分析和分选流入对象的制作方法

分析和分选流入对象的制作方法
【专利摘要】描述了一种用于分选浸入流动介质中的对象的设备(1)。所述设备包括具有多个全息成像元件(2)的全息成像单元；流体处理单元，所述流体处理单元包括用于沿对应全息成像元件(2)传导流动介质的多个微流体通道(3)，并且包括被安排在微流体通道中的成像区域下游用于可控地将流动介质中的每个对象引导到多个出口(6)中的所选一个出口的微流体开关(5)。所述设备还包括处理单元(7)，所述处理单元(7)适于对为所述对象中的每一者而获取的全息衍射图像进行实时表征，由此考虑至少一个预定对象类型识别标记。所述处理单元(7)还适于响应于该表征来控制微流体开关(5)。
【专利说明】分析和分选流入对象

【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞分析和分选领域。更具体地，本发明涉及分析和分选流体中的生物细胞的领域。
[0002]发明背景
[0003]本领域中用于细胞分选的各方法(这些方法基于每个生物细胞的特定光散射和/或荧光特性来执行将各生物细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器中)包括荧光激活细胞分选(FACS)和基于流式细胞仪的各方法。这样的分选可包括两个阶段，例如，第一阶段可以是所谓的鉴别阶段，在该鉴别阶段基于细胞的荧光和/或光散射属性对该细胞进行分类，而第二阶段可以是所谓的分馏阶段，在该分馏阶段流体流被分离成带电液滴，这些液滴可被机械地或静电地偏转以便使这些液滴转向到不同罐子。FACS已成为生物学研究者的主力工具，这可能由于多个原因。例如，FACS具有高的单细胞水平敏感性，且因此可以能够在该单细胞水平处检测细胞表面标志物，这很大程度上归因于荧光检测的极好敏感性。此外，FACS具有高的分选和/或计数吞吐量，这允许群体平均的单细胞数据。当今的高速分选器系统每秒可分析多达100，000个事件。该吞吐量至少受到液滴可被偏转的速度的限制。FACS进一步具有跟踪多个参数的能力。现代FACS仪器可具有适于通用多光谱荧光染色应用的多个激光器和检测器。FACS系统正用于各种应用，这些FACS系统基于大小、形态、细胞色素、蛋白质表达水平、荧光探针来鉴别各细胞以供原位杂交，从而例如经由所谓的Flow-FISH(流式荧光原位杂交)、细胞内和核蛋白标志物、绿色荧光蛋白、pH、钙染色等使该细胞内基因组的一个或多个特定区域可视化。在各位置之间快速传送该细胞分选器的特定具体化形式例如使其可成为移动系统的一部分是可能的。
[0004]现代FACS系统会具有以下缺点:大的设备尺寸和高成本、不同样本之间的污染、分选的顺序性本质、以及喷射后的低细胞活性。分选速度、纯质率和恢复率之间也存在折衷。尤其在现代癌症和免疫学研究中，以最高可实现的纯质率使所有细胞从细胞分选器中恢复可能是重要的。
[0005]微流体FACS系统为细胞分选带来小型化和可丢弃性。微流体FACS系统通常被感知为比宏观版本(参见例如《自然》，卷441，第1179页)慢，但更容易并行化。例如，MT(圣巴巴拉市)已经开发了罕见细胞纯化系统，该系统使用具有微小的微机械阀、光学器件和电磁致动的32个并行通道使细胞转向，以供检测适当荧光标志物之后进行快速收集。Cytonome已构造了通过使用144个并发操作的微流体分选器来提供每通道每秒2000个细胞的细胞分选的发明性微流体开关。这一开关可能能够达到每秒288，000个细胞的分选速度。
[0006]美国专利申请US2008/213821也公开了用于分选流动介质中的对象的这一 FACS设备。该设备包括流体处理单元，该流体处理单元包括多个微流体通道，这些微流体通道包括用于沿对应的检测器传导流动介质的检测区域、以及被安排在该检测区域下游用于可控地将该流动介质中的每个对象引导到多个出口的微流体开关。此外，描述了为这些对象中的每一者在经过该检测区域时而获取的用于控制微流体开关的检测信号的实时表征。流动中成像(in-flow imaging)系统是本领域中已知的,例如,Amnis在US2009/003681中公开的系统。该系统使用常规光学器件(例如，收集透镜、光散射元件、成像透镜以及CCD检测器)来执行流入细胞成像供诊断用途。时间延迟积分法可用于提供快速移动对象的改进图像。这可得到从其中可导出细胞特性的高分辨率图像。例如，Amnis系统可能能够成像多达每秒4000个细胞。
[0007]此外，例如根据《Lab Chip)) 2009、9、777_787页，无透镜成像系统可能是已知的。该论文公开了无透镜全息细胞仪以及成像和重构方法，该方法用来自经数字处理的全息图像的丰富得多的纹理信息得到对经重构图像的改进。该系统可用于对静态地存在于CMOS芯片上的细胞进行表征和计数。该论文论证了基于每种细胞类型的全息衍射图案的图案识别来对芯片上的异质细胞溶液执行标识或表征是可能的。该论文提出了使用这些无透镜成像原理以非常高的速度来进行流入细胞成像。
[0008]然而，上述这些系统可能不适合对细胞进行流入分析和分选。
[0009]所描述的无透镜系统是用于分析细胞的静态系统。这些细胞存在于微流体设备中；然而，这些细胞不在流动中。分析流入细胞需要不同的体系结构和方法论。
[0010]上述流入成像器需要庞大的常规光学器件，从而使其成本高、昂贵、且不适于运输。
[0011]然而，仍然需要以下流入细胞分析/分选系统:该系统具有高吞吐能力，在要调查的细胞之间的差异方面具有灵活性，并且可靠、容易使用而且紧凑。当前不可获得具有这些属性的此类系统。
[0012]发明概述
[0013]本发明各实施例的一个目的是提供对流动介质中的对象进行快速且高效的分选。
[0014]通过根据本发明的实施例的方法和设备来完成上述目的。
[0015]本发明涉及一种用于分选浸入流动介质中的对象的设备，该设备包括全息成像单元和流体处理单元，该全息成像单元包括用于提供多个全息衍射图像的多个全息成像元件，该流体处理单元包括多个微流体通道，这些微流体通道包括用于沿对应的全息成像元件传导流动介质以对浸入所述流动介质中的移动对象(例如，快速移动对象)进行成像的成像区域。例如，该全息成像单元可适于每秒对超过500个经过对象(例如，每秒1000个经过对象)进行成像。例如，该全息成像单元可适于对以lcm/s或更高速率移动穿过该成像区域的对象进行成像。微流体通道还包括被安排在所述成像区域下游用于将流动介质中每个对象可控地引导到多个出口中的一个所选出口的微流体开关，以及适于对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征的处理单元，所述表征考虑至少一个预定对象类型识别标记，该处理单元还适于响应于所述表征来控制所述成像区域下游的微流体开关。
[0016]根据本发明各实施例的该设备还可包括用于生成同步信号的同步装置，该同步信号表示检测到每个对象存在于这些成像区域中每一者上游的流动介质中和/或表示检测到每个对象存在于该微流体开关上游的流动介质中。该处理单元可被安排成响应于该同步信号来执行实时表征。该同步装置可被合并到这些全息成像元件中。该同步装置可被合并到这些微流体通道中。
[0017]该同步装置可包括用于接收被该对象调制(例如，被该对象反射或透射通过该对象)的光的光电检测器。该同步装置可包括用于检测受该对象影响的电信号的至少一个电极。
[0018]此外，这些全息成像元件可适于从所述同步装置接收并处理同步信号。
[0019]在各实施例中，多个微流体通道中的每一者还可包括被安排在该成像区域与该微流体开关之间用于在该实时表征被执行时延迟将这些对象中的每一者从该成像区域转移到该微流体开关的曲折区段。
[0020]多个微流体通道可按级联方式来安排，以使得至少一个第一微流体通道的至少一个出口将该流动介质馈送到至少一个第二微流体通道。
[0021]该全息成像单元可包括CMOS或CXD图像传感器。在本发明各实施例中，该成像区域中的每个微流体通道还可被安排成相对于CMOS或CCD图像传感器的栅格对准成一角度。该处理单元可适于根据为这些流入对象中的每一者而获取的多个全息衍射图像来构建超分辨率全息衍射图像。
[0022]该设备还可包括用于提供多个荧光图像的多个荧光成像元件。这些成像区域还可适于沿多个荧光成像元件的对应荧光成像元件传导流动介质。该处理单元可适于对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域时而获取的全息衍射图像和荧光图像进行实时表征。多个荧光成像元素中的每一者可包括多光谱滤波器组件。多个荧光成像元件中的每一者可用于提供针对这些对象中的每一者在经过这些成像区域时的多个荧光感测信号。
[0023]这些全息成像元件可适于检测流动介质中存在对象，并且适于响应于该检测提供全息衍射图像数据。
[0024]微流体通道还可包括用于在该成像区域中将这些对象汇聚在流动介质的中心区域的聚焦单元。
[0025]该处理单元可包括图形处理单元、现场可编程门阵列和/或专用集成电路。
[0026]该流体处理单元还可包括用于使该流动介质分布在该多个微流体通道中的至少两个上的进口。
[0027]多个出口可适于发现可移除载体上的对象。
[0028]该全息成像单元可包括至少一个用于照明流动介质的至少部分相干的脉冲光源。
[0029]该至少一个至少部分相干的脉冲光源可包括光学耦合到针孔的激光器或发光二极管。
[0030]该至少一个至少部分相干的脉冲光源可包括被配置成用于从不同角度照明流动介质的多个光源。
[0031]该全息成像单元可包括图像传感器，其中该全息成像单元包括光学耦合到光源和图像传感器且配置成选择光的偏振的至少一个偏振器。
[0032]部分相干的光源可包括具有一个或多个波长的光源或由具有一个或多个波长的光源构成。
[0033]在根据本发明各实施例的一种设备中，在每个微流体通道上可安排用于产生部分相干的脉冲光源的针孔孔径。
[0034]在该微流体通道上可安排用于产生多个点光源的多个针孔孔径。这些微流体开关可包括热驱动或压电驱动的流偏转装置。
[0035]这些微流体开关可包括用于生成气泡以使对象在该流动介质中移位的微加热器。
[0036]这些微流体开关可包括流体侧室，其容积能由压电或热致动器调节以改变该对象在微流体通道中的轨迹。这些微流体开关可包括流体侧室，其容积能由外部致动的可移动膜调节以改变该对象在微流体通道中的轨迹。
[0037]这些微流体开关可包括电连接到交流驱动装置用于通过介电泳来改变该对象的轨迹的多个电极元件。
[0038]微流体开关可包括用于通过声学辐射力来改变该对象的轨迹的多个超声换能器。
[0039]本发明还涉及使用如上所述的设备来从生物试样中分选细胞。
[0040]本发明还涉及一种用于分选浸入流体中的对象的方法，该方法包括:
[0041]-将该流体的流引入多个微流体通道，其中这些微流体通道包括成像区域；
[0042]-记录该对象在经过这些成像区域中的任一个时的全息衍射图像；
[0043]-对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征，该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记；以及
[0044]-将每个对象导向至出口，该出口是因变于该对象的表征从多个出口中选择的。
[0045]对多个微流体通道可并行执行记录、表征和导向。
[0046]记录可包括评估该对象是否正经过该成像区域。记录可包括检测该成像区域上游的流动介质中存在该对象，并且对全息衍射图像进行表征可响应于该检测到的存在来执行。
[0047]对全息衍射图像进行表征可包括将该全息衍射图像与表示一种感兴趣的图像类型的至少一个经存储的基准全息图进行比较。
[0048]对全息衍射图像进行表征可包括使多个全息衍射图像自相关以便标识对象之间的差异。
[0049]对全息衍射图像进行表征可包括对经成像的对象至少执行部分数字空间重构。
[0050]根据本发明各实施例的高速细胞分析和分选设备适用于流入细胞分析和分选。它在要调查的细胞之间的差异方面是灵活的。它是可靠、容易使用且紧凑的。
[0051]本发明各实施例的一个优点是提供了用于获取流入生物试样的数字图像的系统和方法。该生物试样可基于数字图像来分馏。
[0052]本发明各实施例的一个优点是通过在二维或三维中将流入对象进行表征(例如，与单个像素光学检测形成对比)，考虑这些流入对象的几何形状和复杂性来对流入对象进行分类。
[0053]本发明各实施例的一个优点是样本可被实时分馏。
[0054]本发明各实施例的一个优点是可以考虑不同维度和/或形态来分选生物细胞、微生物或部分微生物(诸如病原体、细胞裂解内吞体和细胞器官)。
[0055]本发明各实施例的一个优点是可以实现每通道每秒至少1，000个对象的吞吐量，例如每通道每秒20，.000个细胞或甚至更高。
[0056]本发明各实施例的一个优点是可以提供高含量，例如，细胞的数字图像可经由全息成像而不是基于单个光电检测器的信号来获取。这样的高含量可为准确分选(例如，对细胞的分类)提供合适的输入。本发明各实施例的一个优点是可以提供高吞吐量，例如，可以按类似于或高于本领域已知的微流体系统(例如，FACS系统)的速度来处理细胞。
[0057]本发明各实施例的一个优点是可以提供连续监测，例如，对象流的连续分析和分选。因此，大量细胞可被连续采样，这可改进分析期间或根据对经分选输出的后续处理和分析所得到的信息的统计相关性。
[0058]本发明各实施例的一个优点是提供了用户可定义且灵活的各方法和系统，这些方法和系统可基于从全息图像中可导出的一个或多个属性来区分细胞或其他生物试样。此类属性可与形态、大小、色素或荧光属性(诸如来自所选取的上皮或核标志物)有关。这一灵活性可允许通过简单的用户定义的软件设置，针对细胞计数、大小分析、生长曲线或其他形态分析来修改该系统，而无需使光学路径适应。
[0059]本发明各实施例的一个优点是提供了一种简单的方法和容易使用的系统，例如，全自动化且需要最少手动操作，而手动操作会导致因不正确处理造成的污染和/或错误分析。另外一个优点是根据本发明各实施例，在将试样引入设备之前可需要最少的样本准备。例如，根据本发明各实施例的设备甚至可以直接对全血或对被稀释的全血进行操作。
[0060]本发明各实施例的一个优点是提供了一种紧凑的设备。例如，与现有FACS系统相t匕，根据本发明各实施例的一种系统可以是紧凑的并且可以由很少数昂贵的组件构成，以使得该系统可用于普通FACS系统会太大和/或太昂贵的情形，例如，在护理点应用和/或生物过程监测应用中。
[0061]本发明各实施例的一个优点是可以提供一种可靠的方法和系统，举例而言，相比于本领域已知的生物量分析器或细胞传感器，例如，较不易受到污垢、校准问题和/或随时间漂移的影响。此外，多个通道可用于为系统增加冗余并且改进内联(inline)监测的可靠性。本发明各实施例的一个优点是提供了与若干下游分析方法(诸如，对所选细胞的高分辨率成像以及对所选细胞的基因组、蛋白质组和代谢物质组含量的分析)兼容的各方法和设备。例如，可以提供对待分选的细胞进行的柔和处理，使得细胞在分选之后保持活性，并且细胞的基因组、蛋白质组和代谢物质组内容在分选期间保持不变。
[0062]在第一方面，本发明涉及一种分析流入细胞的设备，该设备包括流体处理单元，用于对包含待分选细胞的生物试样进行流体处理，该流体处理单元包含进口并且允许多个细胞流穿过图像记录系统；全息成像单元，用于对待分析的流动试样进行数字成像，该全息成像单元包括光源和图像传感器；数字信号处理单元，用于对经记录的细胞流图像进行实时并行图像处理。
[0063]在本发明各实施例中，该流体处理系统可包括多个微流体通道或流，其中每个通道或流包括成像区域。
[0064]在本发明各实施例中，该设备还可包括聚焦单元，用于在各细胞经过成像区域时将细胞汇聚在该流体流的中心。这一聚焦单元可以例如基于声聚焦、流体动力聚焦、介电泳聚焦或其他物理原理。待分选对象可以例如沿微流体通道的中心轴进行聚焦。微流体通道的维度可以例如小于对象平均大小的10倍,例如,优选小于待分选对象平均大小的5倍。例如，微流体通道的维度可以定为待分选对象大小的两倍，以便提供基本上沿微流体通道中心轴通过该微流体通道的串行对象流。
[0065]在本发明各实施例中，该设备还可包括添加到该源和检测器以便过滤偏振敏感特征的偏振器。
[0066]在本发明各实施例中，流体处理系统的出口可被安排成在用于后续分析(诸如，供进一步分析的2D基板(显微镜载片)或微孔板)的载体上发现细胞。在本发明各实施例中，光源可以是部分相干或全相干的脉冲光源。
[0067]在本发明各实施例中，光源可以是照明流入试样的发光二极管(LED)结合针孔或激光器。
[0068]在本发明各实施例中，多个光源可从不同角度照明流入试样。
[0069]在本发明各实施例中，图像传感器可以是被安排成记录全息图像的基于CMOS或CXD的成像器。
[0070]在本发明各实施例中，该设备还可包括芯片上用来判定哪些图像要进一步处理的判定算法。
[0071]在本发明各实施例中，图像传感器可具有每流体通道专用的像素阵列，并且多个通道可具有其自己的像素阵列，这些像素阵列形成该图像传感器的一部分。
[0072]在本发明各实施例中，数字信号处理单元可以是GPU(图形处理单元)、FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)、或能够以流入细胞的速度来处理数字全息图的另一处理器。
[0073]在第二方面，本发明涉及一种用于分析和分选流入细胞的设备。根据第二方面各实施例的一种设备可包括流体处理单元，用于对包含待分选细胞的生物试样进行流体处理，该流体处理单元包含进口并且允许多个细胞流穿过图像记录系统；全息成像单元，用于对待分选的流动试样进行数字成像，该全息成像单元包含光源和图像传感器；数字信号处理单元，用于实时并行的图像处理并且用于对经记录的细胞流图像进行分类(分选算法)；分选单元，用于取决于该数字信号处理器的分类信息将这些细胞导向不同的系统出口。
[0074]在本发明各实施例中，该分选单元可包括使感兴趣的细胞偏转到不同出口的微流体开关或喷嘴。
[0075]在本发明各实施例中，用于这些开关或喷嘴的驱动电路可基于热或压电驱动致动。
[0076]在本发明各实施例中，该分选单元可包括使包含感兴趣细胞的液塞直接偏转的微流体开关。在本发明各实施例中，该偏转可通过将液体推向侧面的小膜的压电形变来执行。
[0077]在本发明各实施例中，该分选单元可包括微加热器，其中由电脉冲导致对液体的快速加热生成了气泡作为压力源使液体移位。
[0078]在本发明各实施例中，捕获系统可用于关于细胞的不同特性执行分选。
[0079]在第三方面，本发明涉及一种用于分析流入细胞的方法。该方法可使用如参考第一方面描述的设备。根据第三方面各实施例的一种方法可包括在包括微流体通道的流体处理单元中提供包括细胞的异质混合的经同质稀释的液体；在细胞经过这些微流体通道时借助光源执行照明；借助图像传感器记录细胞的散射光反应；将散射光反应下载到数字信号处理单元；以及借助该数字信号处理单元分析散射光反应。
[0080]在本发明各实施例中，记录、下载和分析细胞的散射光反应的步骤可以对多个微流体通道并行地完成。
[0081]在本发明各实施例中，光源可以是脉冲式，以便照明移动细胞并且拍摄频闪仪图像。
[0082]在本发明各实施例中，该方法还可包括在将经记录的散射光反应下载到该图像传感器之前的额外分析步骤，其中该分析步骤得到的结果是在判定哪些散射光反应由信号处理单元来分析时使用的信号。
[0083]在第四方面，本发明涉及一种用于分析和分选流入细胞的方法。根据本发明各实施例的一种方法可使用在第二方面各实施例中描述的设备。根据本发明各实施例的一种方法可包括:在流体处理单元中提供包括细胞的异质混合的经同质稀释的液体；在细胞经过这些微流体通道时借助光源执行照明；用图像传感器记录细胞的散射光反应；将散射光反应下载到数字信号处理单元；用该数字信号处理单元分类(分选算法)并分析散射光反应；基于该信号处理单元的分类结果来分选这些细胞。
[0084]在本发明各实施例中，对散射光反应的分类可以使用感兴趣细胞的预存全息图库，以基于经记录的衍射图案与预存库的简单比较来对细胞进行分类。
[0085]在本发明各实施例中，对散射光反应的分类可以使用彼此自相关的经记录的不同细胞图像，由此标识细胞之间的差异。作为另一优点，无需先验息。
[0086]在本发明各实施例中，对散射光反应的分类可以执行全息图的全数字重构。
[0087]在本发明各实施例中，该方法还可包括对原始生物试样的亚群(subpopulat1n)进行下游分析，其中高含量细胞分选器系统可用作样本准备步骤供进一步下游分析，该下游分析包括高分辨率成像、分子表征技术、以及用于揭示所选细胞的基因组或蛋白质组信息的“组学”或测序技术。
[0088]在本发明各实施例中，该设备还不仅可用于分析或分选细胞，而且可用于分析(或成像)对象并分选对象，其中对象形状和/或衍射图案对于区分亚群而言是重要的，诸如对晶体(例如，可在微流体系统中形成的蛋白质晶体)分选、对纳米粒子(例如，多分散粒子样本)分选、对作为纳米粒子测定的一部分的纳米粒子分选。
[0089]在所附独立和从属权利要求中陈述了本发明的具体和优选方面。来自从属权利要求的特征在适当时可与独立权利要求的特征组合，且可与其他从属权利要求的特征组合，而不仅如权利要求中明确陈述的那样。
[0090]参考以下描述的实施例，本发明的这些以及其他方面将是显而易见的且得以说明。

【专利附图】

【附图说明】
[0091]图1示出根据本发明各实施例的用于分选的设备。图2示出根据本发明各实施例的设备的一部分的详细示图。
[0092]图3示出根据本发明各实施例的供设备中使用的CMOS背板的示例设计。
[0093]图4示意性地示出根据本发明各实施例的方法的流程图。
[0094]图5示出根据本发明各实施例的设备的一部分的另一详细示图。
[0095]图6示出根据本发明各实施例的方法的示例性应用。
[0096]图7示出根据本发明各实施例的设备中的针孔。
[0097]图8示出根据本发明各实施例的光源和成像检测器的第一示例性安排。
[0098]图9示出根据本发明各实施例的光源和成像检测器的第二示例性安排。
[0099]图10示出根据本发明各实施例的光源和成像检测器的第三示例性安排。
[0100]图11示出根据本发明各实施例的光源和成像检测器的第四安排。
[0101]图12示出根据本发明各实施例的用于光源和成像检测器的第四示例性安排的成像器和光谱滤波器布局。
[0102]图13示出根据本发明各实施例的设备的示例性分层结构。
[0103]图14示出根据本发明第一方面的设备中的图13所示分层结构的安排。
[0104]图15示出根据本发明各实施例的设备的第二示例性分层结构。
[0105]权利要求书中的任何附图标记不应当被解释为限制范围。
[0106]在不同附图中，相同附图标记指示相同或相似元件。

【具体实施方式】
[0107]将针对具体实施例且参考特定附图来描述本发明，但是本发明不限于此而仅由权利要求书定义。所描述的附图只是示意性的和非限制性的。在附图中，出于说明的目的，一些元件的尺寸可被夸大且不按比例地绘制。尺寸和相对尺寸并不对应于为实践本发明的实际还原。
[0108]此外，在说明书和权利要求书中，术语“第一”、“第二”等用于在类似元素之间进行区分，而未必描述时间顺序、空间顺序、等级排序、或者任何其他方式的顺序。应理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，且本文中所描述的本发明的实施例能以不同于本文所描述或示出的其它顺序操作。
[0109]此外，说明书和权利要求书中的术语在……之上、在……之下等等被用于描述目的，而不一定用于描述相对位置。应理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，且本文中所描述的本发明的实施例能以不同于本文所描述或示出的其它取向操作。
[0110]注意，权利要求书中所使用的术语“包括”不应当被解释为局限于其后所列出的手段；它并不排除其它元件或步骤。因此它应当被解释为指定所指的所述特征、整数、步骤或部件的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤或部件或它们的组的存在或添加。因此，措词“包含装置A和B的设备”的范围不应当仅限于仅由组件A和B构成的设备。这意味着相对于本发明而言，设备的相关组件是A和B。
[0111]贯穿本说明书，对“一个实施例”或“一实施例”的引用意味着结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在本说明书通篇中的多个位置中短语“在一个实施例中”或“在实施例中”的出现不一定指的是同一实施例，但也可能是同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，如本领域技术人员根据本公开内容显而易见，特定特征、结构或特性可以任何适当的方式组合。
[0112]类似地，应当理解的是，在本发明的示例实施例的上述描述中，本发明的多个特征有时在单个实施例、附图及其描述中被组合到一起，以将公开内容连成整体，并帮助理解多个发明方面中的一个或多个方面。然而，本发明的方法不应被解释为反映所要求保护的发明需要比在每一权利要求中明确表述的特征更多的特征的意图。相反，如所附权利要求书所反映的，各发明性方面在于比以上公开的单个实施例的所有特征要少的特征。因此，随详细说明书所附的权利要求在此明确地被包括到说明书中，其中各个权利要求独立作为本发明的单个实施例。
[0113]此外，尽管此处描述的一些实施例包括其他实施例中所包括的一些特征但没有其他实施例中包括的其他特征，不同实施例的特征的组合意图落在本发明的范围内，并且形成将按本领域技术人员理解的不同实施例。例如，在下面的权利要求书中，所要求的实施例中的任何一个可以任何组合使用。
[0114]在本文提供的描述中，陈述了多个具体细节。然而，应当理解，可以在不具有这些具体细节的情况下实施本发明的各实施例。在其它实例中，未详细示出众所周知的方法、结构以及技术，以免混淆对本描述的理解。
[0115]其中，本发明各实施例的描述涉及实时处理，所参考的是受实时约束(例如，用于产生处理步骤的结果的操作时间最后期限)的处理步骤(例如，通常可在处理单元上执行的方法步骤)。例如，在参考全息衍射图像的实时表征时，表征要在具体时间点之前建立，诸如，待分选对象已通过微流体通道从成像区域移动到微流体开关的时间，使得该开关可及时被致动以在该表征结果确定的期望方向上对该对象进行导向。
[0116]在第一方面，本发明各实施例涉及用于分选浸入流动介质中的对象的设备。这一设备包括全息成像单元，该全息成像单元包括用于提供多个全息衍射图像的多个全息成像元件。该设备还包括流体处理单元，该流体处理单元包括多个微流体通道。每个微流体通道包括用于沿对应全息成像元件传导流动介质以对流动介质中的移动对象进行成像(例如，对介质中的快速移动对象进行成像)的成像区域。每个微流体通道还包括被安排在该成像区域下游用于将流动介质中的每个对象可控地引导到多个出口中的所选出口的微流体开关。该设备还包括处理单元，适于对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征，其中该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记。该处理单元还适于响应于该表征来控制该成像区域下游的微流体开关。有利的是，用于分选浸入流动介质中的对象的设备还可包括用于生成同步信号的同步装置，该同步信号(例如，触发信号)表示检测到这些成像区域中每一者上游的流动介质中存在每个对象。该处理单元可被安排成响应于该同步信号来执行实时表征，例如，该处理单元可适于响应于该同步信号来执行实时表征。
[0117]参考图1中的示意性概览以及图2和图5中的详细示图，示出了根据本发明各实施例的设备I。该设备I适于分选浸入流动介质(例如，生物试样)中的对象(诸如，待分选的生物细胞)。这些对象可以包括例如可基于维度和/或形态特性得以区分的至少两种类型的对象，例如，白血细胞和红血细胞。这样的设备可以基于无透镜图像和高速图像处理来确定来自移动对象(诸如，细胞)的一个或多个特性。例如，对要调查的对象进行的分选可以基于根据从无透镜全息图像计算得到的特性对这些对象进行的分类。该设备可以基于经实时处理的全息图像以高速对各对象(例如，细胞)进行分选。
[0118]设备I包括全息成像单元，该全息成像单元包括用于提供多个全息衍射图像的多个全息成像元件2。该全息成像单元可包括图像传感器，例如CMOS或CXD图像传感器。例如，该全息成像单元可包括划分成全息成像元件2的CMOS图像传感器，例如，每个全息成像元件2包括CMOS图像像素阵列，例如6x6像素阵列、或128x128像素阵列，然而，本发明各实施例不限于这些维度。例如，CMOS或CXD图像传感器可适于例如以高捕捉速率(例如，每秒超过1000帧，如每秒2000帧或更多)记录经过微流体通道的单个对象的全息衍射图像。
[0119]因此，图像传感器可以是被安排成记录全息图像的基于CMOS或CXD的成像器。图像传感器上的有源像素区可用于记录流过流体处理单元的对象(例如，细胞)的图像。有源像素区可被定义成(例如，当细胞经过微流体通道3的成像区域4时)记录细胞的散射光反应的传感器区。像素阵列可位于距微流体通道3预定距离处。在一个示例中，像素阵列可以形成芯片的一部分，例如，半导体芯片(诸如硅芯片)。这样的芯片还可例如以集成方式包括其他功能，如举例而言图3中指示的。在一个示例中，该芯片位于一平面并且微流体位于一平面，其中这两个平面不重合。图像传感器可被划分成有源像素阵列，每个像素阵列与每个微流体通道3的成像区域4相关。图像传感器还可适于像素阵列的并行读出，例如，使得各全息衍射图像可由这些全息成像元件2同时提供且彼此独立地提供。图像传感器可包括用于并行读出像素阵列的读出电路，其中每个像素阵列可被个别地读出。处理单元7因而可以基本上并行地处理由不同像素阵列提供的全息图像。在一个示例中，图像传感器被选择成具有尽可能小的像素大小以获取高分辨率，以便用尽可能高的每像素比特数具有尽可能快的读出。图像传感器可被选择成具有上述属性的适当组合。
[0120]在本发明各实施例中，成像区域4可被安排成相对于CMOS或CXD图像传感器的栅格对准成一角度，如在1°和44°范围内的一角度，如在5°和30°范围内的一角度，如在10°和20°范围内的一角度。在这样的实施例中，处理单元7还可适于根据为这些流入对象中每一者而获取的多个全息衍射图像来构建超分辨率全息衍射图像。本领域中获取此类超分辨率图像的方法是已知的，例如，通过组合多个图像中与经受平移的同一对象有关的信息，来获取空间分辨率为可通过CMOS或CCD图像传感器获取的单图像分辨率两倍的图像。图像传感器格栅对准与微流体通道的成像区域之间的角度可引发流入对象在被成像于一个图像中时相对于另一图像(如后续捕捉到的图像)的偏移，使得该偏移沿所有成像栅格轴具有非零分量。
[0121]在本发明各实施例中，设备I还可包括用于生成同步信号的同步装置，该同步信号(例如，触发信号)表示检测到每个对象存在于成像区域4中每一者上游的流动介质中和/或表示检测到每个对象存在于微流体开关5上游的流动介质中。处理单元7可被安排成响应于所述同步信号(例如，响应于在成像区域4中每一者上游检测到的存在)来执行实时表征。该同步装置可包括用于接收对象所调制的光(例如，对象反射的光或对象透射的光)的光电检测器。例如，这样的光电检测器可响应于检测到的经调制光强(例如，在对象经过微流体通道时光强减小)来生成同步信号。作为替换或附加，同步装置可包括用于检测受该对象影响的电信号(例如，用于检测当对象经过微流体通道时阻抗的变化)的至少一个电极。此外，同步装置可并入全息成像元件中，例如，同步装置可包括全息成像元件中的像素元件，例如，每个全息成像元件中位于对应成像区域上游端的像素元件。同步装置还可并入微流体通道3中，例如，可包括被安排在微流体通道壁中的至少一个电极。
[0122]这些同步装置的一个优点是可以执行简单且计算上高效的检测，以便减少处理单元7用来对流体悬浮物中的对象进行分类的计算工作负荷。
[0123]这些同步装置还可包括用于在检测到对象存在时提供与该对象的速度和/或加速度相关的信息的至少一个流监测设备。例如，流测量可在微流体通道中被执行或者泵相位检测可被执行，以便提供从其中可预测对象到达成像区域中和/或微流体开关中的时间的附加信息。因此，可以考虑(例如，由依赖时间的泵效率造成的)流速度的变化以准确地同步对每个对象进行的成像和分选。
[0124]在本发明各实施例中，全息成像元件2可适于从同步装置接收同步信号。例如，在本发明各实施例中，全息成像元件2可适于检测流动介质中存在一对象并用于响应于这一检测来提供全息衍射图像数据，由此，CMOS图像传感器上的集成电路可通过重复地评估检测准则(例如，评估同步信号，举例而言，评估图像强度阈值)来检测全息成像元件的视野中存在一对象，并且在满足这样的准则时将从该全息成像元件获取的图像数据传输到处理单元7。这些实施例的一个优点是可以本地执行简单且计算上高效的检测，以便减少处理单元7用来对流体悬浮物中的对象进行分类的计算工作负荷。
[0125]例如，可以在全息成像单元(例如，成像器芯片)上实现判定算法，以判定哪些图像要由处理单元7(例如，由诸如计算机系统或专用集成电路设备之类的数字处理单元)进一步处理。因为某些图像不包含细胞反应(例如，在记录被执行时成像区域4中不存在细胞的情况下)，所以这些图像对处理而言没有用，而用于丢弃那些图像的直接判定机制可显著地加速该成像和分选。
[0126]根据本发明第一方面的各实施例，在设备I中，多个微流体通道中的每一者还可包括被安排在成像区域4与微流体开关5之间、用于在实时表征被执行时延迟将这些对象中的每一者从成像区域4转移到微流体开关5的曲折区段。因此，处理时间开销可以被考虑，使得可以根据待分选对象的表征来及时地控制微流体开关5。全息成像单元还可包括至少一个用于照明流动介质的至少部分相干的脉冲光源8。该至少一个至少部分相干的脉冲光源8可包括激光器。或者，该至少一个至少部分相干的脉冲光源8可包括光学耦合到针孔的发光二极管(LED)或激光源(诸如，激光二极管)。例如，多个全息成像元件中的每一者可具有对应光源8，使得该光源发射的光与待分选对象(当存在于微流体通道的对应成像区域时)交互。和这一对象(对象束)交互之后的光与光源(基准束)发射的光的基准部分(例如，越过该对象被传播而没有与其交互的一部分)之间的干涉可以导致在全息成像元件2的成像板上形成全息干涉图案。根据本发明各实施例，根据该干涉图案，可以得到与该对象有关的信息，例如，这一对象到预定类型中的分类。
[0127]尽管该至少一个至少部分相干的脉冲光源8可以是基本上单色的，但该至少一个至少部分相干的脉冲光源8还可包括多波长的至少部分相干的脉冲光源，例如，可以发射两个或更多波长(如4个波长)的至少部分相干的光。因此，部分相干的光源可包括具有一个或多个波长(如多个离散波长)的光源。
[0128]该至少一个至少部分相干的脉冲光源8还可包括被配置成从不同角度照明流动介质的多个光源，例如，激光二极管或发光二极管。此类多个光源可改进衍射图案中包含的3D信息。
[0129]此外，全息成像单元还可包括光学耦合到光源和图像传感器、用于选择光的偏振的至少一个偏振器。这一偏振器可被添加到光源和图像传感器以便过滤偏振敏感特征。
[0130]在各实施例中，该至少一个至少部分相干的脉冲光源8可按无透镜成像配置被安排。可以在微流体通道上安排用于使该至少一个至少部分相干的脉冲光源8发射的光准直的针孔孔径。该至少一个至少部分相干的脉冲光源可包括安排在每个微流体通道上的针孔，例如，在微流体通道壁中提供的透明针孔窗口。无透镜成像配置的一个优点是可以实现高密度集成，例如，许多微流体通道在单个紧凑的设备上并行化。针孔孔径安排的一个优点是可以实现基本上点状光源，该点状光源从短距离照明流入对象，例如，可以实现从微流体通道壁发射的类似于点状源的空间光分布。这一点状源与被成像的对象之间的短距离尤其有利，因为大点缩放因子(large point zoom factor)可被实现。通过使用这一点状源(例如，位于距该对象40 μ m至400 μ m范围内以及位于1_至1mm范围内，例如,距成像器2_至5_范围内)，减小了散射光与基准束之间的角度。以此方式，对于点状源而言，与形成基本平面的波前的光相比，同一散射图案可得到具有宽得多的条纹的干涉图案。由此，可以记录更多信息，例如，条纹图案提供与光散射对象有关的信息。有利的是，由此可获得缩放效果，例如，具有10至25范围内的缩放因子。
[0131]图7示出这样的针孔安排。基本平面的波前31(例如，来自准直束或来自距离很远的针孔的单色光)可以通过针孔32进行准直，针孔32可被安排在距被成像的对象33距离Z2处，例如，距微流体通道中心轴(在介质34中流动的对象沿该中心轴被聚焦)距离Z2处。通过针孔32准直的光随后可与对象33交互，并且可照射到成像器上，该成像器被安排在距对象33距离Z1处，例如，距微流体通道的中心轴距离Z1处。被对象散射的光35随后可与用作基准束的透射光36 (例如，基本上未经调制地透射过介质34的光)交互，以在成像器37上形成干涉图案38。当对象与针孔对准时，针孔下方相机上的条纹与更遥远的条纹相比，通常可具有更宽形状和更高强度。因此，成像器可具有自适应的像素配置，例如，可以在成像器与针孔对准的位置处具有较低空间分辨率，而在成像器的边缘上具有较高空间分辨率。这样的像素安排在图7中由成像器37的像素元件示出，被示为包圈。此外，由于距中心距离越远条纹图案强度越低，因此可以按使那些像素更敏感的方式来设计成像器。以此方式，满量化标度的像素可用于内部条纹和外部条纹两者。
[0132]参考图8，示出了两个至少部分相干光源的示例性安排。两个光发射器41 (例如，激光器)例如通过光纤43和光纤准直器44光学耦合到两个针孔42。此外，成像器45可设置有棋盘滤波器，使得像素被交替地调谐到第一光发射器和第二光发射器。以此方式，可以同时获得对象46的两侧面照明的全息图。
[0133]在图9中，示出了两个至少部分相干光源的另一示例性安排。两个光发射器41 (例如，激光器)被光学耦合到一个针孔42。这里，成像器45也可设置有棋盘滤波器，使得像素被交替地调谐到第一光发射器和第二光发射器。以此方式，可同时获得对象46的与不同基准束波长对应的两个全息图。
[0134]在图10中，示出了两个至少部分相干光源的第三示例性安排。光发射器41 (例如，激光器)中的一个光发射器被光学耦合到一个针孔42，而另一光发射器仅通过光纤准直器44进行准直。这里，成像器45包括全息成像部分48和荧光成像部分49，其中该荧光成像部分设置有超光谱滤波器47以便获取与对应像素的不同荧光波长相对应的信号。
[0135]图11中示出了一个至少部分相干光源的第四示例性安排。这里，针孔42提供宽视野照明，使得对象46在沿微流体通道移动时将被成像器45的第一成像部分和第二成像部分成像。这些部分配合两个对应的光谱滤波器51、52，使得每个成像部分可获取与不同荧光波长对应的图像。此外，如图12中所示，通过保留成像器的某些部分不被这些不同光谱滤波器51、52覆盖，成像器45保持未被覆盖的区域54可获取全息衍射图像。
[0136]根据本发明的一个实施例，成像器是快照超光谱成像器，其中该成像器包括至少两个光谱滤波器(例如，平铺布局)。作为本发明各实施例的一个优点，不同光谱数据可通过获取单个图像来捕捉，由此增加细胞分选的吞吐量。为制作大区域的高分辨率图像，提出制作具有紧密间隔的针孔的阵列，这些针孔可由针孔上面的光纤分开驱动。这种类型的设置在图3中示出。
[0137]在本发明各实施例中，设备I还可包括用于提供多个荧光图像的多个荧光成像元件。成像区域4还可适于沿这多个荧光成像元件的对应荧光成像元件传导流动介质。例如，两者都对应于成像区域4的全息成像元件和荧光成像元件可集成在同一 CMOS或CCD图像传感器上，或者都可集成在同一 CMOS或CXD图像传感器区域上。处理单元7可适于对为这些对象中的每一者在经过该成像区域4时而获取的全息衍射图像和荧光图像进行实时表征。例如，可以考虑衍射图像和荧光图像信息两者，来执行被成像的对象的表征，例如以便有利地获取对高特异性的对象的分类。
[0138]例如，可以沿微流体通道中的流方向将成像区域4划分成两个成像地带，其中对象在第一地带中经受全息衍射成像而在第二地带中经受荧光成像，或反之亦然，在第一地带中经受荧光成像而在第二地带中经受全息衍射成像。荧光成像可限于检测单个荧光识别标记，但也可包括多光谱或超光谱荧光检测。多个荧光成像元素中的每一者可包括多光谱滤波器组件。例如，每个荧光成像元件可包括多个成像像素，其中至少一个第一成像像素设置有第一波长滤波器并且至少一个第二成像像素设置有第二波长滤波器，使得该至少一个第一成像像素和该至少一个第二成像像素适于检测不同波长范围内发射的荧光信号。多个荧光成像元件中的每一者可用于提供针对这些对象中的每一者在经过所述成像区域时的多个荧光感测信号，例如，每个荧光感测信号对应于不同波长范围。
[0139]尽管为改进在微流体通道的成像区域中对对象的分类可以组合荧光成像和全息衍射成像，例如，在级联式安排中(例如，其中在第一微流体通道中对象根据第一准则被分选，而在第二微流体通道中已经根据该第一准则被分选的对象的子集根据第二准则被进一步分选)单级分选可基于全息衍射成像和荧光成像两者，但该级联的第一级可基于全息衍射成像来实现分选，而该级联的其他级可基于荧光成像来实现分选。
[0140]该设备还包括流体处理单元，该流体处理单元包括多个微流体通道3。在本发明各实施例中，该流体处理单元还可包括进口 9，用于将流动介质分布在这多个微流体通道3中的至少两个上，且优选地分布在大量这些微流体通道上。例如，进口 9可将流动介质分布在超过10个的并行微流体通道上(例如超过20个或更多个并行微流体通道上)，或甚至更优选地，超过100个并行微流体通道上(例如超过1000个并行微流体通道上)。这多个微流体通道3可集成在单个集成微流体设备中(例如，集成在单个芯片上)，使得流体悬浮物中大量对象可由根据本发明第二方面各实施例的设备I并行地分选，同时这样的设备I保持紧凑且容易通过本领域已知的标准微流体芯片设计方法生产。例如，在本发明的一个实施例中，图像传感器可每微流体通道3具有专用像素阵列，并且多个通道可具有其自己的像素阵列，这些像素阵列形成该图像传感器的一部分。
[0141]在本发明的一个实施例中，全息成像单元(例如，图像传感器)可以暴露于来自不同微流体通道3在不同全息成像元件2(例如，图像传感器的像素阵列)上的不同散射光反应。图像传感器可被安排成使得像素块被分配成对一细胞流进行成像，并且多个块可并行地对多个细胞流进行成像。在本发明的一个实施例中，典型像素阵列可具有64x64或128x128个像素。取决于所需要的全息衍射图案(例如，全息图)的分辨率，该阵列可以更大或更小。
[0142]这多个微流体通道3还可按级联方式来安排(例如，如图1中的示意性概览中所示)以使得至少一个第一微流体通道3的至少一个出口 6将流动介质馈送到至少一个第二微流体通道3。例如，级联式流体处理单元可包括第一分选级(例如，包括1000个并行微流体通道)以便执行粗分选(例如，红血细胞与白血细胞、或淋巴细胞与其他白血细胞的分选)，以及第二分选级(例如，包括20个微流体通道)以便执行进一步区分。粗分选可以例如从血样中分选出红血细胞,并且将其他细胞馈送到例如分选出白血细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC)的第二分选级。
[0143]在一个示例实施例中，在对非常罕见的细胞进行分类的情况下，可以使用级联系统，其中第一粗分选基于一个属性来作出，而第二、第三等等成像和分选事件可基于其他属性细化该分选。在本发明第二方面的一个实施例中，第一系统可包括基于能非常快速获得的信息(诸如，像素阵列上的总体累积强度、或甚至是由单个像素光电检测器记录的强度，其可与阈值进行比较)将白血细胞与红血细胞粗分选的许多(如1000个)通道。第二捕获可包括鉴别不同白血细胞子类型并且甚至可挑出非常罕见的细胞(诸如，循环肿瘤细胞或干细胞)的较少通道。
[0144]在本发明第一或第二方面的一个实施例中，流体处理单元可包括多个微流体通道3，每个微流体通道允许大量细胞流过对应全息成像元件2。
[0145]每个微流体通道可包括成像区域4，用于沿对应全息成像元件传导流动介质以对流动介质中的对象成像。因此，流体处理单元可允许多个对象(例如，细胞)流通过全息成像单元(例如，成像记录系统)。每个这样的通道3可包括成像区域4，在那里可以执行对流入对象(例如，细胞)的成像，以使得成像数据随后可被发送到处理单元7。
[0146]每个微流体通道3还可包括微流体开关5，微流体开关5被安排在成像区域4下游以将流动介质中的每个对象可控地引导到多个出口 6中的所选出口，例如，以根据处理单元7(例如，数字信号处理器)提供的分类信息将这些对象(例如，细胞)导向到不同的系统出口。微流体开关5可使对象(例如，感兴趣的细胞)偏转到不同出口，其中用于对这些对象进行导向的开关的驱动电路可以基于任何合适的技术，诸如举例而言，热或压电驱动致动。
[0147]基于液滴的开关是本领域中用于不同用途是已知的，包括喷墨打印头。出于流体分选用途，这样的开关可被优化成足够快，例如，对于生物细胞分选中的特定应用而言允许每秒至少1，000且接近20，000个细胞被分选。当今本领域的打印机头允许每喷嘴每秒形成、导向及打印多达30，000液滴，但在针对致动液滴对照细胞的最大可施加致动力方面的边界条件由于在开关期间必须保持活性的细胞正经受的机械力而不同。使用商业打印机的细胞打印的成功激励了若干研究组启用细胞打印技术。液滴的致动需要与细胞流动同步，以使得每个液滴包含待分选细胞并且得以被导向到正确出口。
[0148]微流体开关5可包括热驱动或压电驱动的流偏转装置。例如，微流体开关5可直接使包含感兴趣细胞的液塞偏转。这样的微流体开关5可使用小膜压电形变原理将液体推向侧面，以使得粒子或细胞朝另一出口移动。使用该原理已经证实了每秒对3，000个细胞进行内联微流体分选。
[0149]微流体开关5可包括流体侧室，其容积可由压电或热致动器调节以改变对象在微流体通道中的轨迹。微流体开关5可包括流体侧室，其容积可由外部致动的可移动膜调节以改变对象在微流体通道中的轨迹。
[0150]微流体开关5可包括用于生成气泡以使对象在流动介质中移位的微加热器10。这样的微加热器可通过电脉冲实现液体快速加热，以生成气泡作为压力源。这一方式的一个优点是它可执行简单且快速的微流体切换。泡可在几微秒内生成，例如，如《传感器和致动器》B117 (2006) 523-529中报告的，以及在1999年微系统建模和仿真会议的技术会议记录“具有微加热器的微流体系统中的动态特性”中报告的。这一泡的成核以及由压力造成的流体移位足够快，以在特定方向上按所需速度对包含细胞的液塞进行导向。该原理在《传感器和致动器》B117 (2006) 523-529中已被用来证实成功地分选20微米的微球体，并且在不同出口方向分选各单细胞也已被证实。此外，液体形成的致动可能需要与待分选细胞完全同止/J/ O
[0151]在各实施例中，微流体开关(5)可包括电连接到交流驱动装置用于通过介电泳(DEP)来改变对象的轨迹的多个电极元件。这样的基于介电泳的分选在本领域是已知的。例如,在DEP操纵中，脉冲矩可通过非均匀电场中的偏振效应(例如,通过移动穿过交流势场)而被施加到电荷中性物质对象。
[0152]或者，微流体开关5可包括用于通过声学辐射力来改变对象的轨迹的多个超声换能器。
[0153]出口 6可适于在可移除载体(诸如，2D基板(如显微镜载片)或微孔板)上发现对象。例如，并行安排的多个微流体通道3的对应出口 6可连接到输出通道11，输出通道11可馈入对应喷嘴以使经分选的对象沉积在载体上供后续分析。
[0154]在本发明各实施例中，微流体通道3还可包括聚焦单元12，用于在成像区域4中将对象汇聚在流动介质的中心区域，例如，用于在成像区域中将这些对象聚焦在流的中心截面区。
[0155]因此，聚焦单元在对象(诸如，生物细胞)经过成像区域时将它们汇聚在流体流的中心。这样的聚焦的一个优点是图像记录对于同一类型的多个对象可以更均匀(例如，标准化)。这样的聚焦方法在许多FACS和微流体系统中已被用于改进细胞在光源(例如，激光器)前面的对准，并且通常改进分选的敏感性和准确性。这样的聚焦单元可基于任何合适的聚焦技术，诸如，声聚焦、流体动力聚焦、介电泳聚焦或其他物理原理。作为说明，在附图中示出流体动力聚焦，但本发明各实施例不限于此。
[0156]根据本发明各实施例的设备的示例性实现在图13中示出，该设备可通过半导体处理技术来制造。这里，在第一程处理中，基底61 (例如，硅基底)上用于热加热器的金属导体62、接合焊盘63、以及用于形成针孔的金属准直元件64被设置在绝缘层65中。在第二程中，微流体通道66可使用聚合物间隔件、或聚合物间隔件与盖玻片67的组合来形成。用于将光投射到针孔上的开口进一步通过硅的背侧蚀刻(例如，KOH背侧蚀刻工艺)来设置。图14示出了根据本发明第一方面的设备中图13的半导体设备，该半导体设备包括光发射器41，用于将光耦合到由金属准直元件64形成的针孔。图像传感器45被安排在距微流体通道壁(例如，距盖玻片67)适当距离。
[0157]图15示出玻璃晶片基底61的另一示例性实现。针孔由安排在基底背侧的准直元件64形成，以使得基底可有利地用作针孔与待成像对象之间的间隔元件。
[0158]该设备还可包括处理单元7，适于对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域4中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征，其中该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记。处理单元还可适于响应于该表征来控制该成像区域(例如，对象在图像获取期间移动通过的成像区域)下游的微流体开关。该处理单元7可包括图形处理单元、现场可编程门阵列和/或专用集成电路。微流体分选可基于对数字全息衍射图像应用分类算法由本发明各实施例提供。取决于分类的结果，可以对细胞进行导向(例如，推向侧面)，以便通过微流体开关最后出现在微流体通道的不同出口中。
[0159]处理单元7 (例如，数字信号处理器)可以对全息衍射图像(例如，细胞的图像)进行分析和分类。这样的分类可包括基于从非重构、部分重构或全重构的数字全息图中提取的识别标记来执行分选算法。
[0160]集成在单个CMOS背板上的处理单元7和全息成像单元的一个示例实施例在图3中示出。该集成实现可包括多个全息成像元件2 (包括用于对图像传感器信号进行模拟信号调理的模拟前端)，用于存储图像、转移图像和/或与外部接收机通信(例如，用于提供用户接口)的集成电路元件15，微流体开关驱动器电路16，以及用于提供如上所述的处理单元7的表征功能的电路。或者，用于对图像传感器信号进行模拟信号调理的一部分或整个模拟前端也可以是处理单元7的一部分。
[0161]在第三方面中，本发明涉及一种用于分选浸入流体中的对象的方法。这样的方法包括将该流体的流引入多个微流体通道，其中每个微流体通道包括成像区域。该方法还包括以下步骤:记录每个对象在经过所述成像区域中的任一个时的全息衍射图像，对为这些对象中的每一者在经过这些成像区域中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征，其中该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记，并且将每个对象导向至出口，其中该出口是因变于该对象的表征从多个出口中选择的。
[0162]根据本发明各实施例的一种方法还可包括将液体流从所述多个出口中的至少一个引入至少一个其他微流体通道的步骤，该至少一个其他微流体通道或每个至少一个其他微流体通道包括其他成像区域。这样的方法还可包括记录每个对象在经过其他成像区域中的任一个时的图像(例如，全息衍射图像或荧光图像)，考虑至少一个对象类型识别标记来表征由此获得的图像，以及将该对象导向因变于该对象的表征从多个其他出口中选择的一个其他出口。
[0163]根据本发明各实施例的用于分选浸入流体中的对象的示例性方法20在图4中示出。这样的方法可以例如使用如关于本发明第一方面所描述的设备来确定来自移动对象(诸如，细胞)的一个或多个特性。本发明各实施例的一个优点是图像在非常短时间帧内被记录以表征这些对象，以便跟上通过微流体通道的对象流。这样的方法20还可基于根据从无透镜图像计算得出的特性对各对象(诸如，细胞)的分类来分析和分选这些对象。该方法可以基于经实时处理的全息图像以高速分析和分选细胞。
[0164]在本发明各实施例中，方法20包括将所述流体的流引入21多个微流体通道的步骤，其中每个微流体通道包括成像区域。例如，包括对象(例如，生物细胞)的异质混合物的同质稀释的液体可被引入流体处理单元。在这样的包括微流体通道的流体处理单元中，细胞的照明(例如，由光源照明)可在细胞经过这些微流体通道的成像区域时执行。流体被同质稀释到细胞流独立通过全息成像系统的程度可能是有利的。一种可能的光源和传感器阵列的光学配置可以提供通过流体处理系统的光透射，以使得该源发射出被流体处理系统中的试样散射的光，并且相位敏感信息在流体处理系统的另一侧处被记录在图像传感器上。这可要求流体处理系统(例如，尤其是微流体通道的成像区域)对所使用的光透明。
[0165]在一个实施例中，光源(可能至少部分相干)可以是脉冲式，以便照明移动对象并且拍摄频闪仪图像。细胞通常可按每秒几厘米至每秒几米的速度在成像器前面移动。脉冲光源以及光检测系统可被适当配置成以这些速度对各对象进行成像。例如，10ns光脉冲可适合于以lm/s速度移动的细胞，而1ns光脉冲可适合于以10m/S速度移动的细胞。为获得尖锐的全息衍射图像，短的光脉冲可用来避免移动细胞造成的模糊。可能需要足够的脉冲功率以在图像传感器处具有足够光子，而不会在光热上损坏这些对象(例如，移动细胞)。为分析目的，频闪仪图像可被下载到数字信号处理单元。相比于普通成像器，用于全息频闪仪成像的减少的像素数可展现相对于流成像中高吞吐量的优势。
[0166]方法20还包括记录22每个对象在经过所述成像区域中的任一个时的全息衍射图像的步骤，例如，用图像传感器记录细胞的散射光反应。该记录22可包括评估对象是否正在经过成像区域，例如，在记录这一全息衍射图像之前评估对象是否正经过成像区域。例如，可以对成像器执行局部判定算法，以便确定哪些图像(例如，频闪仪图像)被推送到数字信号处理单元供分析。因为许多图像根本不包含任何有用信息(例如，当它们不包含与待分选对象有关的信息时)，所以(例如成像器芯片上的)局部判定算法可确定要丢弃哪些图像而不对其分析。例如，如果每3.2微秒记录64x64个像素的图像帧，而50微秒内仅有一个帧实际包含细胞图像并且需要被推送到信号处理单元，则所需带宽可以从1280MB/秒减小到82MB/秒的平均带宽。判定算法可以判定哪些图像要进一步处理。因为某些图像不包含细胞信息，所以它们对于处理而言没有用，且丢弃那些图像的直接判定机制可显著地加速成像和分选。该判定可取决于经集成记录的光反应数据。
[0167]也可应用数字全息术来分析从对象透射或反射的光的偏振状态的空间分布。这可简单地通过将偏振滤波器插入光路中(例如，光源与所照明的对象之间、和/或所照明的对象与光电子感测阵列之间)来完成。偏振是细胞成分的已知属性。组织/细胞的基于偏振的光学属性是研究最少的属性之一，并且正获得越来越多的关注。偏振成像可用于在视觉化期间改进对比度并且区分细胞类型。本发明各实施例由此可通过在光源与微流体系统之间及微流体系统与成像器之间添加偏振滤波器来扩展成包括偏振分析。
[0168]方法20还包括对为这些对象中的每一者在经过成像区域中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征23。该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记。表征23可包括借助数字信号处理单元来分析全息衍射图像中记录的散射光反应。例如，该表征可包括用数字信号处理单元来对散射光反应进行分类(例如，使用分选算法)和分析。例如，数字信号处理器可对散射光反应进行分析和分类，其中该分类包括基于从非重构、部分重构或全重构的数字全息图中提取的识别标记的分选算法。判定可以与细胞流同步进行。因此，可以对无透镜图像使用快速分类算法，这些图像随后可用作驱动物理分选器的电路(例如，微流体开关)的输入。
[0169]例如,对全息衍射图像的表征23可包括将全息衍射图像与至少一个所存储的表示感兴趣对象类型的基准全息图进行比较，例如，将图像与预存全息图库中的每一者进行比较，以便确定全息衍射图像中的对象对应于哪种对象类型。该比较可包括针对每个至少一个所存储的基准全息图，计算在一方的全息衍射图像与所存储的在另一方的基准全息图之间的相关度量，并且选择该相关度量指示最佳相关的对象类型。例如，对散射光反应的分类可以使用感兴趣细胞的预存全息图库，以基于经记录的衍射图案与预存库的简单比较(例如，经由相关)来对细胞进行分类。
[0170]或者，对全息衍射图像进行的该表征23可包括使多个全息衍射图像自相关以便标识对象之间的差异。例如，对散射光反应进行分类可使用彼此自相关的不同的经记录细胞图像，由此标识各细胞之间的差异。这种方式的一个优点是可以不需要先验信息。
[0171]对全息衍射图像进行表征23还可包括对经成像的对象至少执行部分数字空间重构。例如，全息图的全数字重构在流入成像能力还用来收集细胞的图像以供进一步分析的情况下可能有用。
[0172]该方法还包括将每个对象导向24至出口，该出口是因变于该对象的表征从多个出口中选择的。因此，基于分类结果来分选对象(例如，细胞)可由本发明各实施例来提供。
[0173]根据本发明各实施例，记录22、表征23、和导向24可对多个微流体通道并行执行。在本发明各实施例中，方法20还可包括对浸入流体的对象的亚群进行下游分析，其中第一分选可用作样本准备步骤以供进一步下游分析。进一步下游分析可包括高分辨率成像、分子表征技术、以及用于揭示所选生物细胞的基因组或蛋白质组信息的“组学”或测序技术。
[0174]在本发明各实施例中，记录22可包括检测该对象存在于成像区域4下游的流动介质中，并且对全息衍射图像进行表征23可响应于检测到的存在来执行，例如，如上文参考本发明第一方面描述的。记录22可包括评估该对象是否正经过成像区域4。
[0175]对全息衍射图像进行表征23可包括以下各项之一或其组合:将全息衍射图像与至少一个所存储的表示感兴趣对象类型的基准全息图进行比较，使多个全息衍射图像自相关以便标识对象之间的差异，以及至少执行对经成像对象的部分数字空间重构。
[0176]记录22、表征23和导向24可对多个微流体通道3并行执行。
[0177]根据本发明各实施例的方法和系统的示例性应用204在图6中示出。血样中的细胞201正移动穿过微流体通道，且在其成像区域中由相干或部分相干光源200 (例如，频闪脉冲LED)照明。全息成像元件202记录细胞201的全息衍射图像。该数据随后被实时地进一步处理。例如，对于成像区域中是否存在对象(例如，在全息衍射图像中被捕捉)的初始评估可以例如由全息成像单元的专用电路来执行。如果为是，则数据随后可被转发到处理单元，该处理单元可将图像与预存基准图像库(例如，对应于红血细胞、白血细胞、或循环肿瘤细胞原型)进行比较。在预定时间窗内(例如，由成像区域与开关之间的微流体系统中的路径长度以及流体在微流体通道中移动的预定流速来确定)，则可以建立落入这些类别的分类，并且微流体分选设备203的微流体开关可响应于该结果而被致动以用于分选203。例如，白血细胞和红血细胞各自可被转向到不同的输出通道，例如，出口。
[0178]若干示例和技术考虑将在下文中阐述，但本发明不旨在以任何方式受这些示例和/或技术考虑的限制。
[0179]本发明各实施例的一个优点是对于有限尺寸的图像传感器而言可获得高质量。微流体通道内要调查的对象(例如，生物细胞)可位于距光源特定距离dl且距图像传感器d2，距离dl和d2两者都可确定图像传感器上衍射条纹的放大率。在最优距离处，有限尺寸的图像传感器上的重构可具有最高质量，从而得到不同细胞类型的最佳鉴别。
[0180]本发明各实施例的一个优点是可以获得全息图中良好质量的信息以及经重构图像的高分辨率。高空间频率(例如，对应于精细特征)得以最大程度地展开。当衍射条纹的放大率最优地覆盖像素矩阵时，意味着覆盖重要精细特征的条纹被投射到有源像素阵列上，全息图的分辨率由该像素阵列中的像素数来设定。全息图中信息的质量以及经重构图像的分辨率将取决于用于成像的块的尺寸。因此，存在相关于用来创建高分辨率全息图的像素数同时允许快速信号处理和对象分选而要作出的折衷。特定值可取决于分选应用而不同，如用于准确分选而对全息图的要求必须针对分选这些对象(例如，细胞)的足够速度来加权。
[0181]在本发明各实施例中，在当前FACS系统使用单像素检测器(即，光电倍增器或雪崩光电二极管)进行测量的情况下，这些单像素检测器可由光学CMOS成像器(可拍摄细胞的图像)替代。用于对细胞进行成像的增加的空间分辨率对于为所获取的图像数据进行的实时数字信号处理提出了极高的要求。此外，对多个(例如N个)流同时成像进一步使要处理的图像数据集扩大N倍。这一增加的空间分辨率和非常高的吞吐量的组合在当前领域中可能不是已知的。本发明各实施例可使用称为无透镜或数字全息成像的技术，以减轻对要实时处理的数据信息的要求。光显微镜传统上依赖于透镜来创建小对象的显微图像。然而，片上无透镜全息显微镜采用数字方式实现高分辨率成像。在细胞或微生物上散射开的光与部分相干照明的未散射部分发生干涉，从而得到对象的全息记录，而无需任何光学放大。此外，成像像素的数量相比于常规显微镜可大大降低。经重构图像的分辨率可被数字地增加，超过由传感器阵列的像素大小确定的分辨率，例如，通过使用所谓的像素超分辨率(PS)技术来实现亚微米横向分辨率。
[0182]因此，针对流动中对象(例如，细胞)的高速无透镜流入细胞分析和分选可由本发明各实施例来提供。
[0183]数字全息显微镜方式依赖于衍射图案的数字记录和重构，以获取该对象的图像或图像识别标记。通常，来自小孔径的(部分)相干照明(例如，LED和针孔的组合、或具有针孔的多个LED)用来在高分辨率光电子传感器阵列(例如，CCD或CMOS相机)上获得来自对象的衍射图案。无透镜显微镜产生对象的全息图，其中相位信息被编码在衍射图像中。全息术在60多年前已由物理学家Dennis Gabor发明，并且是一种允许从对象散射的光被记录且之后被重构的技术。数字全息术使用衍射图案的数字重构。若干重构算法在文献中被描述。
[0184]血细胞计数和分选的应用
[0185]一滴血包含红血细胞(输送氧气)和白血细胞(白细胞)及其子类(既抗感染又形成免疫系统、血小板和血浆的必要元素)的复杂混合物。血液计数(计算每个细胞群的总数)可用来指示许多形式的疾病的存在，且因此是医学上最常进行的血液测试之一。护士收集样本，将血液抽入包含抗凝血剂(EDTA，有时为柠檬酸盐)的试管中以阻止其凝固。样本随后被输送到实验室。诸如基于FACS、fycol梯度和磁珠的分离以及甚至手工计数之类的方法通常在实验室中用于计数或分离不同子类的血液细胞。
[0186]尽管自动化分析仪在血液细胞的数量、平均大小、以及大小变化方面给出快速可靠的结果，但自动化分析仪对于检测细胞的形状方面不那么好，这也是在某些情况下仍使用手动计数的原因。因此，本发明提出的各实施例可用作即时检测来替代上述现有技术方法中的任一个，以在需要时当场作出血液计数。
[0187]许多临床和研究应用对特定白血细胞类型进行计数或隔离供诊断和研究病情。经升或降调节的任一子类型的量，即，粒细胞(中性细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞)、单核细胞、以及单核细胞(B细胞和T细胞)，可用来测量和监测许多不同健康指标，包括传染病、炎症性疾病或甚至癌性疾病。此外，对于许多不同的临床和基础研究测定，白血细胞和红血细胞的分离和收集通常是首先要求的步骤。
[0188]例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)与⑶4分子结合在一起，且由此能够入侵和感染⑶4+T细胞。随着疾病的发展，⑶4+T细胞数量下降，低于其每微升约1，000的正常水平。本发明各实施例可用来在医生办公室、在患者家里、或在无法获得配备齐全的医疗设施的资源受限的环境中，在定期基础上监测HIV发展。
[0189]例如，白血细胞感测身体中毛细血管经过期间的氧化应激，并通过产生活性氧来作出反应(参考:《Nature Clinical Practice Card1vascular Medicine (心血管医学自然临床实践)》(2008)5、811-820)。在当前的临床研究中，常规FACS用来从患者样本中确定白血细胞的数量及其氧化应激水平，作为心血管疾病的指标。可以看到类似结果指示了缺血性综合征以及糖尿病病况。
[0190]根据本发明各实施例的高含量高吞吐量细胞分选器可以实现宽范围的新颖应用，尤其那些与罕见生物事件的隔离有关的应用。对分选罕见事件具有极其有挑战性的要求的应用是从全血中检测循环肿瘤细胞(CTC)。传统癌症治疗基于原发性肿瘤的生物学；然而，常常是肿瘤扩散到身体其他部位导致了负面预后和死亡。出于该原因，从癌症患者血液中检测和表征循环肿瘤细胞(CTC)被认为具有高度的预后和治疗重要性。根据本发明各实施例，提出了一种在细胞分选装置中基于对来自血液的循环肿瘤细胞(CTC)或与癌症有关的循环细胞(CRCC)进行分类和分选来检测癌症的方法。
[0191]在全血样本中，白血细胞(wbc)的数量超过CTC至少106倍，红血细胞(rbc)的数量超过CTC至少109倍。当前检测方法通常依赖表型表征，表型表征需要基于初始磁珠的细胞富集技术，之后对细胞表型进行显微镜分析。尽管当前考虑的标准用于CTC分析，但这些技术是繁重的、需要专家并且在某种程度上仍有主观性。
[0192]关于将针对循环肿瘤细胞的列举和分子检测的不同技术用作癌症诊断手段的优异评论文章在《癌症学(Cancers)》2010、2、1236-1250页中给出。当前黄金标准是CellSearch?技术，并且采用由涂覆有针对EpCAM(上皮标志物)的抗体的磁性纳米粒子组成的铁磁流体。在免疫磁性捕捉和富集之后，细胞被固定且被荧光探针(例如，DAPI，以及角蛋白的抗体和⑶45)染色以标识并列举CTC。CellTracks?分析器，即一种自动化高分辨率荧光显微镜获得图像并且显示一系列形态和荧光染色图像，以供由受训分析者进行最终分类。敏感性的数量级为每7.5mL全血1CTC。
[0193]按尺寸进行隔离(例如，如由ScreenCell在ISET中完成)允许使用尺寸排阻来直接富集上皮细胞，由此降低对检测一组所选上皮标志物的表达的依赖性。外周血液用ISET缓冲剂稀释，加载到膜上，其具有8μηι准直细孔(calibrated pores),见Vona, G等人《美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)》2000、156、57-63。大多数的白细胞足够小以流过细孔，而较大的肿瘤细胞在膜上被捕捉到。该技术通过避免对上皮特异抗体进行免疫标记，使遗漏循环肿瘤细胞的风险最小化。
[0194]当前CTC检测基于使用例如上皮标志物或尺寸的一组偏置预选CTC来评估诊断或治疗性肿瘤标志物(在DNA、mRNA或蛋白质水平方面)。实际上，不存在已知被所有癌症类型一致表达的上皮标志物，即使EpCAM也不能在100%肿瘤类型中被表达，而仅在70-80%可变癌症类型中被表达，见Went等人《人类病理学(Hum.Pathol.)》，2004、35、122-128。被某些人假定成要求转移(metastasis)的EMT (上皮间质转变)过程涉及在上皮细胞变得更具侵入性期间细胞子集的表型变化。因此，可以预期，具有转移潜在性的CTC是固有异质的，且当前细胞富集技术总是在某种程度上引起偏见。
[0195]根据本发明各实施例描述的高含量高吞吐量细胞成像器和分选器可用于癌症检测。患者血样或经稀释的患者血样可被引入该系统。CTC或与癌症有关的循环细胞可基于系统中拍摄的全息图像来计数。根据本发明各实施例的方法不引入任何偏见并且基于用户设置参数来分选。使用当前成像器/分选器从患者血液中准确检测CTC计数可被用作癌症管理临床实践中的诊断方法或治疗跟进方法。
[0196]在分选非常罕见细胞的情况下，一种实现是使用级联系统，例如，捕获系统，其中进行第一粗分选例如用于在与CTC极为不同的细胞之间鉴别(诸如，将红血细胞与白血细胞及类似白血细胞分离)，以及第二、第三等等分选事件可基于其他属性(诸如，白细胞和CTC的尺寸和形态)来细化该分选。该技术是无破坏性的，并且通过将样本重新引入系统作为确认结果的手段使得迭代分析是可能的。如果图像被用来分选细胞，则细胞可随后被用于分子表征。还可将亚群引入系统，以便确认结果或基于不同参数或不同染色作出后续分选。
[0197]可受益于本发明各实施例的其他应用可包括从血液中分离或分选其他罕见细胞(诸如举例而言，异质干细胞群)，从母血中分选胎儿细胞。
[0198]此外，在另一应用示例中，对于避免某些疾病爆发或作为判定要使用哪种治疗法的手段而言，早期病原检测极其重要。病原检测的迅速性以及适当抗生素的应用是当前治疗细菌感染的基石，但无法治疗病毒感染。然而，抗生素的耐药性是一个日益增长的公共健康问题，其很大程度上可归因于过度使用抗生素。因此，尽可能早地检测及标识病原以使得能及时开始最适当的治疗法变得重要。
[0199]然而，细菌通常的尺寸为单细胞，病毒的尺寸约为lOOnm，该尺寸太小以致于常规显微镜不能看见。它们无法自己繁殖，因此它们需要入侵“宿主”细胞并且接管其机构，以便能够产生更多病毒粒子。接种疫苗和数量增长的抗病毒疗法正在发展，这些疗法阻止病毒繁殖并且使疾病更快走完其过程。
[0200]当前，血液培养是用于对疑似有系统性感染的患者进行病原检测的黄金标准方法。这些检测方法通常是双重的:1)对细胞培养物进行生化和显微镜分析，以及2)要对这些细胞培养物执行DNA/NA测试以标识感染。从血液培养中获取结果通常要花3至5天，这对于启动有效治疗而言太迟。荧光活化细胞分选(FACS)已被用作研究对病原的细胞免疫反应的工具，尤其用于对感染细胞对照未感染细胞的鉴别和计数，以及不同疗法(包括疫苗制剂)对这些细胞的效果。对于细菌而言，使用FACS来直接分选该细菌也是可能的，因为细菌尺寸类似于细胞。病毒被认为太小以致于不能由当前FACS系统分选。
[0201]当前FACS或流入成像系统为何无法被用作例行临床分析工具有若干原因。建立高吞吐量高含量细胞成像器和分选器对于在患者样本中以及在食物或环境样本(诸如饮用水)中的检测而言具有明显优势。
[0202]首先是FACS或成像系统被样本中存在的病原污染的风险。实际上，当前FACS系统是非常昂贵的工具，其中组件通常都不是作为一次性使用来实施的。这就是集中式FACS核心设施为何常常拒绝分析潜在地被有害病原污染的样本的原因。在本发明各实施例中，流体处理系统可被设计为一次性使用，并且不同样本之间不会发生污染。不会由于污染而导致假阳性。
[0203]本发明各实施例的第二个优点是，增强的成像分析特征允许通过分析样本中存在的细菌自身的形态来直接标识该细菌。细菌有各种各样的尺寸和形状，包括杆菌、球菌、具有大鞭毛且精细分支结构的逗号状细菌。其中某些形成棉絮状或长丝状。高含量成像器拍摄的全息图像尤其对边缘敏感，且因此极其适于区别不同形态。高含量成像器因此可基于对细菌形态的识别以及细菌单元数的计数来标识生物试样中的细菌感染。因为细菌通过分裂生长，从而随时间形成菌落，所以本发明各实施例还可用来估计菌落形成单元的菌落尺寸并且预测细菌生长曲线。
[0204]FACS和荧光共焦成像是通常用于对感染宿主细胞对照未感染宿主细胞的反应进行计数和分析的方法，其中病毒感染经由荧光标志物(诸如加FITC标志物的抗体或荧光蛋白质)变得可见。根据本发明各实施例，高含量成像器/分选器提供更多关于荧光标志物位置的空间信息。此外，因为全息成像已被证实对于成像较小对象相当高效，所以用于计数同样是可能的，并且或许能直接标识病毒而无需荧光标志物。整个研究领域专注于超分辨率方法，使用小窍门(诸如，偏轴照明、工程制作的孔径)以及使用时间信息来取得更多空间信息，以克服数字全息显微镜中Abbe光学衍射限制。根据本发明各实施例的成像和分选方法还可通过用深度UV或甚至X-ray (部分)相干光源替代LED或激光器进行照射，而被扩展成对非常小的对象(诸如细菌)进行成像。
[0205]在又一其他实施例中，生物制程技术使用活细胞(包括酵母和细菌)来制造产品(诸如，精细化学品、抗体、重组蛋白、疫苗)，以及基于发酵的产品(包括葡萄酒和啤酒)。过程监测系统的目标一般是实现更好且一致的生产产出，以使批次间变化最小化，并且接收演化批次的潜在故障、污染或不可接受性的早期警告，例如，由于被外源微生物污染。控制此类过程的重要变量是细胞计数、细胞尺寸分布和细胞形态。另一示例使用蛋白质结晶尺寸和形态测量以监测该过程。尽管像pH、温度和含氧量之类的参数可以在线监测，但当前处于细胞水平的过程监测方法通常仍然包括手动采样以及常规显微镜分析(这是较乏味的过程)。在线监测方法(包括生物传感器和生物质测量方法)正在发展，但可能包含限制准确性和使用持续时间的示例问题(诸如污损和漂移)。
[0206]在生物反应器中用于生物过程监测的可能原位成像方法在2010年11月《AnalB1anal Chem》398 (6): 2429-38中描述,并且以下描述基于该文章。传感器在整个过程期间直接浸入介质，并且图像被间隔地拍摄，而不中断该过程。获取图像的频率取决于生物过程。对于监测哺乳动物细胞，一小时时间间隔就足够；而对于监测细菌，应选择一分钟周期以获取用于该过程的相关分析信息。在图像获取之后，数据集用复杂图像分析算法来分析。与细胞尺寸、形态以及其他相关变量有关的信息可用于过程控制。所有描述的系统包括源(LED或激光器,有时是基于光纤的激光器)、透镜系统或物镜、以及CCD相机,它们都使用基于反射的常规成像方法。生物反应器中的采样带通常由常规光学显微镜的焦点深度或由机械采样设备(诸如，移动以从反应器取新样本的滑动件)来定义。在这两种情况下，成像是静态的，且并非必然有流动细胞或微生物。
[0207]两个原位成像器实现(一个是Joeris K、Frerichs JG>Konstantinov K>ScheperT 于 2002 年《Cytotech》38:129-134,而另一个是 Camisard V、Brienne JP、Baussart H、Hammann J、Suhr H 于 2002 年《B1technolB1eng》78:73-80)描述了基于透射的明场成像器，但两者仍使用常规成像方法(使用物镜和物镜管收集来自对象的光，并且将其聚焦在CCD相机系统上)。最后，用于并行监测细胞密度的实验流通显微镜系统被描述在《B1technology》杂志第150卷、第I期、2010年10月、第87-93页。该系统首次使用流细胞来持续监测，但该成像器类似于上述原位成像器。
[0208]根据本发明各实施例的设备可相对于生物反应器实现在不同的可能位置:
[0209]一在持续采样该生物反应器的旁路流中持续监测，从而允许光学系统保持在生物反应器之外。
[0210]一在微流体一次性设备(作为生物反应器壁的一部分)中持续监视，例如，在反应器本身旨在由一次性材料制成的情况下。
[0211]一与现有内联方法类似，在生物反应器内部持续监测。
[0212]-在若干地点在生物反应器内部持续监测；因为全息成像器相当紧凑，所以多个监测器可用在大的反应器容器中，以使得将作出更完整的测量并且结果较不依赖于过程参数(诸如混合)。
[0213]-在微流体生物反应器的情况下，成像系统可被实现为生物反应器的流体处理系统的一部分。
[0214]根据本发明各实施例的分选还可用来成像和分选对象，其中对象形状和衍射图案对于鉴别亚群而言是重要的。示例是:
[0215]-分选晶体，例如，可在微流体系统中形成的蛋白质结晶。
[0216]-分选纳米粒子，例如，多分散粒子样本。
[0217]-分选作为纳米粒子测定的一部分的纳米粒子。
[0218]例如，纳米粒子常常用于作出亲合结合反应(诸如，抗体及其对应抗原，或DNA互补链)，由此识别溶液中存在被分析物。通过对来自粒子群的个体粒子进行分选和计数，可以测量溶液中的结合率。
【权利要求】
1.一种用于分选浸入流动介质中的对象的设备(I)，所述设备包括: -全息成像单元，所述全息成像单元包括用于提供多个全息衍射图像的多个全息成像元件(2);以及 -流体处理单元，所述流体处理单元包括多个微流体通道(3)，所述微流体通道(3)包括用于沿对应全息成像元件(2)传导流动介质以对浸入流动介质中的移动对象进行成像的成像区域(4)，所述微流体通道(3)还包括被安排在所述成像区域下游用于可控地将流动介质中的每个对象引导到多个出口(6)中的所选一个出口的微流体开关(5)，所述设备还包括: -处理单元(7)，适于对为所述对象中的每一者在经过所述成像区域(4)中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征，该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记，所述处理单元(7)还适于响应于该表征来控制所述成像区域(4)下游的微流体开关(5)。
2.如权利要求1所述的设备(I)，其特征在于，还包括用于生成同步信号的同步装置，所述同步信号表示检测到每个对象存在于所述成像区域(4)中的每一者下游的流动介质中和/或表示检测到每个对象存在于所述微流体开关(5)中的每一者上游的流动介质中，并且其中所述处理单元(7)被安排成响应于所述同步信号来执行实时表征。
3.如权利要求2所述的设备(I)，其特征在于，所述同步装置被并入所述全息成像元件(2)，或其中所述同步装置被并入所述微流体通道(3)。
4.如权利要求2或3中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述同步装置包括用于接收由所述对象调制的光的光电检测器。
5.如权利要求2至4中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述同步装置包括用于检测受所述对象影响的电信号的至少一个电极。
6.如权利要求2至5中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述全息成像元件(2)适于接收并处理来自所述同步装置的所述同步信号。
7.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述多个微流体通道中的每一者还包括被安排在所述成像区域(4)与所述微流体开关(5)之间用于在实时表征被执行时延迟将所述对象中的每一者从所述成像区域(4)转移到所述微流体开关(5)的曲折区段。
8.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述多个微流体通道(3)按级联方式来安排，以使得至少一个第一微流体通道(3)的至少一个出口(6)将流动介质馈送到至少一个第二微流体通道(3)。
9.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述全息成像单元包括CMOS或CCD图像传感器。
10.如权利要求9所述的设备(I)，其特征在于，所述成像区域(4)中的每个微流体通道(3)被安排成相对于所述CMOS或CCD图像传感器的栅格对准成一角度，并且其中所述处理单元(7)还适于根据为流入对象中的每一者而获取的多个全息衍射图像来构建超分辨率全息衍射图像。
11.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述设备还包括用于提供多个荧光图像的多个荧光成像元件，其中所述成像区域(4)还适于沿所述多个荧光成像元件的对应荧光成像元件传导流动介质，并且其中所述处理单元(7)适于对为所述对象中的每一者在经过所述成像区域(4)时而获取的全息衍射图像和荧光图像进行实时表征。
12.如权利要求11所述的设备(I)，其特征在于，所述多个荧光成像元件中的每一者包括多光谱滤波器组件。
13.如权利要求12所述的设备(I)，其特征在于，所述多个荧光成像元件中的每一者被用来提供所述对象中的每一者在经过所述成像区域(4)时的多个荧光感测信号。
14.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体通道(3)还包括用于在所述成像区域(4)中将所述对象汇聚在流动介质的中心区域的聚焦单元(12)。
15.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述流体处理单元还包括用于将流动介质分布在所述多个微流体通道(3)中的至少两个上的进口(9)。
16.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述全息成像单元包括至少一个用于照明流动介质的至少部分相干的脉冲光源(8)。
17.如权利要求16所述的设备(I)，其特征在于，所述至少一个至少部分相干的脉冲光源(8)包括被配置成从不同角度照明流动介质的多个光源。
18.如权利要求16至17中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述全息成像单元包括图像传感器，其中所述全息成像单元包括光学耦合到所述光源(8)和所述图像传感器且配置成选择光的偏振的至少一个偏振器。
19.如权利要求16至18中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述至少一个部分相干的光源(8)发射一个或多个波长。
20.如权利要求16至19中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述至少部分相干的脉冲光源(8)包括被安排在每个微流体通道上的针孔孔径。
21.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括热驱动或压电驱动的流偏转装置。
22.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括用于生成气泡以使对象在流动介质中移位的微加热器(10)。
23.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括流体侧室，其容积能由压电或热致动器调节以改变所述对象在所述微流体通道中的轨迹。
24.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括流体侧室，其容积能由外部致动的可移动膜调节以改变所述对象在所述微流体通道中的轨迹。
25.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括电连接到交流驱动装置用于通过介电泳来改变所述对象的轨迹的多个电极元件。
26.如先前权利要求中的任一项所述的设备(I)，其特征在于，所述微流体开关(5)包括用于通过声学辐射力来改变所述对象的轨迹的多个超声换能器。
27.一种用于分选浸入流体中的对象的方法(20)，所述方法包括: -将流体的流引入(21)多个微流体通道(3)，其中所述微流体通道(3)包括成像区域
(4)；-记录(22)所述对象在经过所述成像区域(4)中的任一个时的全息衍射图像； -对为所述对象中的每一者在经过所述成像区域(4)中的任一个时而获取的全息衍射图像进行实时表征(23)，该表征考虑至少一个预定对象类型识别标记；以及 -将每个对象导向(24)至出口(6)，所述出口(6)是因变于所述对象的表征从多个出口(6)中选择的。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，记录(22)包括检测所述成像区域(4)上游的流动介质中存在所述对象，并且对全息衍射图像进行表征(23)是响应于检测到的存在来执行的。
29.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，对多个微流体通道(3)并行执行所述记录(22)、表征(24)和导向(24)。
30.如权利要求27至29中的任一项所述的方法，其特征在于，记录(22)包括评估所述对象是否正经过所述成像区域(4)。
31.如权利要求27至30中的任一项所述的方法，其特征在于，对全息衍射图像进行表征(23)包括以下各项之一或其组合:将全息衍射图像与至少一个所存储的表示感兴趣对象类型的基准全息图进行比较，使多个全息衍射图像自相关以便标识对象之间的差异，以及至少执行对经成像对象的部分数字空间重构。
【文档编号】G01N15/14GK104136907SQ201280060623
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2011年12月7日
【发明者】L·拉哈, P·波伊曼斯, K·韦斯特拉肯, D·韦克吕斯, C·刘 申请人:Imec公司, 鲁汶天主教大学