钙化发生的可能性和/或钙化的强度提高。
[0069]优选地，本发明的方法的步骤(iii)至少包括测定初级CPPs转变为次级CPPs的转变速率(步骤(C))。
[0070]在一个优选实施方案中，测定初级和/或次级CPPs的生成速率、初级和/或次级CPPs的量和/或初级CPPs转变为次级CPPs的速率中的一种或多种的步骤(步骤(iii))通过光学方法来进行，特别是选自如下的光学方法:
[0071]吸光光度法(absorptiometry),
[0072]光散射的检测(detectionof light scattering),
[0073]相关光谱法(correlation spectroscopy),
[0074]或其两种或更多种的组合。
[0075]本发明中所用的术语“光学方法”可以在广义上理解为其中使用光用于检测、表征和/或量化初级与次级CPPs的任何方法。该光学方法可以是视觉方法，例如显微镜法，或者可以是非视觉方法，例如光散射的检测或激光衍射或相关光谱法。
[0076]本发明中所用的术语“吸光光度法”可以在广义上理解为测定本发明的流体的吸光或消光。通常，由于浊度提高，溶液的吸光将在生成初级和次级CPPs时提高。该浊度可以通过与一个或多个校准样品比较用肉眼来评估，或者可以通过技术装置来测量。同样，初级CPPs向次级CPPs的转变也对吸光具有影响。吸光光度法可以通过本领域已知的任何装置进行，例如使用比色皿的光度计或使用微量滴定板的读板仪(例如，96孔板或386孔板)。可以使用在本领域中合适的任何波长的光进行吸光光度法。优选地，该波长为IOOnm至2000nm,更优选为200nm至1500nm,再更优选为250nm至IOOOnm,更优选为280nm至IOOOnm,更优选为300nm至900nm,更优选为400nm至800nm。本领域技术人员将认识到，选择的波长优选在无论比色皿或微量滴定板还是样品流体本身均不显示显著吸光的范围内。
[0077]如在本发明通篇所用，可以通过选择特定的光源(例如带有特定激光谱线的激光器)、通过引导激发光穿过一个或多个滤光片、一个或多个半透镜和/或一个或多个声-光分束器和/或借助一个或多个棱镜和/或一个或多个光栅将光分裂为特定波长来选择激发光的波长。同样，穿过样品的光可以引导穿过一个或多个滤光片、一个或多个半透镜和/或一个或多个声-光分束器和/或借助一个或多个棱镜和/或一个或多个光栅将光分裂为特定波长以便能够对一个或多个特定波长进行检测。
[0078]可以通过本领域已知的任何装置检测光。示例性地，该检测器可以是雪崩光电二极管(APD)、光电倍增管(PMT)和/或二极管阵列。二极管阵列可以包含超过四个、超过十个、超过100个、超过1000个或甚至超过10000个二极管。
[0079]本发明中所用的术语“光散射”可以在广义上理解为其中光为被散射的传播能量形式的任何形式的散射。光散射是一种本领域技术人员公知的现象。因此，光散射可以是来自笔直路径的光线的偏转。示例性地，其可以通过传播介质中的不规则性引发。在本发明中，所述传播介质中的不规则性优选由样品中的CPPs和样品流体与所述CPPs之间的界面造成。在本发明中检测到的散射因CPPs遍布该样品的随机和稠密分布而主要是漫散射(diffuse scattering)。粒子形状对粒子的光散射性质有影响。光散射可以进一步取决于被散射的光的波长，因此取决于激发光的频率。本文中所用术语“激发光”和“入射光”可以互换理解。
[0080]本发明中所用的术语“光散射的检测”可以在广义上理解为本领域已知的用于识另O、确定和量化散射光的任何方法。通常，任何光源的光的光束被激发到该样品中，并检测以照射光束的一个、两个或更多个角度被散射的光。
[0081]光散射的检测可以通过本领域已知的任何方法进行。示例性地，光散射的检测可以是瑞利散射、拉曼散射、米氏散射、丁达尔散射、布里渊散射的检测。优选地，光散射主要是瑞利散射。
[0082]在本发明中，瑞利散射是光通过CPPs粒子发生的弹性散射，其中散射光的波长通常小于激发光的波长。瑞利散射的强度取决于粒子的尺寸。通常，其广泛正比于粒子直径的六次方，并广泛反比于激发光波长的四次方。所用激发光的波长通常为低于400nm、低于350nm、低于300nm、低于250nm、低于200nm或甚至低于150nm的相当短的波长。但是，本领域技术人员将注意到，对于该试验设置其它波长可能也适用。
[0083]拉曼散射是本领域技术人员公知的并基于非弹性光散射，其中光与光频声子相互作用，所述光频声子主要是分子内振动和旋转。使用扫描单色器的标准光谱仪可用于测量拉曼散射。米氏散射是一大类通过球形粒子、特别是远大于激发光波长的球形粒子发生的光散射。该散射强度通常并不强烈依赖于波长，但是对粒度敏感。大粒子的米氏散射强度广泛正比于粒子直径的平方。丁达尔散射类似于米氏散射，但不限于粒子的球形几何形状。其特别适用于本发明的胶态悬浮液。布里渊散射来自于光子与固体中的声学声子的相互作用(所述声学声子是晶格振动的振动量子)，或与液体中的弹性波的相互作用。
[0084]更优选地，该样品被激光束激发并在一个、两个或更多个角度测量散射光的检测。最优选地，通过散射比浊法检测光散射。
[0085]可以检测前向散射光(在160°至180°角度下测得)和/或侧向散射光(在〈160°的角度下测得)。在本文中，前向散射光可以是在相对于激发激光束大约180°的角度处、在相对于激发激光束大约170°的角度处或在相对于激发激光束大约160°的角度处检测的光。侧向散射光可以是在相对于激发激光束的任何其它角度处检测的光。示例性地，该侧向散射光可以在大约30°、40°、45°、70°、75°和/或90°的角度处检测。但是，本领域技术人员将注意到，在任何其它角度处的检测也可用于本发明。该检测还可以在变化的角度下进行，即在该方法过程中经时改变的角度下进行。或者，该检测还可以同时在两个或更多个不同角度下进行。当测量不同角度下的光散射，这可以称为动态光散射。激发可以是连续激发，或者可以是脉冲激发，其中激发时间在纳秒、微秒或秒的范围内。脉冲激发可以重复任意多次。该测量可以进行一次或超过一次。示例性地，该测量可以重复两次、三次、四次、五次、十次、20次、30次、40次、50次、100次、150次、200次、250次或通常更多次。示例性地，一个测量周期可以持续小于I μ S、大约10μ s、0.1s,0.5s、1.0s、1.5s、2s、5s、IOs或更长时间。
[0086]该波长和激光强度可以根据样品进行调节。如本文中所用，激光衍射的检测可以通过本领域已知的适于检测光衍射的任何方法进行。通常，光衍射基于量子理论。与粒子相关的波长是德布罗意波长:
[0087]粒子的动量(P)=[普朗克常数(h)]/[波长(λ)]
[0088]在本文中，对缓慢移动的粒子，粒子的动量对应于其质量乘以其速度。
[0089]如在本发明中所用，沉降技术(sedimentation techniques)可以在广义上理解为基于本发明的CPPs的沉降的任何方法。沉降技术可以仅基于自然重力，或可以通过离心力加速进行。优选地，本发明中的沉降技术可以通过离心力加速进行。任选地，可以测定沉淀物的体积和/或重量，特别是可以测定沉淀物与上清液的体积比和/或重量比。或者和/或此外，可以测定沉淀物的沉降常数。或者和/或此外，可以测定沉淀物的重量密度，例如通过蔗糖梯度离心。
[0090]要理解的是上述方法的两种或更多种可以彼此结合。此外，要理解的是，上述方法中的两种或更多种可以与一种或多种光学方法结合。
[0091 ] 该激发光可以是本领域已知的任何光源。优选地，该激发光是激光束或汞灯。
[0092]在一个优选实施方案中，该光学方法中所用的激发光是激光束。
[0093]如本发明中所用，激光器可以是本领域已知的任何激光器。激光器通常显示使用其它技术无法达到的相当高度的空间与时间相干性。优选地，该激光器进一步是单色的和/或选择一条激光线用于发射。示例性地，该激光器可以是HeNe或氩离子激光器。HeNe激光器通常发射大约633nm的波长的光，氩离子激光器通常发射大约488nm的波长的光。可以对样品调节激光强度。对于散射比浊法，激光强度可以示例性地为0.1至IOOOmW,优选为I至100mW，更优选为10至50mW。
[0094]此外，激光器发射的光和/或散射光可以被引导穿过一个或多个滤光片、一个或多个半透镜和/或一个或多个声-光分束器和/或可以借助一个或多个棱镜和/或一个或多个光栅将光分裂为特定波长。可以通过本领域已知的任何装置检测光。示例性地，该检测器可以是雪崩光电二极管(APD)、光电倍增管(PMT)和/或二极管阵列。二极管阵列可以包含超过四个、超过十个、超过100个、超过1000个或甚至超过10000个二极管。
[0095]在更优选的实施方案中，该光学方法通过检测光散射，优选通过动态光散射(dynamic light scattering),更优选通过互相关动态光散射(cross-correlationdynamic light scattering),再更优选通过三维互相关动态光散射(three-dimensionalcross-correlation dynamic light scattering),特别是通过散射比池法(nephelometry)来进行。
[0096]如本文中所用，检测光散射可以是检测静态光散射或检测动态光散射。优选地，检测光散射是检测动态光散射。
[0097]作为物理学中的技术，本发明中所用的术语“动态光散射”可以与术语“光子相关光谱法”和“准弹性光散射”互换理解，其可用于通过观察散射强度方面的时间依赖性波动测定溶液中悬浮液中的小粒子的尺寸分布状况。通常，这些波动因以下事实而发生:溶液中的小分子经历布朗运动，因此溶液中的散射体之间的距离不断随时间变化，导致被周边粒子交替地相长和相消干涉。在强度波动中，可以获得散射体运动的时间尺度上的信息。
[0098]该动态光散射可以基于任何类型的光散射。通常，该光散射包含瑞利散射。优选地，该发射光是激光。示例性地，该动态光散射可以是准弹性激光光散射。随后，该粒子的动态信息可以源自于实验过程中记录的强度轨迹的自相关(autocorrelation)。
[0099]在本发明中，术语“互相关”可以在广义上理解为信号处理中两个波形的相似性的量度。其通常用于对较短特征搜寻长时间信号。
[0100]本文中所用术语“三维互相关动态光散射”、“3D互相关动态光散射”和“3D动态光
散射”可以互换理解。
[0101]本发明中所用的术语“散射比浊法”可以在广义上理解为通过以下实施的方法:根据小颗粒的稀悬浮液散射穿过其中的光而不是简单地吸光的原理，通过测量在一定角度上穿过该样品的光的光强度，由此测量在广泛含水样品中的浊度。散射比浊法可以手动测量，或以半自动或自动方式测量。
[0102]在这方面，可以在任何角度处测量散射光，例如在大约30°、40°、45°、70°、75°和/或90°。最优选以90°几何形状检测光。获自样品的结果任选与获自校准样品的一个或多个值比较，或与一条或多条标准曲线比较。
[0103]散射比池法可以是终点散射比池法(end point nephelometry),或者以动态比池法(kinetic nephelometry)形式经时测量。本文中所用的终点散射比池法是指CPPs的生成或尺寸的重排可以广泛完成并且不会或几乎不会发生任何变化。在动态比浊法中，经时测量光散射。通常，光散射的测量在加入钙和/或磷酸根后立刻开始，并随后持续一段时间。动态比浊法允许观察粒度分布和平均粒度随时间的变化。优选地，本发明中所用的散射比浊法是动态比浊法。为了能够检测可能已经沉降到样品底部的大粒子，该样品可以任选在每次测量前摇振或混合。只要该试剂是恒定的，变化的速率可以视为与体液的钙化倾向的量直接相关。
[0104]或者为了实施通过光学方法测定初级CPPs向次级CPPs转变的转变速率的步骤(步骤(iii))，其还可以通过本领域已知的任何其它合适的方法实施。此类方法优选基于检测存在于该样品中的粒子的平均尺寸或平均质量。
[0105]在本发明中，测定初级和/或次级CPP的生成速率、初级和/或次级CPP的量和/或初级CPP转变为次级CPP的速率中的一种或多种的步骤(步骤(iii))还可以是本领域已知的任何其它方法，由此也可以是非光学方法，或两种或更多种非光学方法的组合，或一种或多种光学方法与一种或多种非光学方法的组合。
[0106]在本发明的一个优选实施方案中，测定初级和/或次级CPP的生成速率、初级和/或次级CPP的量和/或初级CPP转变为次级CPP的速率中的一种或多种的步骤(步骤(iii))通过选自如下的任意方法实施:
[0107]沉降技术(sedimentationtechniques),
[0108]过滤分析(filtrationanalysis),
[0109]尺寸排阻色谱法(sizeexclusion chromatography),
[0110]粒度测定法(granulometry),
[0111]声谱法(acoustic spectroscopy),
[0112]或其两种或更多种的组合。
[0113]本发明中所用的术语“沉降技术”可以在广义上理解为基于初级和/或次级CPPs的沉积的任何方法。优选地，初级CPPs和次级CPPs可以具有不同的沉降常数，并因此在不同的时间点处沉降。通常，次级CPPs会首先沉降。本发明的沉降技术可以仅基于重力，或可以包括离心力。本发明的沉降技术优选还包括离心力。可以形成包含次级CPPs和/或初级CPPs的片(pallet)。或者或此外，可以使用平衡离心(例如蔗糖梯度离心)。在本文中，初级CPPs和次级CPPs可以因其不同的质量密度而彼此分离。通常，可以通过测定其体积或质量或经由光学方法(例如显微镜法)对其进行观察来进一步研究分离的初级CPPs和次级CPPs。任选地，可以测定沉淀物的体积和/或重量。为了观察初级CPPs向次级CPPs的转变的动态曲线，可以研究多个样品。
[0114]本文中所用的显微镜法可以例如是光显微镜法(例如亮视野显微镜法)、荧光显微镜法(例如，(共焦)激光扫描显微镜法(LSM)、受激发射损耗显微镜法(STED显微镜法))、电子显微镜法(例如，扫描电子显微镜法(SEM)、透射电子显微镜法(TEM)、扫描透射电子显微镜法(STEM)、扫描隧道显微镜法(STM))、扫描氦离子显微镜法(SHIM)、扫描探针显微镜法(SPM)和/或原子力显微镜法(AFM)。
[0115]本发明中所用的术语“过滤分析”可以在广义上理解为基于样品的分子和/或颗粒筛分的任何方法。本文中所用术语“筛分”和“过滤”可以互换理解。过滤可以是死端过滤或连续过滤。任选地，该过滤还可以是交叉过滤。该粒子可以因其尺寸而分离(separated)和/或隔离(isolated)。优选地，过滤器具有允许初级CPPs通过的尺寸，而阻止次级CPPs。任选地，可以测定沉淀物的体积和/或重量，特别是可以测定沉淀物与上清液的体积比和/或重量比。
[0116]如本发明中所用，尺寸排阻色谱法可以在广义上理解为适于从体液样品中分离本发明的CPPs的任何色谱法。优选地，初级CPPs和次级CPPs表现出不同的洗脱曲线。尺寸排阻色谱法也称为分子量色谱法。任选地，可以测定沉淀物的体积和/或重量，特别是可以测定特定部分的体积比和/或重量比。[0117]如本发明中所用，光学粒度测定法可以在广义上理解为用于光学测定粒子尺寸的任何方法。在本发明中，光学粒度测定法通常是基于显微镜的方法。任选可以使用计算机辅助方法(优选基于二进制掩码)以识别特定结构并以尺寸和数量将其表征和量化。本领域技术人员将知晓如何应用本发明的相应宏。该宏可以在任何合适的计算机程序上运行，例如通过基于Java的开源程序ImageJ。
[0118]本发明中所用的术语“声谱法”可以在广义上理解为使用声音来收集分散在流体中的粒子的信息的任何方法。在本发明中，该声音通常将是超声。分散的粒子将吸收和散射超声(类似光那样)。声谱法可以基于测量散射能量vs.角度或测量透射能量vs.频率。所得超声衰减频率谱是计算粒度分布的原始数据。声谱法的一个实例是超声衰减谱。可以测定粒子的平均尺寸。
[0119]此外，本发明的步骤(iii)还可以通过电阻计数(electroresistance counting)进行。如本发明中所用，电阻计数可以在广义上理解为基于测定样品电阻变化的任何方法。优选地，引导样品穿过尺寸仅允许一次通过单个粒子或几个粒子的针头。电阻计数的一个实例是库尔特计数器，其测量单个不导电粒子穿过时发生的穿过孔口的液体的电导率的瞬时变化。通过计数脉冲来获得粒子计数，尺寸取决于各脉冲的大小。优选地，一个较大的次级CPPs的通过将显示比一个较小的初级CPPs的通过更强的信号。通过在尺寸方面设定一定阈值，可以测定初级和次级CPPs的数量。
[0120]优选地，电阻计数是电化学阻抗谱(EIS)。本文中所用术语“电化学阻抗谱”、“EIS”、“阻抗谱法”和“介电谱”可以在广义上理解为基于外部电场与样品电偶极矩的相互作用测量随频率而改变的介质介电性质(通常由介电常数来表示)的方法。任选地，通过EIS获得的数据可以以图形方式表示为Bode图或Nyquist图。
[0121]要理解的是上述方法中的两种或更多种可以彼此组合。此外，还要理解的是上述非光学方法中的两种或更多种可以与一种或多种光学方法组合。
[0122]在一个优选实施方案中，至少一种光学方法与电阻计数法组合。在更优选的实施方案中，基于光散射的方法与电阻计数法组合。在再更优选的实施方案中，基于动态光散射的方法与电阻计数法组合。在最优选的实施方案中，散射比浊法与电化学阻抗谱(EIS)组合。这可以通过任何装置来实施。特别优选地，这可以通过使用一种或多种微流体装置来实施。
[0123]优选地，所用方法可以包括至少一种光学方法和/或一种声学方法。更优选地，本发明的方法包括至少一种光学方法。
[0124]在本发明中，该流体可以是导致钙化的任何流体。该流体可以是体液或可以是技术性流体。
[0125]在一个优选实施方案中，该流体是体液，，其中该流体特别是血液、血浆、血清、淋巴液和/或尿。
[0126]本文中所用术语“体液”可以在广义上理解为可获自身体的任何流体，例如，血液、尿、脑脊髓液、淋巴液、唾液和/或来自任何腺体的一种或多种分泌物。术语“体液”还可以包括在一个或多个处理步骤(例如，离心、过滤、交叉过滤、沉淀和/或用于将生物流体分级的任何其它已知方法)后的可获自身体的任何流体，例如，血清或血浆。本文中所用术语“血液血清”和“血清”可以互换理解。同样，术语“血液血浆”和“血浆”可以互换理解。优选地，该体液是血液、血浆、血清或淋巴液。
[0127]该体液通常自患者获得而立即使用，或在几分钟或几天内使用。当样品储存超过几小时时，样品可以优选在室温下储存或储存在冰箱中。本发明中所用的术语“室温”和“环境温度”可以互换理解。或者，该样品还可以以冷冻、深冷或冷冻干燥状态储存，并可以储存在低于凝固点的任何温度下，例如在-20°C下、在_80°C下或在液氮中。冷冻干燥粉末也可以在环境温度下储存。由患者获得体液通常不会对患者造成健康风险，或可以由并非医学专家的人进行，例如甚至由患者在家中进行。
[0128]在更优选的实施方案中，该流体是获自患者的体液，优选其中所述患者具有已发展的钙化和/或存在发展钙化的风险，其中所述患者特别是透析患者。
[0129]优选地，具有已发展的钙化和/或存在发展钙化的风险的患者具有已发展的钙化斑和/或存在发展钙化斑的风险。但是，钙化还可以是微钙化或可以是在溶液中的钙沉淀，由此可以是生成任何钙沉淀物，任选包括初级和/或次级CPPs。
[0130]该体液可以获自患者，或可以获自保存的样品，或可以是人工体液。
[0131]本文中所用术语“获自患者”可以在广义上理解为通过任何手段从患者身体接收体液。示例性地，血液可以从血管中收集，淋巴液可以从淋巴管中收集，脑脊髓液可以从脑脊髓腔收集，和/或可以收集尿和/或汗。要理解的是该体液还可被进一步处理。示例性地，血浆或血清可以通过本领域已知的方法从血液中提取。该体液可用于本发明的方法，或可以在适当条件下储存最多一小时、最多两小时、最多六小时、最多十二小时、最多一天、或甚至更久。储存超过一天的体液样品可以称为保存样品。
[0132]本文中所用术语“保存样品”可以在广义上理解为已经储存超过一天、超过两天、超过一周、超过两周、超过一个月、超过两个月、超过六个月或超过一年的任何样品。
[0133]该体液样品可以以纯体液形式储存，或可以以进一步包含上文中详细总结的样品的其它组分的样品形式储存。通常，可以使用适于该体液的所有储存条件。示例性地，该体液样品可以在室温下、在4°C下、在-20°C下、在-80°C下或在液氮中储存。因此，该体液样品可以以液体或冷冻状态储存。或者，该体液样品可以以冷冻干燥或干燥状态储存。保存样品可以例如是保存血(blood preservation)、保存血清或保存血衆(serum or plasmapreservation)、或保存淋巴液(lymph preservation)。
[0134]该患者可以是健康患者或尤其具有钙化风险的患者。该患者优选具有提高的发展钙化斑的倾向。这种提高的倾向可能是由于先天和/或后天原因。
[0135]本发明中所用的术语“患者”可以在广义上理解为无论是否出现临床症状并自其获取体液的任何主体或个体。该患者可以是任何动物，包括人类。优选地，该患者是哺乳动物，最优选为人类。
[0136]具有已发展的钙化斑和/或存在发展钙化斑风险的患者可以是健康的或尤其具有钙化风险的。该患者可以遭受或不遭受任何临床症状如高渗压、糖尿病、肾功能不全或类风湿病。示例性地，肾功能不全可能是慢性肾病(CKD)。
[0137]本文中所用术语“身体”可以在广义上理解为任何活体或在少于十年前、少于五年前、少于四年前、少于三年前、少于二年前、少于一年前、少于六个月前、少于五个月前、少于四个月前、少于三个月前、少于二个月前、少于一个月前、少于两周前、少于一周前、少于两天前、少于一天前、少于十二小时前、少于六小时前、少于一小时前存活过的主体。该身体优选是任何动物的身体，包括人类。动物优选是脊椎动物，更优选为吸热动物，再更优选为哺乳动物，最优选为人类。
[0138]任选地，可以将作为潜在或已知的钙化抑制剂或促进剂的化合物添加到该体液中。随后可以测试所述化合物抑制或促进钙化的效力，特别是当包含所述化合物的样品与不含该抑制剂的相应样品比较时。有利地，本发明的方法提供了表征化合物在其天然方面，即在体液中的作用的可能性。钙化抑制剂例如是胎球蛋白(例如，胎球蛋白A)和白蛋白(例如，血清白蛋白)。在体外，还可以使用螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或固定的阳离子交换剂以抑制钙化。
[0139]进一步地，此外或或者，磷酸盐结合剂也可用于抑制钙化。示例性地，常见的磷酸盐结合剂包含氢氧化招(例如，Alucaps)、碳酸|丐(例如，Calcichew、Titralac)、乙酸钙(例如，Phosex、PhosLo)、碳酸俩(Fosrenol)、司维拉姆(例如，Renagel、Renvela)和乙酸?丐 / 碳酸镁(例如，Renepho、OsvaRen)。
[0140]该体液还可以是通过在水溶液中混合和溶解一种或多种组分获得的人工体液。
[0141]本文中所用术语“透析患者”可以在广义上理解为需要人工代替或支持肾功能损失或受限的任何患者。要理解的是透析患者通常是尤其具有发展钙化斑风险的患者。
[0142]在另一更优选的实施方案中，该患者遭受血管、瓣膜和/或软组织的钙化，优选其中所述患者进一步遭受类风湿病(rheumatoid disease)、恶性病(a malignant disease)和/或传染性疾病(in fectious disease),特别是其中该患者显示选自以下的至少一种症状:
[0143]肾功能不全(renaldysfunction),
[0144]高血压(hypertension),
[0145]糖尿病(diabetesmellitus),
[0146]血脂异常(dyslipidemia),
[0147]缺乏足够的矿化，特别是骨质疏松症(osteoporosis)和/或骨软化症(osteomalacia),和
[0148]动脉粥样硬化(atherosclerosis)。
[0149]本发明中所用的术语“类风湿病”可以在广义上理解为影响关节和结缔组织的任何健康问题，通常主要由关节炎引起。在本文中，术语“类风湿病”、“风湿病”、“风湿性失调”和“风湿性疾病”可以互换理解。类风湿病可以包括但不限于硬皮病(sclerodermia)、纤维肌痛综合征(fibromyalgia syndrome)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、滑囊炎(bursitis)、腱炎(tendinitis)、腕关节炎(twist)、关节囊炎(capsulitis)、骨关节炎(osteoarthritis)、银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)、风湿热(rheumatic fever) >风湿性心脏病(rheumatic heart disease)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、颞动脉炎(temporal arteritis)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatic)、腱鞘炎(tenosynovitis)、复发性风湿病(palindromic rheumatism)和肌炎(myositis)。但是,类风湿病也可以包括非关节性风湿病(non-articuIar rheumatism)(例如，局部疼痛综合征(regional pain syndrome)、软组织风湿病(soft tissue rheumatism))。
[0150]本发明中所用的术语“恶性病”可以在广义上理解为本领域已知的任何恶性病症。恶性病可以是导致瘤形成(neoplasia)的病症，特别是一种或多种肿瘤。恶性病因此可以是溶瘤细胞病症(oncolytic disorder)，包括癌症。术语“癌症”可以理解为最广泛的意义。其可能包括发生原发性和继发性肿瘤、转移瘤、和其它类型的病理肿瘤(pathologicalneoplasms)。但是，恶性病还可以是非溶瘤细胞病症，如恶性高血压、恶性高热、恶性外耳炎(malignant otitis externa)、恶性间日痕(malignant tertian malaria)(通常由键状痕原虫(Plasmodium falciparum)造成)或抗精神病药恶性综合征(neuroleptic malignantsyndrome)。
[0151 ] 传染性疾病可以是本领域已知的任何感染性疾病。
[0152]本文中所用术语“综合征”可以在广义上理解为往往发生在特定疾病或病症情况下的一种或多种临床可识别特征、体征、症状、现象和/或特性的任何关联，使得一个或多个特征的存在可以表明该疾病或病症的存在。综合征可以由医学专家，即医生或护士观察到和/或由患者观察到并可能报告的。
[0153]本文中所用术语“肾功能不全”可以在广义上理解为肾脏系统，特别是肾脏的任何功能失常。示例性地，肾功能不全可以是慢性肾病(CKD)。任选地，该肾功能不全还可以是肾病。术语“肾病”是指一个或两个肾的功能异常或无功能。
[0154]本文中所用术语“高血压”和“高渗压”在最广泛意义上可以互换理解为高血压症状，并且是本领域公知的。
[0155]本文中所用术语“糖尿病”和“糖尿症”可以在广义上理解为特征在于血糖水平调控失败的一类病症。其包含一类其中人具有高血糖的代谢性疾病。通常，当患者身体不再产生足够的胰岛素和/或当患者体内的细胞不能适当响应产生的胰岛素时，发生糖尿病。糖尿病会任选导致多种临床和非临床症状，如多尿(尿频)、烦渴(口渴增多)和/或多食(饥饿感增加)。
[0156]本发明中所用的术语“血脂障碍”和“血脂异常”可以在最广泛意义上互换理解为特征在于血液中含有不正常的脂质(例如胆固醇和/或甘油三酯)量的任何病症。
[0157]本发明中所用的术语“骨质疏松症”可以在广义上理解为其特征在于骨矿物质密度(BMD)降低、骨骼微结构退化和/或骨中蛋白质数量和种类的变化的病症。
[0158]本发明中所用的术语“骨软化症”可以在广义上理解为其特征在于骨软化的病症。其可以由有效磷和钙量不足继发的骨质矿化缺陷造成和/或由甲状旁腺功能亢进所导致的钙自骨的过度吸收造成。
[0159]本文中所用术语“动脉粥样硬化”、“动脉硬化”、“心血管动脉粥样硬化”、“心血管动脉硬化”和“心血管斑块”可以在最广泛意义上互换理解为在血管中的斑块沉积。该斑块可以沉积在血管内腔中或沉积在中等尺寸血管壁的中层(中膜)中。该斑块可以包含与其它矿物质结合的钙盐、蛋白质、脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和/或糖。此外，细胞或细胞片段如巨噬细胞、红血球(RBCs)和血小板可以是该斑块块的一部分。动脉粥样硬化的病理形式也可以称作动脉硬化性血管疾病或ASVD。心血管斑块会提高许多疾病如高渗压、心肌梗死和脑卒中(中风)的风险。钙化的高度显著形式会进一步导致肢体如腿的截肢的必要性。动脉粥样硬化的最显著形式之一是门克伯格氏动脉粥样硬化。术语“门克伯格氏动脉粥样硬化”和“中膜钙化性硬化”可以互换使用。门克伯格氏动脉粥样硬化是动脉粥样硬化的最严重形式之一。这里，当钙沉积物形成于中等尺寸血管壁的中层(中膜)时，血管硬化。如本文中所用，动脉粥样硬化还包括钙化防御(一种严重的血管钙化症状)、血栓形成和皮肤坏死。
[0160]在一个优选实施方案中，该流体是人工体液和/或输入液(infusion solution)。
[0161]本文中所用术语“人工体液”可以在广义上理解为本领域中对任何体液的任何补充剂。示例性地，其可以是血液代用品、血浆代用品、或血清代用品。示例性地，血液代用品可以包括但不限于全氟化碳基血液代用品(例如，Oxygent (AlliancePharmaceuticals)、 Oxycyte(Oxygen Biotherapeutics)、 PHER-02(SanguineCorp)、Perftoran)、血红蛋白基血液代用品(例如，Hemopure (Biopure Corp)、Oxyglobin (Biopure Corp)、PolyHeme (Northfield Laboratories)、Hemospan (Sangart)、Dextran-Haemoglobin (Dextro-Sang Corp)、Hemotech (HemoBiotech))、Fluorasol-DA、HemAssist (Baxter International)或 Hemolink (Hemo sol, Inc.)。此夕卜，血液代用品可以获自干细胞，其中干细胞优选不是人胚胎干细胞。此外，树枝状聚合物、可生物降解的胶束胎盘脐带血液或蚯蚓血红蛋白可用于获得血液代用品。
[0162]本文中所用术语“输入液”可以在广义上理解为本领域已知的适于输液的任何溶液。示例性地，输入液可以是等渗电解质溶液、等渗生理盐水、等渗全电解质溶液、葡萄糖溶液、林格氏溶液或胶体溶液。要理解的是，输入液可以进一步含有一种或多种药学活性剂、一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。通常，该输入液可以包含任何药学可接受组分，其可以是带电荷或不带电荷的，极性或非极性的，高分子量或小分子。
[0163]要理解的是人工体液或输入液可以包含或不包含任何本领域已知的钙化抑制剂或促进剂。其可以天然地包含所述钙化抑制剂或促进剂，或者可以将所述钙化抑制剂或促进剂添加到此类人工体液或输入液中。通常，该技术性流体可以包含本领域已知的任何钙化抑制剂。示例性地，此类钙化抑制剂可以是胎球蛋白多肽(例如，胎球蛋白A)和白蛋白(例如，血清白蛋白)，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、固定的阳离子交换剂或磷酸盐结合剂(氢氧化招(例如，Alucaps)、碳酸隹丐(例如，Calcichew、Titralac)、乙酸隹丐(例如，Phosex、PhosLo)、碳酸俩(Fosrenol)、司维拉姆(例如，RenageI> Renvela)和乙酸隹丐/碳酸镁(例如，Renepho、OsvaRen))。
[0164]在另一优选实施方案中，该流体是技术性流体，优选其中所述流体是含水流体，特别是其中所述流体是工业过程流体、包含洗衣剂或洗碗剂的流体、肥皂液、沐浴液、入浴添加剂、冷却流体、可食用商品或意在用于生产可食用商品。
[0165]本文中所用术语“技术性流体”可以在广义上理解为在工业设施、可食用商品和/或家庭用途方面可用的任何流体。工业设施中的用途可以是例如用作工业过程流体，用作通用清洁剂，用作水添加剂(例如，用作水软化剂)或用作冷却剂。用于可食用商品生产的用途可以包括烹饪、烘焙、烧烤、油炸、冷凝、增稠、保存、干燥、冷冻干燥、注入、蒸馏。可食用商品可以包括但不限于饮料(例如，水、果汁、柠檬水、泡制饮料(例如，咖啡、茶)、速溶饮料(例如，速溶咖啡、速溶茶)、牛奶、啤酒、葡萄酒、酒、烈酒)、食品(例如，烘焙食品(例如面包、蛋糕、饼干)、糖果、水果和即食品(例如，便携汤))。用于家庭用途的流体可以例如是洗衣剂、洗碗剂、肥皂液、沐浴液、厕所清洁剂、软化剂、清洗剂、浸溃剂、浴室清洁剂、通用清洁剂、水添加剂(例如，水软化剂)或入浴添加剂。
[0166]该技术性流体可以包含或不包含清洁剂，或可以用于或不用于清洗衣物、餐具或其它家庭用品。此外，该流体还可以是家用清洁剂、厕所清洁剂、水族箱清洁剂或本领域已知用于防止或促进钙化的任何水添加剂。或者，该技术性流体可以在工业设施情况下使用。通常，该技术性流体意在避免残余物形式的钙化，所述残余物包含液体形式或干燥形式的钙盐。当使用薄壁管或管道时这会特别重要。此外，当使用具有高硬度的水时这会特别重要。
[0167]本发明的方法可以在变化的温度下、根据特定温度曲线或在恒定温度下进行。
[0168]本文中所用术语“工业过程流体”可以在广义上理解为可以具有钙化倾向的用于任何工业过程的任何流体。该工业过程流体优选可以是工业过程水。本文中所用术语“工业过程水”、“工业用水”、“工艺用水”、“工业水”和“处理水”可以互换理解。示例性地，工业过程流体可以用作冷却流体、用作清洗流体、用于脱盐或用作涡轮机(例如蒸汽涡轮机)中使用的流体。
[0169]要理解的是技术性流体可以包含或不包含任何本领域已知的钙化抑制剂或促进齐?。其可以天然地包含所述钙化抑制剂或促进剂，或者可以将所述钙化抑制剂或促进剂添加到此类技术性流体中。通常，该技术性流体可以包含本领域已知的任何钙化抑制剂。示例性地，此类钙化抑制剂可以是胎球蛋白多肽(例如，胎球蛋白Α)和白蛋白(例如，血清白蛋白)，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、固定的阳离子交换剂或磷酸盐结合剂(氢氧化铝(例如，Alucaps)、碳酸钙(例如，Calcichew、Titralac)、乙酸?丐(例如，Phosex、PhosLo)、碳酸镧(Fosrenol)、司维拉姆(例如，RenageI> Renvela)和乙酸钙/碳酸镁(例如，Renepho>OsvaRen))。
[0170]在一个优选实施方案中，所述方法在恒定温度和/或在恒定pH下进行。
[0171]本文中所用术语“恒定”意味着在本发明的方法的步骤(iii)的过程中温度广泛地保持相同。最优选 地，相互比较的样品之间的温度差值应小于5°C、小于4°C、小于:TC、小于2°C、小于1°C、小于0.5°C、小于0.25°C或甚至小于0.1°C。该恒定温度优选应当为0°C至100°C，更优选为(TC至45°C，再更优选为4°C至42°C，再更优选为20V至40°C，再更优选为36°C至38°C，再更优选为36.(TC至37.5°C和最优选为36.5°C至37.(TC。任选地，所用装置可以包括温度传感器。
[0172]本文中所用的pH(potentia hydrogenii)可以理解为本领域通常所理解的含义，即理解为流体中氢离子活度的负十进制对数。
[0173]本文中所用术语“恒定”意味着在本发明的方法的步骤(iii)的过程中pH广泛地保持相同。最优选地，相互比较的样品之间的PH差值应小于3pH单位、小于2pH单位、小于IpH单位、小于0.8pH单位、小于0.6pH单位、小于0.4pH单位、小于0.2pH单位、小于0.1pH单位或小于小于0.05pH单位。该pH可以调节为任何pH。该pH优选可以为广泛中性的pH，即pH5.5至pH8.0，更优选为pH6.0至pH8.0，再更优选为ρΗ6.5至ρΗ7.8，再更优选为ρΗ7.2至ρΗ7.6,最优选为生理pH,即在大约7.4的pH下。
[0174]如上所述，该样品优选为流体样品。该方法可以在适于实施本发明的方法的任何装置中实施。要理解的是，载体的选择将取决于具体方法。示例性地，该方法可以使用一个或多个比色皿、使用一个或多个显微镜载玻片、使用多孔式装置(multiwell format)、使用微阵列、使用一个或多个塑料反应管、使用一个或多个玻璃小瓶、使用色谱柱、使用注射器、使用针头或使用其中的两种或更多种的组合来实施。要理解的，所用装置的表面应当不干扰或近乎不干扰该方法，因此特别是不干扰钙化的倾向。
[0175]在一个优选实施方案中，该方法在下列之一的装置中进行:
[0176](a)多孔式装置，更优选在8孔板、在16孔板、在96孔微量滴定板或在384孔微量滴定板中，特别是在96孔微量滴定板中；
[0177](b)流通池；或
[0178](C)微流体装置。
[0179]本文中所用术语“流通池”可以在广义上理解为在其中体液样品被引导穿过测定钙化倾向的所在处的装置。在本文中，该流可以是稳定流，或可以为测量而中断。
[0180]获自本发明的方法的数据可以手工分析、半自动分析或自动分析。
[0181]通常，该方法可以离线或在线进行。
[0182]本文中所用术语“离线”可以在广义上理解为其中在第一步骤中提供体液样品(例如患者身体、保存样品或技术性流体的样品)并随后进行本发明方法的步骤(i)至(iii)的任何方法。随后，该方法是分批进行的。示例性地，可以在患者的血液循环与透析机连接之前、同时或之后离线诊断自透析患者获得的体液的钙化倾向。同样可适用于在用于技术装置前对样品进行离线测量(例如用于冷却回路中的冷却流体或洗衣机中的洗衣剂)。
[0183]本文中所用术语“在线”可以在广义上理解为其中提供体液样品与本发明的方法的步骤(i)至(iii)广泛地同时进行的任何方法。随后，提供体液，引导其通过装置并同时进行测量。在这里，该流可以是稳定流，或可以为测量而中断。任选地，该体液直接从患者提取。任选地，分析的体液或其部分引导回到患者体内。在线装置可以任选甚至装入患者体内。同样可对来自技术装置的样品进行在线测量(例如冷却回路)。通常，在线测量是经时测量。示例性地，当患者血液循环与透析机连接时，可以在线诊断获自透析患者的体液的钙化倾向。本发明的方法因此可以自动或半自动地实施。该透析机甚至可以包含实施本发明的方法的装置作为固有单元或作为附加组件。
[0184]该测量可以经时进行或可以是在结束点的测量。优选该测量是经时测量。
[0185]本发明中所用的术语“经时”可以在广义上理解为任何如下测量:其中在不同的时间点对一个样品进行测量。经时测量还可称为动态测量。示例性地，经时测量可以是动态散射比浊法。本领域技术人员将注意到，两次测量之间所选的时间间隔通常取决于粒子的生成和/或重排的速率。为了测定粒子的快速生成和/或重排，本领域技术人员通常将选择短时间间隔，而对于较慢的过程通常将选择较长的时间间隔。该时间间隔通常为几分钟直至数小时。如上所述，该速率通常取决于介入的浓缩与稀释。示例性地，测量可以经几秒钟、几分钟、几小时、几天或甚至几周的总时间进行。优选地，在经时测量的情况下，该测量可以在添加钙和/或磷酸根后立即开始。只要试剂是恒定的，变化的速率可以视为与体液的钙化倾向的量是正相关的关系。为了检测可能已经沉降到样品底部的大粒子，任选在各次测量前摇振或混合该样品。
[0186]本文中所用术语“终点”可以在广义上理解为在CPPs的尺寸的生成或重排广泛完成并且不会或几乎不会发生任何变化的时间点进行的测量。为了检测可能已经沉降到样品底部的大粒子，任选在测量前摇振或混合该样品。
[0187]本发明的方法可以通过本领域已知的任何适于该方法的原理进行。测定初级CPPs向次级CPPs的转变的转变速率的步骤(步骤(iii))可以通过本领域已知的任何方法进行。此类方法优选基于检测样品中存在的粒子的平均尺寸或平均质量。
[0188]本文中所用术语“微流体装置”可以在广义上理解为任何小型化的诊断工具。该微流体装置可以是适于本发明的任何本领域已知的微流体装置。微阵列也可以理解为芯片实验室(lab-on-a-chip)。通常该微流体装置是在固体基底例如玻璃载玻片、陶瓷载玻片、金属载玻片、娃薄膜电池(silicon thin-film cell)、塑料载玻片或光盘(CD)格式上的二维阵列。为了实现本发明的光学方法，该微流体装置的至少一部分优选对本发明的方法所用的光是可透的。该微流体装置可以包含一个或多个微流体通道和/或腔室。这些通道还可以用于混合样品。在微流体装置中，可以加速形成初级和/或次级CPPs和/或初级CPPs转变为次级CPPs的过程。该微流体装置还可以是流通池。微流体装置还可以是医疗诊断试纸，特别是在尿作为流体的情况下。
[0189]该方法可以手动、半自动或自动进行。
[0190]在一个优选实施方案中，至少测定初级和/或次级CPPs的生成速率、初级和/或次级CPPs的量和/或初级CPPs转变为次级CPPs的速率中的一种或多种的步骤(步骤
(iii))是自动的，更优选至少在允许形成钙蛋白粒子(CPPs)的条件下培育所述样品的步骤和测定初级CPPs向次级CPPs转变的转变速率的步骤(步骤(ii)和(iii))是自动的，特别是步骤(i)、(ii)和(iii)均是自动的。
[0191]本发明中所用的术语“自动的”和“自动化的”可以在最广泛意义上互换理解为使用任何控制系统和/或信息技术，特别是计算机辅助方法，以减少该方法中对人类工作的需要。示例性地，本文中所用的自动化可以包括使用自动移液管和/或计算机辅助读取方法。任选地，自动化甚至可以包括计算机辅助实验设计和/或获得的数据的计算机辅助分析。获得的结果的图形显示也可包括在内。
[0192]在一个优选实施方案中，该初级CPPs具有小于IOOnm的平均直径，该次级CPPs具有大于IOOnm的平均直径。
[0193]更优选地，初级CPPs的尺寸为50nm至IOOnm,最优选为大约60nm至75nm。该次级CPPs可以更优选具有IOOnm至500nm的尺寸，最通常为大约IOOnm至200nm。但是，如上所述，本领域技术人员将理解，初级CPPs的尺寸以及次级CPPs的尺寸通常取决于该方法中使用的特定浓度和条件。
[0194]对该体液测定的初级CPPs向次级CPPs的转变的转变速率可以通过不同体液样品的相互比较来分析，或可以与一种或多种校准样品进行比较。
[0195]在一个优选实施方案中，测定初级和/或次级CPPs的生成速率(a)、测定初级和/或次级CPPs的量(b)和/或测定初级CPPs转变为次级CPPs的速率(c)中的一种或多种的步骤(iii)与一种或多种对照物样品进行比较。
[0196]本发明中所用的术语“对照物样品”可以在广义上理解为可用作参比样品的任何样品。本文中所用术语“对照物样品”和“校准样品”可以互换理解。该对照物样品可以是标准化样品(例如，具有已知性质的样品)或可以是内建对照物，即受试样品之一。通常，在广泛相同的反应条件下(例如，在广泛相同的温度下、在广泛相同的缓冲液中、在广泛相同的PH下、采用广泛相同的可溶性钙盐和可溶性磷酸盐的浓度测得)并采用广泛相同的方法，该对照物样品也将显示广泛相同的结果。研究的样品与对照物样品的钙化倾向可以在阵列中(例如在一个微孔板上或在一个微流体装置上或一个微流体装置中)同时测量，或可以在同一天先后测量(例如在比色皿中)或甚至可以在不同日子测量(例如，用于测定钙化倾向的装置已经通过对照物样品校准，或事后通过对照物样品校准)。
[0197]使用对照物样品可以使测量标准化，由此使得在同样进行该测量的装置上将获得的结果与对照物样品比较或参照该对照物样品时该方法与设备无关。变化随后可以量化为相对于对照物样品的变化。校准样品可以包含一种或多种体液或可以是人工样品。任选地，人工样品可以含有规定浓度的初级CPPs向次级CPPs转变的抑制剂，例如胎球蛋白多肽(例如，胎球蛋白A)或白蛋白多肽(例如，血清白蛋白)。
[0198]当该流体是体液时，本发明中的对照物样品优选是获自健康患者的样品。当该流体是技术性流体、人工体液或输入液时，本发明中的对照物样品优选是具有可接受的钙化倾向的样品。在钙化倾向显著高于对对照物样品获得的钙化倾向的情况下，这表明钙化倾向不合意地高并任选需要进一步行动(例如施加或使用钙化抑制剂)。在钙化倾向显著低于对对照物样品获得的钙化倾向的情况下，这表明钙化倾向不合意地低并任选需要进一步行动(例如施加或使用钙化促进剂、钙和/或磷酸根)。
[0199]由本发明的任意方法获得的数据可以通过本领域已知的任何措施进行分析。
[0200]在一个优选实施方案中，步骤(iii)的测定初级CPPs转变为次级CPPs的速率通过测定初级CPPs向次级CPPs的转变的半数最大转变时间(T5tl)的时间点来测定。
[0201]本发明中所用的术语“半数最大转变时间”或“T5(l ”可以在广义上理解为其中初级CPPs向次级CPPs的转变完成一半(50%转变)的时间点。T5tl的维度是时间，因此以单位秒(s或sec)、分钟(min)、小时(h)、天⑷、周(W)、月或年(a)给出。最通常地，该T5tl以分钟为单位给出。
[0202]该T5tl值可以通过将测得的样品的光散射(例如以相对散射比浊单位(RNU)为单位)对时间(例如以[min]为单位)绘图，示例性地通过绘制XY图(参照图1B)来测定。绘制的数据可以通过非线性回归来拟合(例如，以log(激动剂(agonist)) vs.响应-可变斜率)。随后，测定其中仅存在初级CPPs的样品中的光散射，以及其中仅存在次级CPPs的样品中的光散射。计算光散射之间的算术平均值。最后，测定其中总光散射代表此类算术平均值的时间点(T5tl)。在这方面，该T5tl值也可以称为RNUt5ci值。
[0203]本发明的方法可任选进一步包括经由本领域公知的斯托克斯-爱因斯坦方程由二阶累积量拟合来计算流体动力学半径(Rh)。随后，该T5tl值也可以通过对测得的样品中CPPs的平均直径尺寸(例如，以[nm]为单位)对时间(例如，以[min]为单位)绘图,示例性地通过绘制XY图(参照图1A)来测定。绘制的数据可以通过非线性回归来拟合(例如，以log (激动剂)vs.响应-可变斜率)。随后，测定初级CPPs的平均粒度和次级CPPs的平均粒度。计算初级CPPs的平均粒度和次级CPPs的平均粒度之间的算术平均值。最后，测定其中所有CPPs的平均粒度代表此类算术平均值的时间点(T5tl)。
[0204]绘制该数据、拟合该数据和/或计算该T5tl (或RNUtsi)值可以手工进行，或可以通过计算机辅助方法进行。计算机辅助方法可以通过任何合适的程序进行，例如通过Excel?和 / 或GraphPad Prism?。
[0205]本发明的方法可用于科学、工业和/或临床目的。示例性地，其可用于获得患者体内钙化倾向的先天因素和/或后天因素之间相互作用方面的更多信息。此外，该方法还可以用于识别和表征钙化抑制剂与促进剂。该方法甚至可用于化合物的初次和/或二次筛选以确定它们对钙化的影响。这种筛选可以是无细胞筛选(cell-free screening)或任选为高通量筛选(high-throughput screening) ?
[0206]在识别与表征钙化抑制剂和促进剂方面，可以将抑制剂或促进剂施用于患者或者在体外与体液混合。当可以向患者施用该抑制剂或促进剂时，随即在一段特定时间后，获得来自所述患者的样品并通过本发明的方法进行测试。当将抑制剂或促进剂在体外与体液混合时，随即在混合抑制剂或促进剂后将该样品培育一段特定时间，并随后实施本发明的方法。
[0207]本发明的方法可用于识别未知的钙化抑制剂和促进剂，并用于更详细地测试已知的特性的钙化抑制剂和促进剂。此外，可以研究不同的一种或多种抑制剂和/或一种或多种促进剂之间的相互影响。该抑制剂与促进剂可以是在患者体内或在医药产品或组合物中(例如，保存血，在医疗装置表面处)活性的化合物。或者，该抑制剂和促进剂还可以是在非医疗情况下活性的化合物。示例性地，钙化抑制剂可用于消费品(例如洗衣剂、洗碗剂、家用清洁剂、厕所清洁剂、水族箱清洁剂等等)和水添加剂。
[0208]此外，本发明的方法还可用于测定患者对发展钙化的风险。随即，医生和/或医疗工作人员可以在是否或如何用钙化抑制剂治疗患者方面获得更多信息，并由此能够做出明智的治疗决策。
[0209]下面的附图和实施例旨在阐述本发明而非限制权利要求书所赋予的保护范围。
【专利附图】

【附图说明】
[0210]图1.检测CPP转变。(A)在胎球蛋白A和人血清的存在下的CPP转变的3D-DLS检测。(B)在人血清的存在下的CPP转变的散射比浊法检测。(C)溶液中含有CPPs (上)和在溶液急速离心后(下)的标准浊度计化验血清溶液的肉眼可视外观(gross visualappearance)。在标准光度测定瓶中在37°C下并使用与最终浊度计化验中相同的各比例溶液进行试验。
[0211]图2.确定浊度计化验条件。(A)不同钙和磷酸根浓度的影响。最终选择钙IOmM和磷酸根6mM作为化验的标准浓度。(B) pH的温度依赖性。将通过Hepes或Tris缓冲的钙或磷酸根溶液由室温加热至40°C并记录pH值。选择对温度较不敏感的Hepes缓冲液用于化验。(C)pH的影响。测试将pH值由7.1调节至7.6的钙和磷酸根溶液。选择在37°C下
7.40的pH用于该化验。(D)血清量的影响。测试了 60 μ I至100 μ I的血清量(在所有小瓶中用NaClHOmM补充缺少的体积至200 μ I的量)，最终选择80 μ I血清用于该化验。
[0212]图3.浊度计化验条件。(A)当用来自健康志愿者的混合血清并用在室温下运行的Nephelostar?仪器和设定在37°C的内置散热器(internal radiator)进行时的化验结
果。(B)当用来自健康志愿者的混合血清，其中关闭了Nephelostar?散热器且化验在设定为34.5 °C的温控室中进行的化验结果。在这些条件下在Nephelostar?板支架中的所得测量温度为36.5至37°C。
[0213]图4.在钙化动物模型中的浊度计化验。(A) 10至16周龄dba2胎球蛋白A敲除(-/-)和野生型(+/+)小鼠的说明代表性X射线，显示了胎球蛋白A敲除小鼠的过度病理钙化。杂合子小鼠具有与野生型小鼠相同的表型。(B)野生型(Wt)、杂合子(het)和敲除(ko)小鼠血清的区分。(C)采用来自胎球蛋白A敲除、杂合子和野生型小鼠的血清进行的浊度计化验结果。(D)来自16周龄腺嘌呤处理过的具有血管中层钙化的尿毒症鼠(对钙茜素染色)和不具有钙化的健康鼠的说明代表性主动脉组织学。(E)来自尿毒症和非尿毒症动物的样品之间的比较。(F)使用来自20位血液透析患者(黑)和20位健康志愿者(灰)的血清的散射比浊法化验。
[0214]图5.CPPs的粒子表征、显微镜外观和分子组成。(A)初级CPPs的扫描电子显微镜法(SEM)(左)和透射电子显微镜法(TEM)(右)。⑶次级CPPs的SEM (左)和TEM (右)。(C)初级和次级CPPs的蛋白质内容物的考马斯蓝染色(左)和初级与次级CPPs的白蛋白与胎球蛋白A的蛋白质印迹(western blots)(右)。(D)在形成CPPs时磷酸根从溶液中消失。
[0215]图6.加标血清组分的化验依赖性。(A)在不存在血清的情况下的散射比浊法:仅加标胎球蛋白A(最强的固有血清钙化抑制剂)，其明显影响了该化验。(B)在血清存在下的散射比浊法:所有加标物质影响该化验。(C)B中显示的数据的替代显示。(a)和(B)中使用的物质浓度与(C)的图例中给出的相同。
[0216]图7.二分之一最大相对散射比浊单位(RNU5tl)和T5tl与胎球蛋白A血清浓度的关联性。在获自20位血液透析患者的血清中测量胎球蛋白A浓度，并对获自本发明的化验的RNU50 与 T50 值作图。胎球蛋白 A 浓度与(A) RNU50 (P = 0.0006)和(B)T50(p = 0.0413)高度相关。患者血清与用于图4F所示试验的血清相同。胎球蛋白A血清浓度通过由KettelerM等人描述的ELISA测量(Kettler等人，2003)。
【具体实施方式】
[0217]实施例
[0218]方法
[0219]血.清样本的取样与准备
[0220]Sarstcdl IV丨oiu.n.\Mte?瓶中取来自八位健康志愿者的静脉血液。在凝血30分钟后，在室温下将样品在3，OOOXg下离心10分钟。将来自所有的个体的血清汇集并等分。牺牲10至16周龄的DBA/2胎球蛋白A敲除、杂合子和野生型小鼠(SchMer等人，2003 ；Jahnen-Dechent等人，1997),从心脏取血样。
[0221]牺牲16 周龄雄性 Wistar 大鼠(Charles River, Sulzfeld, Germany),从下腔静脉取血样，所述大鼠已经接受用0.75%腺嘌呤和1.05%的钙、0.8%的磷、18.5%的蛋白质补充的食物达四周以引发尿毒症和血管钙化(Pasch等人，2008)。同样，从健康的、无尿毒症、无钙化的相同年龄与性别的大鼠抽取对照物血液，该大鼠已经用正常(0.9%)生理盐水中的硫代硫酸钠(0.4克/千克体重)处理过，即一周三次，共六周。值得注意的是，当以最多40mM的量添加到血清中时，硫代硫酸钠(Na2S2O3)对试验不具有任何影响。
[0222]在室温下凝血后，将来自人类、小鼠和大鼠的血液样品在室温下以3，000 Xg尚心10分钟以便分离血清与血液细胞。在液氮中快速冷冻该血清并在-80°C下储存。在用于浊度计化验前，将样品解冻，并在室温下以10，OOOXg离心30分钟以除去在样品冷冻与解冻过程中可能已经形成并会通过提供加速沉淀的核而干扰分析的潜在小粒子(冷沉淀物)。[0223]装置、塑料材料和化学品
[0224]该Nephelostar?浊度计购自德国奥芬堡的bmg labtech,该 Liquidator96? 台式移液系统购自德国吉森的Mettler Toledo GmbH。96孔板来自德国韦尔特海姆的BrandGmbH，并且96孔塑料覆盖物来自德国卡尔斯鲁厄的Carl Roth GmbH。所有化学品(例如，NaCl,Hepes,CaCl2,NaH2PO4,Na2HPO4和NaOH)以“精密分析用”等级品质购自德国达姆施塔特的 AppliChem。
[0225]蛋白质暈化
[0226]为了量化溶液中的蛋白质,根据制造商说明书使用Pierce BCA Protein分析试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)。使用 BSA (2 毫克 / 毫升，Pierce)用作标样。根据标准规程用SDS-PAGE(4% - 12% )、用每泳道加载的I毫克蛋白质或0.4毫克纯胎球蛋白A或白蛋白实施蛋白质印迹法。使用下列针对胎球蛋白A和白蛋白的一抗:多克隆兔抗人胎球蛋白A抗血清5359(德国马堡的Behring AG)和鼠抗人白蛋白(1: 2500，catalognumber0300 - 0080 ；AbD Serotec)。对于突光检测,使用下列辣根过氧化物酶偶联二抗:猪抗兔 IgG (1:5000，catalog number P0217 ;Dako)和兔抗鼠 IgG (1:2000，catalog numberP0260 ;Dako)。蛋白质染色用Imperial Protein Stain根据制造商说明书(ThermoScientific)进行；每泳道加载6.0晕克总蛋白质或2.5晕克纯胎球蛋白A或白蛋白。
[0227]三维互相关动态光散射(3D-DLS)
[0228]具有高粒子密度的溶液中的多重散射阻止通过标准动态光散射法进行表征。因此我们采用3D互相关动态光散射(3D-DLS)设置来分析浑浊的CPP样品。使用标准光散射装置(德国郎格的ALV GmbH)进行50-52次测量，所述装置具有He-Ne-激光器(JDSUniphase, Koheras GmbH, 632.8nm, 25mff, Type LGTC685-35)、两个雪崩光电二极管(PerkinEimer, Type SPCM-AQR-13-FC)和ALV5000相关仪。散射的光在几何90°下检测。样品温度通过装有Pt-100温度传感器的外部恒温器调节。流体动力学半径Rh经由斯托克斯-爱因斯坦方程由二阶累积量拟合计算。测量以2分钟间隔覆盖1400分钟的时间跨度。此前的TEM研究表明老化的次级CPPs具有椭圆形形状，轴比为大约b/a z0.3。为了清楚起见，我们计算了流体动力学半径而非半轴以表征个别CPP阶段。
[0229]浊度计化验
[0230]三维互相关动态光散射(3D-DLS)是一种方法，该方法检测溶液中的激光散射并集成这些数据以产生关于粒度经时发展的信息。
[0231]储备溶液:1.NaCl 溶液:NaC1140mM，2.钙溶液:CaCl240mM+H印esl00mM+NaC1140mM，用 NaOHlOmM 在 37°C 下将 pH 调节至 7.40，3.磷酸盐溶液:Na2HP0419.44mM+NaH2P044.56mM+Hepesl00mM+NaC1140niM,用NaOHlOmM在37°C下将pH调节至7.40。96孔板准备:所有溶液在恒温室中预热至34.5°C，这里也用LiqUidat0r96TM台式移液系统进行所有移液步骤，对每一移液步骤使用一组新的移液吸头。这些移液步骤以下列次序进行:1.NaCl-溶液:20μ I/孔，2.血清80 μ I/孔，3.摇振I分钟，4.磷酸盐溶液50 μ I/孔，5.摇振I分钟，6.钙溶液50 μ I/孔，摇振I分钟。孔中的气泡用小型打火机(pocket lighter)消退,并用微孔板用ThinSeal?粘性密封膜覆盖该96孔。由于96孔板的行A"通常显示不可靠的结果，通常将其弃去。化验条件和Nephelostar?设定:在34.5°C的恒温室中测量，其中设备的内置散热关闭。这导致了36.5°C至37°C的严苛测量温度。该Nephelostar?经由Nephelostar供应商的Windows电脑
平台上的Galaxy软件运行和控制。化验以200个周期每孔1.5秒的测量时间和水平读板模式下0.1秒的位置延迟(position delay)进行，对我们的标准化验增加了 180秒/周期的周期时间。这增加了每次化验10小时的总化验运行时间。对某些测量来说，周期时间延长至360或540秒，这分别增加了 20和30小时的化验时间。增益和激光调节设定在90%所需值，增益50，激光束焦点为1.5毫米，激光强度为50%。
[0232]数据处理
[0233]运行完成后，数据传输到Excel?并由行转换为列。数据列复制到
OraphPad Prism?程序中生成XY图。随后使用“稳健拟合”拟合方法以“log(激动剂)
vs.响应-可变斜率(四参数)”模式计算非线性回归来处理数据。对T5tl和RNUt5ci获得的所得值按需进一步处理。
[0234]结果
[0235]这里，我们测试了当使用人血清取代胎球蛋白溶液时是否还会生成初级CPPs (图1A，下部)。事实上，在两种情况下均生成了相当尺寸(直径大约50nm)的初级CPPs，其自发转变为次级CPPs (直径大约150nm)，虽然在非常不同的时间框架内(图1A)。考虑到这些非常不同的转变时间，我们认为，转变的延迟可能反映了初级CPPs的稳定性，并且测量该步骤也许能够提供对血清中固有的钙化抑制性倾向的定量评估。 [0236]由于3D-DLS尚未普及且每天仅能测量一个样品，我们希望建立一种实际且广泛适用的替代化验用于检测提到的转变步骤。散射比浊法基于与DLS相同的原理并量化浑浊溶液中激光光散射的量。因此，该转变也可通过散射比浊法检测(图1B)，值得注意的是这甚至是肉眼可见的(图1C)。
[0237]为了建立以散射比浊法为基础的化验，我们利用了以96孔板模式运行的基于自动
化激光器的微孔板浊度计Nephelostar?。所得数据使用Exeel?和GraphPad prism?
软件进行分析以产生非线性回归曲线并确定了在该时间点的半数最大转变时间(T5tl，图1A)和相对散射比浊单位(RNUt5ci，图1B)的所得值。
[0238]我们对温度(37°C )和pH(37°C下7.40)选择生理条件，并将该化验设计为每孔的最终体积为 200 μ I。这 200 μ I 由 20 μ I NaCl (140mM)、80 μ I 血清、50 μ I 磷酸盐(24mM)和50 μ I钙(40mM)的溶液组成，该溶液依此顺序混合。磷酸盐和钙溶液用NaCl(HOmM)和Hepes(IOOmM)补充，该pH调节至37°C下7.40。该混合物导致如下所述的最终浓度:
[0239]Ca2+:1 OmM
[0240]PO广:6mM
[0241]NaCl:140mM
[0242]Hepes:50mM
[0243]在ρΗ7.40 和 37? 下。
[0244]引入20 μ I NaCl作为可用于加标实验(spiking experiments)的额外体积。系统测试了宽范围的钙与磷酸根浓度(图2A)，并出于三个原因在我们的化验中最终选择了钙IOmM(即储备溶液中40mM)和磷酸根6mM(即储备溶液中24mM)的最终浓度:(i)在时间和RNU坐标体系中的中心位置处发生转变，为向各个方向的变化留出空间，(ii)这些浓度代表在形成羟基磷灰石方面钙与磷酸根的数值优化关系，(iii)我们之前已经用这些浓度进行了研究CPPs的试验。
[0245]不幸的是，标准化该化验的首次尝试显示出巨大的变化，即使在给定的96孔板中(图3A)，表明转变步骤是极为敏感的物理化学过程，这对pH(图2C)和所用血清量(图2D)的细微变化敏感。
[0246]化验的稳定化(图3B)通过引入三个重要变化来实现:(i)通过在特殊恒温室中运行该化验来稳定化验温度，并关闭Nephelostar?的内置散热器，(ii)通过使用高精确度96孔移液装置(Liquidator96TM)取代多通道移液管来稳定移液体积，和(iii)通过使用Hepes取代更温度灵敏的Tris缓冲液来降低试验的温度灵敏性(图2B)。在这些条件下，化验是稳定的，并产生了高度可重现的结果(图3B)，其日内变异为+/-5.2%，日间变异为+/-11.6%，在掌握之中。
[0247]为了证实化验结果与体内钙化之间的相关性，我们比较了胎球蛋白A敲除(ko)、杂合子(het)和野生型(wt)小鼠(图4A、B和C)的血清，并发现当与杂合子和野生型小鼠比较时，在来自敲除鼠(ko)的血清中T5tl较短。当比较来自钙化尿毒症大鼠和来自健康无钙化大鼠的血清时也发现了相同模式(图4D和E)。这里，转变(T5tl)再次在钙化动物中早于在无钙化动物中发生。
[0248]我们还测试了来自健康志愿者与血液透析患者的血清。再一次，该测试区分了易钙化和不易钙化个体，即区分了血液透析患者与健康志愿者(图4F)，表明该测试反映了血清中的钙化倾向。
[0249]这些结果证实了本文中提出的浊度计化验能够评估固有血清相关的钙化倾向。
[0250]本发明的测试通过添加Ca(IOmM)和磷酸根^mM)提高了血清的过饱和。这种过饱和的具体效果取决于 给定血清中胎球蛋白A、白蛋白、磷酸盐等等的固有浓度。作为一般规则，钙和磷酸根过饱和越高，T50越低，RNU5tl越高。这同样适用于来自HD患者和健康志愿者的血清。RNU5tl在很大程度上依赖于CPPs的蛋白质含量(胎球蛋白A、白蛋白)，磷酸盐也有一定贡献。T5tl在很大程度上依赖于Mg和磷酸盐，胎球蛋白A和白蛋白也有一定贡献。低T5tl因此常常与高RNU5tl联系在一起，反之亦然。但是，不能确定出通用的RNU5(i/T5(i比，因为两个变量依赖于不同的(尽管是重叠的)决定因素。
[0251]综上所述，我们提出了一种基于浊度计的化验，其测量了体液的钙化倾向，用血清举例显示。鉴于该化验的潜在用途的广泛领域，这种方法是可用于在临床和科研中与生物矿化相关问题的研究和阐述，以及在体内和体外的诊断的工具。
[0252]参考文献
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【权利要求】
1.一种测定流体的钙化倾向的方法，其中所述方法的特征在于下列步骤: (i)向所述流体的样品中加入可溶性钙盐和可溶性磷酸盐； (?)在允许形成钙蛋白粒子(CPPs)的条件下培育所述样品；和 (iii)测定下列的一种或多种: (a)初级和/或次级CPPs的生成速率； (b)初级和/或次级CPPs的量；和/或 (c)初级CPPs转变为次级CPPs的速率， 其中步骤(iii)的(a)、(b)和/或(c)中的一种或多种的提高表明所述流体的钙化倾向提闻。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(iii)通过光学方法进行，特别是选自如下的光学方法: 吸光光度法， 光散射的检测， 相关光谱法， 或其两种或更多种的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述光学方法中使用的激发光是激光束。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述光学方法通过检测光散射，优选通过动态光散射，更优选通过互相关动态光散射，再更优选通过三维互相关动态光散射，特别是通过散射比浊法来进行。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(iii)通过选自如下的任何方法来进行: 沉降技术， 过滤分析， 尺寸排阻色谱法， 粒度测定法， 声谱法， 或其两种或更多种的组合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述流体是体液，其中所述流体特别为血液、血浆、血清 、淋巴液和/或尿。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述流体是获自患者的体液，优选其中所述患者具有已发展的钙化和/或存在发展钙化的风险，特别是其中所述患者是透析患者。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述患者遭受血管、瓣膜和/或软组织钙化，优选其中所述患者进一步遭受类风湿病、恶性病和/或传染性疾病，特别是其中该患者显示至少一种选自如下的症状: 肾功能不全， 高血压， 糖尿病， 血脂异常， 缺乏足够的矿化，特别是骨质疏松症和/或骨软化症，和 动脉粥样硬化。
9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述流体是人工体液和/或输入液。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法在恒定温度和/或恒定pH下进行。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法在下列之一中进行: (a)多孔式装置，更优选在8孔板、在16孔板、在96孔微量滴定板或在384孔微量滴定板中，特别是在96孔微量滴定板中； (b)流通池；或 (c)微流体装置。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中至少所述步骤(iii)是自动化的，优选其中所述步骤(ii)和(iii)是 自动化的，特别是其中所述步骤(i)、(?)和(iii)均是自动化的。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述初级CPPs具有小于IOOnm的平均直径，并且所述次级CPPs具有大于IOOnm的平均直径。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述步骤(iii)的(a)、(b)和/或(c)中的一项或多项与一个或多个对照物样品比较。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述步骤(iii)的(c)通过测定初级CPPs转变为次级CPPs的半数最大转变时间(T5tl)的时间点来测定。
【文档编号】G01N33/84GK103930788SQ201280054586
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2011年11月7日
【发明者】W·詹森-德彻特, A·帕齐, S·法尔斯, S·格雷伯 申请人:亚琛工业大学