用于腹主动脉瘤的生物标记物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及检测个体的腹主动脉瘤AAA或对AAA的易感性的方法、监测个体的AAA的治疗功效的方法和评估个体的AAA的严重程度或AAA的风险的方法，所述方法涉及测量测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的量并且将其与标准物或先前测试样品中存在的H4B的量进行比较。所述测试样品中存在的H4B的量与所述标准物相比降低指示AAA或对AAA的易感性。可在第二时间点之前向所述个体投与治疗，且第二测试样品中存在的H4B的量与所述第一测试样品相比增加指示AAA的有效治疗。可鉴别出候选者用于进一步测试或监测AAA和/或治疗AAA。
【专利说明】用于腹主动脉瘤的生物标记物
[0001]相关申请案交叉参考
[0002]本申请案主张于2011年10月11日提出申请的美国临时专利申请案第61/545，975号的权益，所述申请案的全部内容以引用方式并入本文中。在此申请案中引用了各种出版物。这些出版物的全部揭示内容均以引用方式并入本申请案中以更全面地描述本发明所涉及领域的现有技术状态。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号HL077440的政府支持下完成。政府拥有本发明中的某些权利。
【技术领域】
[0005]本发明一般来说涉及腹主动脉瘤的新颖生物标记物和使用此生物标记物检测和监测患者的动脉瘤风险的方法。
【背景技术】
[0006]腹主动脉瘤(AAA)是分子机理尚不清楚的严重人类血管疾病。它是由主动脉壁内与渐进性主动脉扩张和最终破裂相关的组织病理学重塑来界定。男性和吸烟是AAA的唯一已知风险因素。年龄超过50岁的每250人中约有一人将死于AAA破裂。然而，对于这种盛行且危及生命的疾病来说，由于对其疾病机理缺乏了解，因此目前为止唯一疗法是手术矫治。此外，手术只推荐用于大于5.5cm的AAA ;且没有症状的较小AAA经常无法诊断出，从而导致静默生长和令人惊讶的致死性破裂。因此增进我们对于AAA病原学的理解具有公共卫生重要性，此可能促成创新的治疗性和预防性策略。
[0007]业内仍需要AAA生物标记物。具体来说，仍需要可用于筛选、检测和监测AAA以及鉴别那些倾向于产生AAA的生物标记物。
【发明内容】
[0008]本发明提供检测个体的腹主动脉瘤(AAA)或对AAA的易感性的方法。所述方法包含(a)使来自个体的测试样品与能够测量测试样品中存在的四氢生物喋呤(H4B)的量的分析装置接触；和(b)比较测试样品中存在的H4B的测得量与H4B的标准量。在本发明的典型实施例中，样品包含血清或全血。测试样品中存在的H4B的量与标准物相比降低指示AAA或对AAA的易感性。在一些实施例中，测试样品中存在的H4B的量与标准物相比统计学显著降低指示AAA或对AAA的易感性。在其它实施例中，H4B的降低与所述标准物相比降低至少约10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。较小降低通常指示对AAA的易感性，而较大降低更可能指示AAA的存在。
[0009]因此，所述方法可进一步包含例如通过超声或通过在一或多个指定间隔后重复测试H4B将个体鉴别为候选者用于进一步测试或监测AAA。所述方法还可进一步包含规定H4B与所述标准物相比降低的个体进行AAA的治疗。治疗的实例包含叶酸疗法和/或DHFR疗法，包括基因疗法。
[0010]还提供监测治疗个体的AAA的功效的方法。在一个实施例中，所述方法包含(a)使于第一时间点获得的来自个体的第一测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；(b)使于第二时间点获得的来自个体的第二测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；和(c)比较第一和第二测试样品中存在的H4B的测得量。在第二时间点之前向所述个体投与治疗，且第二测试样品中存在的H4B的量与所述第一测试样品相比增加指示AAA的有效治疗。此方法可在治疗开始时或在治疗计划已经进行后起始。在一些实施例中，第二样品中存在的H4B的量与第一样品相比统计学显著增加指示AAA的有效治疗。在其它实施例中，H4B的增加与第一样品相比增加至少约10%或增加至少 20%、30%、40%、50%或 60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更大。所述方法任选地进一步包含规定H4B与第一样品相比或与标准物相比降低或增加的个体进行AAA的改良治疗。
[0011]本发明另外提供评估个体的腹主动脉瘤(AAA)的严重程度或AAA的风险的方法。在一个实施例中，所述方法包含(a)使来自个体的测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；(b)测量测试样品中存在的H4B的量；和(c)所述测试样品中存在的H4B的测得量与标准物中存在的H4B的测得量。测试样品中存在的H4B的量与标准物相比降低的程度指示所述个体的AAA的严重程度或风险。在一些实施例中，测试样品中存在的H4B的量与标准物相比统计学显著降低指示AAA或对AAA的易感性。在其它实施例中，H4B的降低与所述标准物相比降低至少约10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。较小降低通常指示对AAA的易感性或AAA的较温和情形，而较大降低更可能指示AAA的存在或AAA的更严重情形。根据测试样品中存在的H4B的量，可如本文所述监测或治疗个体。
[0012]在典型实施例中，分析装置包含高效液相色谱(HPLC)柱或免疫分析试剂盒，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒、化学发光分析试剂盒或其它常规分析试剂盒。因此，本发明进一步提供包含用于检测H4B的试剂和/或分析装置的试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1A-C显示血管紧张素II (Ang II)诱导高苯丙氨酸血症(hph)_l小鼠形成腹主动脉瘤(AAA) ο向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠输注Ang II (0.7mg/kg/天)达14天。图1A是数字照片，其中数字显微照片的插图显示在WT、WT/Ang I1、hph_l和hph-l/Ang II的不同实验组中腹主动脉到第14天时的代表性外观。只有输注Ang II的hph-Ι小鼠产生AAA，具有可见的出血迹象。对AAA区段的苏木精-曙红染色(箭头)显示血栓形成。图1B是显示输注Ang II的hph-Ι小鼠的分别为21%、65%和14%的AAA发病率和死亡率(无AAA对非致死性AAA对致死性AAA)的饼形图。图1C是描绘输注Ang II的hph_l小鼠的平均血压(MBP)变化的图。通过颈动脉内遥测方法(国际数据科学(Data SciencesInternational))连续监测 MBP14 天。
[0014]图2A-C是柱状图，其显示血管紧张素II (Ang II)输注增大四氢生物喋呤(H4B)和N0.的缺乏，并且加剧高苯丙氨酸血症(hph)-l小鼠的内皮NO合成酶(eNOS)解偶联。向野生型小鼠和hph-Ι小鼠输注Ang II (0.7mg/kg/天)达14天，此后收获主动脉用于以下目的:图2A显示主动脉H4B含量；图2B显示主动脉N0.的产生量；且图2C显示在存在或不存在L-NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)时主动脉超氧化物(02‘_)的产生量。P < 0.05。
[0015]图3A-C显示叶酸(FA)通过恢复内皮二氢叶酸还原酶(DHFR)表达来阻止输注血管紧张素II (Ang II)的高苯丙氨酸血症(hph)-l小鼠的内皮NO合成酶(eNOS)解偶联。在Ang II输注(0.7mg/kg/天)前2天开始向野生型小鼠和hph-Ι小鼠经口投与FA (15mg/kg/天)并且在整个14天研究期内进行治疗，此后，收获主动脉用于以下目的:图3A显示主动脉制备物中的内皮和非内皮DHFR表达；图38显示主动脉四氢生物喋呤(H4B)含量；且图3C显示主动脉eNOS解偶联活性(通过NG-硝基-L-精氨酸甲酯[L-NAME]敏感性O2的产生量来指示)O *P < 0.01。
[0016]图4A-F显示叶酸(FA)阻止输注血管紧张素II (Ang II)的高苯丙氨酸血症(hph)-1小鼠的腹主动脉瘤(AAA)形成并使血压正常化。在Ang II输注(0.7mg/kg/天)前2天开始向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠经口投与FA(15mg/kg/天)并且在整个14天研究期内进行治疗。在第O天和第14天，执行腹部超声(维尔沃(Velvo) 770高分辨率回声系统，维索尼克(Visualsonics))以评价利用或不利用FA治疗的输注Ang II的野生型小鼠和hph-Ι小鼠的腹主动脉(AA)尺寸(图4A-D)。主动脉横截面区域由蓝色圆描绘，并且将计算面积列示于每一图像下方。在研究过程期间通过遥测来评价平均血压(MBP)(图4E和4F)，如图1中所述。
[0017]图5A-B是显示叶酸(FA)阻止输注血管紧张素II (Ang II)的高苯丙氨酸血症(hph)-1小鼠的内皮NO合成酶(eNOS)的渐进性解偶联的柱状图。在Ang II输注(0.7mg/kg/天)前2天开始向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠经口投与FA(15mg/kg/天)并且在整个14天研究期内进行治疗 。在第O天、第4天或第8天收获主动脉用于分析(图5A)WT小鼠和(图5B)hph-l小鼠在存在或不存在NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)时O2的产生量。*P < 0.05，相对于 L-NAME ；#P < 0.05，相对于 WT sham ；+P < 0.05，相对于 4 天。
[0018]图6A-C是显示叶酸(FA)阻止输注血管紧张素II (Ang II)的高苯丙氨酸血症(hph)-l小鼠的血管重塑的显微照片。在Ang II(0.7mg/kg/天)或媒剂输注前2天开始利用或不利用FA(15mg/kg/天)治疗野生型小鼠和hph-Ι小鼠并且在整个14天研究期内进行治疗，此后，收获主动脉用于(图6A)苏木精-曙红(H&E)染色(黑色箭头和红色箭头分别指示FA诱导的中膜和外膜变化)；(图6B)伟郝夫-范吉森(Verhoeff-Van Gieson) (VVG)染色(黑色箭头显示弹性蛋白变化)；和(图6C)指示巨噬细胞浸润的巨噬细胞染色。
[0019]图7A-C显示叶酸(FA)阻止高苯丙氨酸血症(hph)-1小鼠的由血管紧张素II (AngII)诱导的基质金属蛋白酶(丽?)2和丽?9活化。在Ang 11(0.7mg/kg/天)或媒剂(sham)输注前2天开始利用或不利用FA(15mg/kg/天)治疗野生型小鼠和hph_l小鼠。在14天研究期后，收获主动脉以评价MMP活性。图7A是显示MMP2和MMP9活性的代表性酶谱。图7B是MMP2活性的定量数据。图7C是MMP9活性的定量数据。*P < 0.05，相对于sham。
[0020]图8A-B二氢叶酸还原酶(DHFR)过表达使输注血管紧张素II (Ang II)的高苯丙氨酸血症(hph)-1小鼠的内皮NO合成酶(eNOS)再偶联。在Ang II输注前2天开始每隔一天向野生型(WT)小鼠和hph-ι小鼠的尾静脉转染来自阿特津生物系统(Altogen Biosystems)的基于脂质的试剂中的DHFR表达载体(pcDNA3.1-DHFR)达14天。在14天输注结束时，收获主动脉用于(图8A)通过蛋白质印迹(Western blotting)测定主动脉制备物中的内皮DHFR表达和(图8B)在存在或不存在NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)时主动脉超氧化物的产生量。*P < 0.05，相对于野生型(WT) sham ；#P < 0.05，相对于L-NAME ；+P < 0.05，相对于 hph-1 sham ο
[0021]图9A-B是显示在两种不同的腹主动脉瘤(AAA)模型中在存在或不存在叶酸(FA)疗法时H4B的主动脉和血浆水平的柱状图。图9A显示从输注血管紧张素II (Ang II)的hph-Ι小鼠(η = 3-4)进行的测量，而图9Β显示从输注Ang II的apoE缺失小鼠(η = 5-6)进行的测量。输注Ang II的apoE小鼠通常到第4周时检查到的AAA发生率为约92%，并且血管在第3周时经历了严重的重塑和AAA产生。循环的H4B和主动脉H4B的相关下降进一步证明循环的H4B可用作AAA的预测和诊断标记物。
[0022]图10A-B绘示在两种不同的腹主动脉瘤(AAA)模型中在存在或不存在叶酸(FA)疗法时H4B水平的主动脉水平与血浆水平之间的相关性。图1OA显示从hph-Ι动物(η =3-4)进行的测量,而图1OB显示从apoE动物(η = 5-6)进行的测量。在两种AAA模型中，循环/血浆H4B与H4B的主动脉水平很好地相关，从而确认循环/血浆H4B用于AAA形成的生物标记物作用，已经将AAA形成与H4B的主动脉缺乏关联。
[0023]图11是显示经口投与叶酸(FA)阻止输注Ang II的apoE缺失小鼠的腹主动脉瘤(AAA)形成的柱状图。Ang II输注诱导92%的研究小鼠发生AAA，且通过经口投与FA使其实质上衰减到17%。在输注Ang II的hph-Ι小鼠(79%发生率在2周内出现，而apoE缺失小鼠是在4周内出现)中，投与FA完全阻止AAA发生(0% )。
[0024]图12是显示经口投与叶酸(FA)恢复输注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能的柱状图。在基线下，eNOS抑制剂L-NAME最低程度地减少超氧化物的产生量，从而暗示eNOS的微小解偶联/功能失调。Ang II输注显著地增加L-NAME敏感性超氧化物的产生量，所述产生量可通过经口投与FA完全消除。这些数据指示FA在恢复输注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能/使eNOS再偶联方面高度有效，这类似于在输注Ang II的hph_l小鼠中所观察到的。
[0025]图13A-B图解说明通过经口投与叶酸(FA)恢复输注Ang II的apoE缺失小鼠的主动脉一氧化氮(NO)生物利用性。通过电子自旋共振(ESR)定量地且选择性地测量主动脉生物可利用的一氧化氮(NO)自由基。与FA使输注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS完全再偶联的发现一致，通过FA治疗也显著改进了主动脉一氧化氮(NO)生物利用性。图13A显示NO的代表性ESR谱。图13B显示主动脉NO水平(η = 6)的分组数据。
【具体实施方式】
[0026]本发明基于以下发现:四氢生物喋呤(H4B)的血浆水平与H4B的组织水平相关，且因此可用作AAA产生的新颖生物标记物，且用作治疗功效的指示物。使用两种不同的AAA模型，也就是说输注血管紧张素II的hph-Ι和apoE缺失小鼠，下文所述的实例证明H4B的血浆水平与H4B的组织水平密切相关，这两者在AAA中均降低并且通过叶酸治疗予以恢复。本发明由此提供筛选个体的血液、血浆或其它体液样品的H4B的方法，从而提供创新、方便且有力的AAA产生预测物。此筛选对具有AAA风险的群体(例如年长吸烟男性)使用时特别有价值。此外，本发明的筛选方法对AAA的预测性远高于当前所鉴别的风险因素，例如吸烟、年龄和性别。[0027]经口投与叶酸使eNOS再偶联并且随后使氧化应激降低并改进一氧化氮生物利用性，此进而阻止先于AAA的血管重塑。这源于叶酸对eNOS辅因子补救酶二氢叶酸还原酶(DHFR)的上调。因此，根据本发明通过H4B测试鉴别的个体可利用叶酸或促进DHFR的其它疗法(例如DHFR基因疗法)进行治疗。此早期检测可减少或消除对于手术修复的需要和破裂风险。
[0028]定义
[0029]除非另有指明，否则本申请案中所用的所有科学和技术术语都具有业内通常所用的含义。如本申请案中所用，以下用语或片语具有所指明的含义。
[0030]如本文所用，“分析装置”是指通常用于分析、测量和/或检测化学物质的存在的分析仪器或设备。所述仪器的典型实例是高效液相色谱(HPLC)柱。可使用其它色谱仪器，以及免疫分析或其它常规检测分析。免疫分析的典型实例是ELISA。
[0031]如所属领域的技术人员所理解，从个体获得的样品可直接与分析仪器接触或在首先与溶剂或其它预备介质接触后再与分析仪器接触。
[0032]如本文所用，“对照”样品通常是从一或多个正常、健康个体获得，或在合适时，从同一个体但在已知个体处于健康状态时获得。可接受的正常水平的参考分析物(在本文中称作“标准物”)也适合作为比较用对照。
[0033]如本文所用，“医药上可接受的载剂”或“赋形剂”包括在与活性成份组合时，允许所述成份保留生物活性并且不与个体免疫系统反应的任何材料。实例包括但不限于标准医药载剂，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各种类型的润湿剂。用于气溶胶或不经肠投与的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9%)盐水。
[0034]包含所述载剂的组合物是通过熟知的常规方法来调配(例如，参见雷明顿医药科学(Remington, s Pharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.真纳罗(A.Gennaro)编辑，马克出版公司(Mack Publishing C0.),宾夕法尼亚州伊斯顿市(Easton, PA), 1990)。
[0035]如本文所用，除非另有明确说明，否则“一(a、an) ”意指至少一者。
[0036]方法
[0037]本发明提供检测个体的腹主动脉瘤(AAA)或对AAA的易感性的方法。所述方法包含(a)使来自个体的测试样品与能够测量测试样品中存在的四氢生物喋呤(H4B)的量的分析装置接触；和(b)比较测试样品中存在的H4B的测得量与H4B的标准量。测试样品中存在的H4B的量与标准物相比降低指示AAA或对AAA的易感性。在一些实施例中，测试样品中存在的H4B的量与标准物相比统计学显著降低指示AAA或对AAA的易感性。可检测在约lpmol/mg到6pmol/mg范围内的循环H4B水平差异。在一些实施例中，H4B水平降低到小于约3pmol/mg指示AAA,并且低于约2pmol/mg的水平指示严重AAA。在其它实施例中,H4B的降低与所述标准物相比降低至少约10 %或降低至少20 %、30 %、40 %、50 %或60 %、70 %、80%或90%。较小降低,例如降低到约2.9-2.0pmoI/mg范围,通常指示指示对AAA的易感性，而较大降低，例如降低到小于约1.9pmol/mg,更可能指示AAA的存在。循环H4B的量与动脉瘤的大小相关。
[0038]在一些实施例中，用于参考的标准H4B量是根据所属领域的技术人员认为对于无AAA的健康个体来说正常的水平来采用，这将根据年龄和性别而变化。在其它实施例中，在所述方法中用于比较的标准物是从正常、健康对照个体获得的样品。在另外其它实施例中，用于比较的标准物是在已知所述个体无疾病时预先取自同一个体的测试样品。用于比较的参考水平的额外可用来源包括在AAA开放修复手术期间常规收集的动脉瘤组织和相邻组织，以及在手术前收集的血液、血浆或其它体液样品。因此，在一些实施例中，比较从个体获得的测试样品中的H4B水平与正常的标准H4B水平和从AAA样品获得的已知异常水平两者。
[0039]任选地，所述方法可进一步包含例如通过超声或通过在一或多个指定间隔后重复测试H4B将个体鉴别为候选者用于进一步测试或监测AAA。例如，具有较严重病情的个体可每月监测一次，而具有轻微病情的那些可每三个月监测一次。治疗医师将能够基于个别患者的需要和风险来调节此计划。因此，可重复所述方法且可比较H4B的测得量与标准物或与来自同一个体的先前测量值。初始监测可包含重复测试H4B,且在H4B测试指示朝AAA的显著进展后，可指引个体进行治疗和/或超声评估。测量H4B水平的变化可在可通过超声检测AAA之前对其进行检测。对AAA的早期检测使得可进行侵袭性较小的治疗并避免手术。例如，如果个体表现出初始5-10%降低，随后在随访期后观察到显示15%降低，那么所述个体需要比随时间不显示任何降低或< 10%稳定水平的小量降低的那些受到更频繁地监测。
[0040]所述方法可进一步包含规定H4B与标准物相比降低的个体进行AAA的治疗。所述治疗的实例包含叶酸疗法和/或二氢叶酸还原酶(DHFR)-靶向疗法，包括基因疗法和有效改进DHFR功能的任何药理学或其它疗法，此将改进H4B水平并预防、延迟或改善AAA。同样，治疗可包含针对eNOS解偶联的其它对策。
[0041 ] 还提供监测治疗个体的AAA的功效的方法。在一个实施例中，所述方法包含(a)使于第一时间点获得的来自个体的第一测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；(b)使于第二时间点获得的来自个体的第二测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；和(c)比较第一和第二测试样品中存在的H4B的测得量。优选地，使用相同或接近相同的分析装置和条件来获得第一和第二测试样品。在第二时间点之前向所述个体投与治疗，且第二测试样品中存在的H4B的量与所述第一测试样品相比增加指示AAA的有效治疗。
[0042]监测治疗功效的方法可在治疗开始时或在治疗计划已经进行后起始。在一些实施例中，第二样品中存在的H4B的量与第一样品相比统计学显著增加指示AAA的有效治疗。在其它实施例中，H4B的增加与第一样品相比增加至少约10%或增加至少20%、30%、40%、50 %或60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、150 %、200 %或更大。所述方法任选地进一步包含规定H4B与第一样品相比或与标准物相比降低或增加的个体进行AAA的改良治疗。例如，可通过增加或降低投与个体的叶酸或另一治疗剂的量来改良治疗。
[0043]本发明另外提供评估个体的腹主动脉瘤(AAA)的严重程度或AAA的风险的方法。在一个实施例中，所述方法包含(a)使来自个体的测试样品与能够测量测试样品中存在的H4B的量的分析装置接触；(b)测量测试样品中存在的H4B的量；和(c)比较所述测试样品中存在的H4B的测得量与标准物中存在的H4B的测得量。测试样品中存在的H4B的量与标准物相比降低的程度指示所述个体的AAA的严重程度或风险。在一些实施例中，测试样品中存在的H4B的量与标准物相比统计学显著降低指示AAA或对AAA的易感性。在其它实施例中，H4B的降低与所述标准物相比降低至少约10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。较小降低通常指示对AAA的易感性或AAA的较温和情形，而较大降低更可能指示AAA的存在或AAA的较严重情形。根据测试样品中存在的H4B的量，可如本文所述监测或治疗个体。
[0044]在本发明的典型实施例中，样品包含血清或全血，但其可为任何体液。在典型实例中，从个体抽出2ml全血，但小于约0.5ml可足够。样品可在多种条件下收集，包括在收集时利用或不利用旋转减慢。样品可使用例如多种收集管处理，所述收集管包括不含补充物、含EDTA、含肝素和业内已知的其它条件。同样，样品可收集并储存在多种条件下，包括例如在液氮中快速冷冻；在_20°C下冷冻几周且随后转移到-70°C或-80°C ;或样品在_70°C或-80°C下冷冻并储存在此处。
[0045]分析装置和试剂盒
[0046]在典型实施例中，分析装置包含高效液相色谱(HPLC)柱或免疫分析试剂盒，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒、化学发光分析试剂盒或其它常规分析试剂盒。在典型实施例中，HPLC装配有荧光或电化学检测器和C-18柱。
[0047]用于本文所述方法中的试剂盒也在本发明范围内。所述试剂盒可包含载剂、包装或间隔化成可容纳一或多个容器(例如小瓶、管等)的容器，每一容器包含一个待用于所述方法中的单独元件。例如，容器可包含一或多种用于检测H4B的试剂，所述试剂任选地以可检测方式标记。试剂盒还可包括一或多个用于报告工具(reporter-means)(例如生物素结合蛋白，例如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)的容器，所述报告手段结合到用于检测H4B的可检测标记，例如酶、荧光或放射性同位素标记。
[0048]本发明试剂盒通常将包含上述容器和一或多个其它容器，所述其它容器包含从商业和用户角度来看需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明书的包装插页。另外，标签可提供于容器上以指示所述组合物用于特定应用，且还可指示使用说明。也可在试剂盒所包括的插页上包括说明和/或其它信息。
[0049]投与和剂量
[0050]组合物是以任何合适的方式经常与医药上可接受的载剂、赋形剂一起投与或以医药上可接受的盐形式投与。可利用在本发明上下文中向个体投与治疗的合适方法，且尽管超过一种途径可用于投与特定组合物，但特定途径经常可提供比另一途径更直接且更有效的反应。
[0051 ] 在本发明上下文中，投与患者的剂量应足以随时间在患者中实现有益治疗反应，或抑制疾病进展。因此，将组合物以足以诱发有效反应和/或减轻、减少、治愈或至少部分地阻止疾病的症状和/或并发症的量投与个体。将足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。一般来说，对于包含叶酸的医药组合物来说，剂量中存在的量在每千克个体体重约Img到约IOOmg和更高范围内。代表性量包括但不限于lmg/kg体重、5mg/kg体重、15mg/kg体重、30mg/kg体重、100mg/kg体重或更高mg/kg体重。合适量将随着患者的大小而改变，但通常将在约l_20mg/片剂或0.1mL到约5mL范围内。
[0052]本文所揭示的治疗组合物的投与途径和频率以及剂量将随个体不同而改变，且可使用标准技术容易地确定。一般来说，医药组合物可经口或通过注射(例如，皮内、瘤内、肌内、静脉内或皮下)、经鼻内(例如，通过抽吸)投与。通常，至少I到10次剂量可经52周时期投与。优选地，以I个月间隔投与6次剂量，且此后可周期性地给予额外补充物。交替方案可能适合个别患者。在一个实施例中，间隔10天投与2种或更多种口服补充物。当用叶酸治疗时，其通常最好每天服用一次。[0053]一般来说，适当的给药和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供活性齐U。所述反应可通过确定治疗患者与非治疗患者相比临床结果的改进来监测。
[0054]治疗包括预防和治疗。预防或治疗可通过于单个时间点或多个时间点单次投与到单个或多个部位来实现。也可接近同时投与到多个部位。患者或个体包括哺乳动物，例如人类、牛科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、猪科动物和羊科动物。个体优选人类。
[0055]实M
[0056]呈现以下实例来说明本发明并帮助所属领域的技术人员实现和使用本发明。所述实例并不打算以任何方式在其它方面限制本发明范围。
[0057]实例1:解偶联的内皮一氧化氮合成酶在AAA形成中的作用
[0058]本实例证明eNOS解偶联/四氢生物喋呤缺乏在AAA形成中的成因性作用。因此，经口投与叶酸、内皮靶向性二氢叶酸还原酶基因疗法和可能针对eNOS解偶联的其它对策可用作AAA的新治疗法。
[0059]通过产生一氧化氮(N0‘)来快速地使超氧化物(02‘_)和其它活性氧(ROS)不活化，内皮NO合成酶(eNOS)保护血管细胞免于氧化损害。积累的证据证明，当eNOS辅因子四氢生物喋呤(H4B)缺乏时，eNOS变得功能失调而产生O2._，而非NO‘H3。此eNOS的解偶联可使内皮功能失调恶化，使得极难矫正。一种能够将eNOS转变成解偶联态的重要病理性激动剂是血管紧张素II (Ang II)1’2’5。如前文所示，Ang II通过NADPH氧化酶的暂时性活化和随后H4B补救酶二氢叶酸还原酶(DHFR)的过氧化氢依赖性、内皮特异性缺乏使eNOS解偶联U5。
[0060]Ang II在血管疾病(例如高血压和动脉粥样硬化)的发病机理中起到重要作用，其是通过充分表征的机理起作用，例如血管收缩、血管NADPH氧化酶的活化和ROS依赖的炎症性和肥大性信号传导14_18。然而，eNOS的解偶联代表Ang II使氧化应激延长的新颖机理u’5。然而，仍不清楚解偶联的eNOS是否直接参与血管疾病的发病机理。继GTP环水解酶
I(GTPCHl)突变后的四氢生物喋呤(H4B)缺乏诱导小鼠的高苯丙氨酸血症19’2°。在基线下，高苯丙氨酸血症(hph)-l小鼠的NO‘生物利用性降低，但因过氧化氢依赖性补偿而保持血管舒张19。在与C57BL6小鼠杂交> 10代后，对hph-Ι小鼠进行基因分型并使用电子自旋共振进行表征用于检测O2的产生量。尽管在野生型(WT)动物中，NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)因NO‘损失而增加02‘_的产生量，但L-NAME衰减hph_l小鼠的O2的产生量，从而暗示eNOS的解偶联。因此，hph-Ι小鼠可用作极佳模型系统以研究解偶联的eN0S/H4B缺乏对于血管发病机理的作用。
[0061]为了检查解偶联的eNOS是否放大了 Ang II在扩大高血压或增大血管重塑方面的病理学效应，向WT小鼠和hph-Ι小鼠输注Ang II，并保持14天。发现截至第6天到第7天通过颈动脉内遥测方法监测的平均血压(MBP)在两组中均增加。尽管WT小鼠的MBP继续上升，但hph-Ι小鼠的MBP开始下降，这与猝死(13.9%;n = 72)相关。立即尸体检查显示破裂性腹主动脉瘤(AAA)。约65%的存活hph-Ι小鼠产生AAA，总发病率为79% (η = 72)。对AAA进行进一步表征且显示输注Ang 11的hph_l小鼠的渐进性DHFR缺乏和eNOS的解偶联係广泛血管重塑、炎症和AAA形成的基础。有趣的是，通过经口投与叶酸(FA)恢复DHFR表达或DHFR的过表达完全阻止输注Ang II的hph_l小鼠的AAA形成。这些治疗也钝化了eNOS的渐进性解偶联，以及特征在于基质金属蛋白酶(MMP)活化、弹性蛋白分解、胶原重塑和巨噬细胞浸润的血管重塑和炎症。因此这些创新发现代表eNOS解偶联/H4B缺乏在AAA形成中起到成因性作用且经口投与FA、DHFR靶向疗法和可能针对eNOS解偶联的其它对策可用作新颖且有力的AAA治疗方案的第一证据，所述AAA是当前无法获得药理学治疗的严重且盛行的人类疾病。
[0062]方法
[0063]动物、Ang II输注和血压测量
[0064]基于邱(Khoo)等人21的方案将hph-Ι小鼠(最初在CBA背景下)19与C57BL6小鼠回交> 10代并进行基因分型。只将C57BL6背景下的纯合子hph-Ι小鼠用于实验。使用皮下植入的渗透泵(杜瑞克(Durect)公司)向24周龄WT和hph_l雄性小鼠输注AngII (0.7mg/kg/天)。在14天输注期间，通过遥测方法监测血压。在植入渗透泵前10天将无线血压探针植入动物中。将血压探针导管插入左颈动脉中，而将探针主体插入右侧腹部中。
[0065]使动物从手术中恢复I周。这段时期后，测量血压3天以获得基线。然后在手术后第10天植入渗透泵。每天从9:00AM到4:00PM以250-Hz取样速率进行测量。每天计算平均血压作为整个记录期的平均值。动物和实验程序的使用经洛杉矶加利福尼亚大学实验动物照护与使用委员会(the institutional animal care and usage committee at the'niversity of California Los Angeles)批准。主动脉NO和超氧化物的产生量的电子自旋共振测定、主动脉H4B含量的高效液相色谱测定和内皮DHFR表达的蛋白质印迹测定如先前所公开来执行1’2’5。
[0066]从小鼠主动脉分离内皮细胞
[0067]收获后，将完整主动脉纵向切开且随后在37°C下用胶原酶(0.6mg/mL)消化20分钟，然后利用卷棉子轻轻去除内皮细胞。将含有内皮细胞的上清液离心且裂解用于蛋白质印迹分析。
[0068]FA的经口投与和DHFR过表达
[0069]开始向WT小鼠和hph-Ι小鼠连续经口投与FA(15mg/kg/天)或在Ang II输注前2天开始每隔一天尾静脉转染来自阿特津生物系统的基于脂质的试剂中的DHFR表达载体(pcDNA3.1_DHFR)5达14天。在2周输注时期期间每天监测小鼠两次，且收获主动脉用于评价到第14天时的AAA形成、内皮DHFR表达和eNOS解偶联活性。立即检查在14天输注时期期间猝死的动物的动脉瘤且新收获主动脉用于实验。
[0070]腹主动脉大小的超声检测
[0071]用异氟烷将动物麻醉且置于温度控制桌上，所述温度控制桌还测量ECG的心率。在整个实验内调节异氟烷水平以维持心率在400bpm与500bpm之间，同时使动物充分麻醉。使用毛发去除乳膏从腹部去除毛发，且将预热超声传导凝胶施用到腹部区域上。将超声探针(维尔沃770，维索尼克)置于凝胶上以使主动脉横向地可视化。使用多普勒(Doppler)测量来鉴别主动脉中脉动流的存在。通过在所有动物中使紧接左肾动脉分支上方的主动脉可视化来确保图像获取的一致定位。记录图像且将其保存到PC计算机上用于离线面积分析。依照标准组织学方案进行苏木精-曙红和伟郝夫-范吉森染色。
[0072]巨噬细胞染色
[0073]将福尔马林固定和石蜡包埋的组织以5μπι切片。通过用二甲苯洗涤去除石蜡且然后利用递减浓度的乙醇使其再水化。通过将切片在98.5°C抗原修复缓冲液(lOymol/L柠檬酸、0.01%吐温(Tween) 20)中浸溃20分钟来执行抗原修复。在PBS+0.1%曲通(triton) (PBS-T)中洗涤切片且然后在室温下用于PBS-T中的2%正常山羊血清将其封阻3小时。然后在4°C下将切片与一级抗体(Mac-3，BD法明津(Pharmingen)，2%于PBS-T中)一起培育过夜。在用PBS-T洗涤I小时后，在室温下在黑暗中将切片与二级抗体(阿乐萨福陆(Alexa fluor) 488，2%于PBS-T中)一起培育2小时。在用PBS-T洗涤I小时后，依次用递增等级的乙醇和二甲苯将切片脱水。用普芒特(Permount)介质将切片封固并利用共焦显微镜(莱卡(Leica)，SPl倒置)拍照。如先前所公开来执行MMP活性分析22。
[0074]统计学分析
[0075]通过ANOVA执行不同治疗组之间的比较。当指示差异时，使用邓奈特事后测试(Dunnet post hoc test)。将P < 0.05设定为统计学显著性。附图中所示所有分组数据均呈现为平均值土 SEM。
[0076]结果
[0077]向hph-Ι小鼠输注Ang II诱导AAA形成
[0078]向24 周龄雄性 WT 小鼠(η = 72)和 hph-Ι 小鼠(η = 72)输注 Ang II (0.7mg/kg/天)14天。约14%的输注Ang II的hph_l小鼠在14天内突然死于AAA破裂(图1B)。在存活者中，65%产生AAA，总发病率为79% (图1A-1B)。相比之下，输注Ang II的WT小鼠或未治疗hph-Ι小鼠均未死亡或产生AAA(图1A)。通过颈动脉内遥测方法监测MBP且发现hph-Ι小鼠与WT小鼠相比在基线下略高(S卩，第O天Ang II输注；图1C)。在AngII输注期间，截至第6天，MBP在两种基因型中均增力口 (WT:101±3-140 +2mm Hg ；hph-l:112±3-140±2_ Hg;图1C)。此后，MBP在hph_l小鼠中下降，而其在WT小鼠中继续上升(图 1C)。
[0079]Ang II输注在hph_l小鼠中增大H4B和N0.的缺乏并加剧eNOS解偶联
[0080]对从输注Ang II的WT小鼠和hph_l小鼠新分离的主动脉进行H4B含量的高效液相色谱测定以及N0.和O2.-的产生量的电子自旋共振测定U2。与WT小鼠相比，hph-Ι小鼠表现降低的主动脉H4B生物利用性(图2A)，所述主动脉H4B生物利用性因Ang II输注而进一步降低(1.9 + 0.2-1.0 + 0.lpmol/mg蛋白质；图2A)。Ang II输注也显著地降低WT小鼠的主动脉H4B生物利用性(5.1±0.2-3.8±0.4pmol/mg蛋白质)。值得注意的是，主动脉N0.的产生量反映了输注Ang II的WT小鼠和hph_l小鼠的这些变化(图2B)。主动脉O2的产生量在存在或不存在L-NAME时测定。hph-Ι小鼠的基础O2的产生量是WT小鼠的两倍(图2C，比较sham hph-Ι对sham WT)。尽管L-NAME在未治疗WT小鼠中因抑制eNOS偶联而增加O2 产生量(图2C)，但L-NAME降低输注Ang II的WT小鼠的O2 产生量，这与响应Ang II的eNOS解偶联一致，如先前所报道1,5 (图2C)。在hph-Ι小鼠中，L-NAME降低未治疗小鼠的O2产生量，这与在不存在Ang II输注时eNOS在基线下的解偶联一致(图2C)。重要的是，Ang II输注使hph-Ι小鼠的eNOS进一步解偶联，如通过受L-NAME完全抑制的O2的实质上更高的产生量所证明(图2C)。
[0081 ] FA在输注Ang 11的hph_l小鼠中恢复内皮DHFR表达和H4B生物利用性并阻止eNOS解偶联
[0082]在Ang II输注(0.7mg/kg/天)前2天开始向WT小鼠和hph_l小鼠经口投与FA(15mg/kg/天)并且在整个14天研究期内进行治疗。分析内皮细胞(从主动脉消化，参见方法部分)和内皮细胞剥离的主动脉两者的DHFR表达。如所显示，hph-Ι小鼠表现降低的内皮DHFR表达，这因Ang II输注而进一步降低。FA治疗将hph_l小鼠的内皮DHFR表达恢复到接近WT水平(图3A)。同样通过FA治疗阻止由Ang II在WT小鼠与hph_l小鼠两者中诱导的H4B缺乏，使两组中的H4B水平甚至高于基线(图3B)。此外，FA阻止输注AngII的WT小鼠和hph-Ι小鼠两者的eNOS解偶联，如通过L-NAME敏感性O2 ‘ _产生量的完全衰减所证明(图3C)。
[0083]FA治疗在输注Ang II的hph_l小鼠中阻止AAA形成并使血压正常化
[0084]关于此研究，使用总共21只经FA治疗的输注Ang II的hph_l小鼠，且这些动物均未产生AAA。使用2X2列联表的统计学分析显示此AAA产生的降低是显著的(P< 0.0001)。在第O天和第14天，使用超声(装配有45MHz换能器的维尔沃770高分辨率回声系统，维索尼克)监测腹主动脉尺寸。Ang II输注诱导hph-Ι小鼠的腹主动脉的显著扩大(0.37-1.96mm2)，这是通过FA治疗来防止(0.39-0.52mm2 ；图4A到4D)。相反，在WT小鼠中，Ang II诱导腹主动脉大小的最小增加(0.53-0.66mm2)。另外，FA在衰减WT小鼠的Ang II诱导的高血压方面高度有效(图4E)，并且其还阻止输注Ang II的hph_l小鼠的MBP下降(图4F)。这些数据表明，在输注Ang II的WT小鼠中，eNOS的解偶联导致MBP升高，这最有可能是因为NO‘生物利用性降低所致，而在表现更大程度的eNOS解偶联的hph-1小鼠中，ROS的过量产生自相矛盾地降低MBP，或MBP的降低是通过独立于ROS的机理介导。
[0085]FA阻止输注Ang II的hph_l小鼠的eNOS的渐进性解偶联和血管重塑
[0086]为了检查在AAA产生期间的不同时间点处FA对eNOS解偶联的影响，在起始AngII输注后第4天和第8天关注O2 产生量。收获主动脉且在存在或不存在L-NAME时进行02‘_的电子自旋共振检测。在WT小鼠中，对于两个检查时间点，eNOS解偶联活性均保持响应Ang II而稳定。如图5A中显而易见，反映eNOS解偶联活性的L-NAME敏感性O2 产生量在第4天和第8天类似。相比之下,Ang II诱导hph-Ι小鼠的eNOS的渐进性解偶联。如图5B中所显示，L-NAME可抑制份数的O2产生量在第8天与第4天所观察到的相比增大。重要的是，在两个时间点，FA均一致地抑制hph-Ι小鼠的eNOS解偶联活性。在额外实验中，发现FA还阻止hph-Ι小鼠的Ang II诱导的血管重塑。如通过苏木精-曙红染色所指示，FA消除了输注Ang II的hph-Ι小鼠的中膜退化和外膜炎症细胞募集(图6A)。更具体来说，FA衰减了中膜弹性蛋白的扁平化和弹性蛋白纤维的稀疏化，如通过伟郝夫-范吉森(VVG)染色所显示(图6B)。对于输注Ang II的小鼠，浸润性巨噬细胞(包括MMP9在内的基质降解酶的一个主要来源)也受到显著上调，这经FA治疗完全衰减(图6C)。此外，FA衰减了 hph-Ι小鼠的由Ang II诱导的MMP2活化和MMP9活化的增大，而其也抑制了 WT小鼠的由Ang II诱导的MMP2活化(图7)。
[0087]DHFR基因疗法在输注Ang II的hph_l小鼠中使eNOS再偶联并阻止AAA形成
[0088]如先前所显示，DHFR基因疗法在使输注Ang II的WT小鼠的eNOS再偶联方面有效、为了测试DHFR基因疗法是否足以克服其在输注Ang II的hph_l小鼠中在对于AAA形成至关重要方面的不足，在起始Ang II输注之前且在整个输注期内用DHFR转染WT小鼠或hph-Ι小鼠。在成功地活体内转染含有DHFR的表达载体后，内皮DHFR表达显著增强(图8A)5，且这在完全衰减输注Ang II的hph-Ι小鼠的eNOS解偶联增大(L-NAME)而非如WT对照中的O2-.产生量增加方面有效(图8B)。过表达DHFR的输注Ang II的hph_l小鼠均未产生AAA。
[0089]讨论
[0090]本研究的最重大发现是首次证明eNOS解偶联/H4B缺乏在AAA形成中的成因性作用和eNOS再偶联的治疗潜力。在eNOS在基线下解偶联的hph_l小鼠中，Ang II输注诱导AAA形成与eNOS的进一步解偶联。利用经口投与FA进行治疗有效地同时阻止hph_l小鼠的eNOS解偶联与AAA形成。此外，FA衰减hph_l小鼠与WT小鼠两者的由Ang II诱导的血管重塑，并差别地调节两组动物的血压对Ang II的反应。这些发现表明eNOS解偶联使得易于形成AAA且针对eNOS再偶联的策略可在治疗这一血管病症中有益。
[0091]已在人类AAA中全身性地与局部地检测到氧化应激参数升高23’24。此外，已结合在动物模型中以实验方式诱导的AAA报道了主动脉氧化应激增加，且针对氧化应激的对策已证明在阻止输注Ang II的小鼠的AAA形成方面有效，但在人类中无效25_27。尽管先前已确定血管平滑肌的作用，但是否还有氧化应激的其它细胞或酶来源参与AAA的发病机理仍有待全面理解。这是首次在鼠类模型中报道解偶联的eNOS可造成氧化应激，从而导致严重血管重塑和AAA形成。AAA的肾下模式非常类似于在人类中所发现的。另外，在具有解偶联的eNOS的小鼠中观察到的病理学特征类似于在人类AAA中所观察到的那些，包括外膜炎症、MMP活化和基质降解(图6和7)。此外，AAA易于破裂，从而导致猝死，如通过这些输注AngII的hph-Ι小鼠的14%死亡率所证明(图1B)。值得注意的是，解偶联过程使eNOS成为过氧亚硝酸盐生成物，从而暗示了过氧亚硝酸盐而非其它ROS可能用作AAA形成的重要氧化还原信号传导介体。喂养高脂肪的载脂蛋白E缺失小鼠缺失eNOS导致自发AAA形成，但发生率低得多，为25% 28’29。值得注意地，也已在载脂蛋白E-缺乏小鼠中在基线下观察到eNOS解偶联7’3°。缺乏eNOS的小鼠表现随N0.产生量损失而发生的氧化应激增加。然而，这些小鼠并未产生eNOS解偶联，因为其缺乏功能eNOS蛋白质。总之，这些数据表明血管系统中的eNOS解偶联依赖性N07R0S失衡而非N0.产生量损失本身更深刻地诱导了 AAA形成。所述数据也表明内皮细胞在参与促进AAA形成的氧化物生成中的新颖作用。
[0092]Ang II输注诱导hph_l小鼠的血压的快速上升，这类似于在WT小鼠中所观察到的。然而，在hph-Ι小鼠中，在第6天Ang II输注后，血压开始渐进性地下降，截至第11天达到预治疗值。相比之下，在WT小鼠中，血压在整个Ang II输注过程中不断上升。利用已证明使eNOS再偶联u1’32的FA进行治疗同时衰减源于Ang II输注的WT小鼠的血压上升与hph-Ι小鼠的血压下降,表明eNOS解偶联参与这两种反应。在WT动物的情况下，由AngII诱导的eNOS解偶联可能通过降低N0.生物利用性而导致高血压。N0.生物利用性降低还可能造成hph-Ι小鼠在基线下的血压增加以及对Ang II输注的初始升压反应(图1C)。输注Ang II的hph-Ι小鼠的血压的随后下降也似乎源于eNOS解偶联,但确切机理仍有待确定。可能是生长的动脉瘤影响血液动力学，因而影响血压。氧化应激对血压的调节是复杂的且依赖于可具有血管收缩或血管舒张效应的NO‘的破坏与ROS的产生之间的平衡。例如，过氧化氢已显示介导高血压动物的补偿性血管舒张6。那么通过eNOS的再偶联清除eNOS源过氧化氢可增加血管收缩性(vasocontractility)和血压。考虑到WT小鼠响应Ang II输注而产生持续高血压,但没有AAA形成，而hph-Ι小鼠产生AAA形成，但仅有暂时性高血压，所述数据与高血压并非AAA产生的决定性风险因素但其可促进疾病过程的先前观点一致 28,29,33
[0093]也很重要的是，注意eNOS在输注Ang II的hph_l小鼠中渐进性地解偶联，但在WT小鼠中则不会(图6)，这与通过FA治疗完全矫正的hph-Ι小鼠的渐进性DHFR缺乏一致(图3A)。这些数据指示内皮DHFR缺乏在介导eNOS解偶联和AAA形成中的关键作用。DHFR在血管细胞而非内皮细胞中表达；然而，只有内皮DHFR丰度与主动脉H4B和NO‘生物利用性相关(图 3A)1’5。
[0094]先前研究已显示MMP (特别是MMP-2和MMP-9)是AAA产生的主要参与者(player) 34^36 0在此研究中，观察到这些酶在输注Ang II的hph_l动物中的活性均增加(图7B和7C)，这与那些早期观察结果非常匹配。有趣的是，MMP-2活性在并未产生AAA的输注Ang II的WT动物中也增加。这似乎表明单独MMP2活化不足以实现AAA产生。值得注意的是，仅在输注Ang II的hph-Ι小鼠中发现MMP-9活性增加。此外，这些动物的巨噬细胞染色(图6C)丰度显著高于输注Ang II的WT动物。这些发现与AAA中的MMP-9的来源一般为巨噬细胞的先前观察结果一致36。总之，所述数据表明Ang II输注导致WT动物与hph-1动物两者的主动脉中MMP-2的产生增加，很有可能来自血管平滑肌细胞34’36’37和内皮细胞38’39。然而，来自受刺激血管细胞和浸润性巨噬细胞的MMP-9的增加是发生AAA所必需的。
[0095]这些数据创新性地表明eNOS解偶联/H4B缺乏在AAA形成中的成因性作用并且提高了经口投与FA、DHFR基因疗法和可能针对eNOS解偶联的其它对策可在治疗AAA中具有益处的可能性。
[0096]参考文献
[0097]实例I中所提供的参考文献引文的完整列表可在闻(Gao)等人，2012,闻血压(Hypertension) 59:158-166 中找到。
[0098]实例2:通过饮食叶酸阻止腹主动脉瘤形成
[0099]本实例证明补充FA的饮食可通过改进组织H4B水平和eNOS的再偶联来阻止输注Ang II的apoE缺失小鼠产生AAA。实例I中呈现的数据显示FA在输注Ang II的hph_l动物模型中消除AAA产生方面有效。在此实例中，在另一 AAA模型中测试所述治疗而显示FA的保护作用扩展到其它模型。此外，本实例测试了 FA是否通过H4B和eNOS的再偶联来发挥其保护作用。
[0100]使用植入式阿泽特(Alzet)渗透泵向3到5月龄apoE缺失小鼠输注Ang
II(1000ng/kg/min)达4周。在Ang II输注前两天且在整个4周研究期内向动物进给正常饲料或定制的FA饲料(15mg/kg/天)。值得注意的是,26只食用正常饲料的输注Ang II的apoE缺失小鼠中有24只(92.3% )产生AAA(图11)。利用FA治疗，AAA的发生率下降到24只中的4只(16.7%)0通过电子自旋共振测定的主动脉超氧化物产生量显示apoE缺失小鼠经Ang II处理而增加2.67±0.15倍，这通过投与FA而衰减到1.75±0.01倍(各自为η = 6)。也对反映eNOS解偶联活性的L-NAME敏感性超氧化物产生量进行了测量。经Ang II处理的apoE缺失小鼠大大增加了 eNOS功能失调，其中L-NAME敏感性超氧化物产生量增加2.22±0.2倍，从apoE缺失小鼠在1.17±0.06倍的基线下的eNOS适度解偶联显著放大。用FA进行治疗恢复了 eNOS功能，导致L-NAME敏感性超氧化物的-1.22±0.4倍变化，这指示没有来自eNOS的超氧化物产生量。这些数据证明，经口 FA治疗在输注Ang II的apoE缺失小鼠的第二 AAA模型中降低AAA发生率方面极为有效。所述数据进一步表明，FA的这种保护作用至少部分地归因于eNOS功能的恢复。
[0101]实验设计:
[0102]关于此研究，向apoE缺失雄性动物输注Ang II达4周，这已在文献中显示在90-100%动物中可靠地产生AAA。向一组动物进给混合有FA的饲料。在输注期使用非侵袭性超声技术监测AAA产生。在4周结束时，收获来自动物的主动脉并执行组织学或生物化学分析以评价AAA的各种标记物和eNOS功能状态。
[0103]将含有Ang II (1000ng/kg/min)或媒剂的渗透泵(阿泽特，2004型)皮下植入动物中。向动物给予在室内制备的混合有FA(15mg/kg/天)的定期饲料或食物颗粒。在无痛处死后从动物小心地切开主动脉并清洁掉结缔组织。每周且在无痛处死后从每一动物收集血液样品(约0.1mL)。
[0104]在Ang II输注期通过超声成像系统(维沃(Vevo) 770,维索尼克)来非侵袭性地监测AAA的产生。使腹主动脉横向地成像并通过多普勒测量来鉴别主要脉动流的存在。通过使紧接左肾动脉分支上方的主动脉可视化来维持动物之间沿主动脉的一致定位。随后从所捕获的图像离线测量主动脉大小。在Ang II输注后每周进行两次测量，并且在Ang II输注(用于对照)前进行两次测量。AAA定义为腹主动脉肿大至少50%并且稍后在实验端点处确认。还通过在收获时直接检查腹主动脉或对那些死于突然破裂的动物进行尸体检查来评价此模型的AAA发生率。
[0105]使用组织学和生物化学分析(例如MMP酶谱法)来评价FA针对AAA的保护的有效性。将进行所收获主动脉的切片的组织学分析以使腹主动脉的细节可视化。组织固定于甲醒中，包埋于石腊中，并且以5 μ m切片。执行标准H&E染色、梅森三色(Mason’s trichrome)染色和VVG染色。
[0106]MMP活性的增加是AAA产生的标志之一。因此，MMP活性可使用其它研究中所详细描述的酶谱法技术测量。简单来说，将主动脉裂解物加载到输注明胶的SDS-PAGE凝胶上。在电泳后，通过在37°C下将凝胶培育过夜通过所加载样品中的MMP消化凝胶中的明胶。然后利用标准考马斯蓝(Coomassie blue)染色使裂解带可视化。
[0107]如先前所述使用HPLC系统测量H4B水平。简单来说，用三氯乙酸和DTT裂解主动脉样品，使其经受酸性或碱性氧化，且在HPLC系统(岛津(Shimadzu))中分离后利用荧光检测器检测H4B和其氧化物质。
[0108]通过在存在或不存在L-NAME时使用电子自旋共振(ESR，来自布鲁克(Bruker))测量超氧化物产生来评价裂解的主动脉样品中eNOS的功能状态。在其中eNOS偶联的正常条件下，添加eNOS抑制剂L-NAME将增加超氧化物产生量，因为eNOS通常产生NO来清除超氧化物。然而，在其中eNOS正在产生超氧化物的eNOS解偶联条件下，添加L-NAME将降低超氧化物产生量。超氧化物产生量的这种变化方向将允许对eNOS在动物主动脉中的功能进行精确评价。
[0109]实例3:作为hph-Ι小鼠和apoE缺失小鼠的AAA牛物标记物的循环H1B水平
[0110]本实例证明H4B水平可用作AAA生物标记物。在此研究中，对hph_l小鼠和输注Ang II的apoE缺失小鼠的另一确定的AAA模型两者进行了研究。在apoE缺失小鼠中，使用HPLC测量的H4B显示在主动脉中，H4B水平随着Ang II输注而降低(4.86±0.32到2.72±0.26pmol/mg，各自为 η = 6)，并且随着经口投与 FA 而增加(6.60±0.62pmol/mg，η=6)。当从血浆测量 H4B 时，观察到类似趋势(3.31±0.13、1.87±0.11、5.80±0.30pmol/mg，分别对应于媒剂、Ang I1、FA，各自为η = 6)。同样在hph_l小鼠中，H4B的主动脉水平显现为 1.87±0.25,0.99±0.11,3.00±0.64，且血浆水平为 1.37±0.05,0.92±0.06 和
2.36 + 0.25pmol/mg(分别对于媒剂、Ang II和AngII/FA，各自为η = 3)。更完全且更新的数据呈现于图9Α-Β和11中。
[0111]此外，对于apoE缺失小鼠以及对于hph-Ι来说，血浆与主动脉H4B水平之间的线性相关显示0.86的R2，表明两次测量之间的线性关系。此两次测量之间的线性关系极其重要，因为这将允许测量局部血管H4B生物利用性的较小侵袭性方法，相信这对于预测AAA产生必不可少。更完全且更新的数据呈现于图10A-B中。
[0112]这些数据指示降低的H4B生物利用性与AAA形成相关，而恢复的H4B生物利用性与AAA产生的阻止相关。此外，主动脉H4B值的变化在血浆中得到反映。总之，这些数据表明循环H4B水平可用作AAA产生的生物标记物以及治疗功效的预测物。
[0113]实验设计:
[0114]从输注Ang II的apoE缺失动物和hph_l动物收集血液样品。每周从每只动物的尾静脉收集约0.1mL血液。如上文所概述使用HPLC来测定血液样品中H4B的浓度。
[0115]还研究了如上文所用的FA补充是否改进H4B在循环和血管组织两者中的可利用性。利用补充FA的饮食治疗输注Ang II的apoE缺失小鼠或hph-Ι小鼠，并于I周、2周、3周和4周的不同时间点使用HPLC测定循环和主动脉H4B含量。使这些数据与AAA的产生相关以检查作为生物标记物的H4B的实际改进是如何与AAA的阻止关联的。确定了输注AngII的apoE缺失小鼠产生AAA需要3_4周，且在这些时间点，循环和组织H4B水平实际上降低，但通过FA治疗得到恢复(图9-10)。
[0116]实例4:经口投与叶酸恢复输注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能和主动脉NO生物利用性
[0117]本实例证明FA在恢复eNOS功能方面高度有效。向小鼠输注Ang II达4周(η =6),而在Ang II输注前2天且在整个研究期内用叶酸以15mg/kg/天经口治疗平行组(η =6)。还包括一组未治疗的apoE缺失小鼠(η = 6)。在基线下，eNOS抑制剂L-NAME最低程度地减少超氧化物产生量，从而暗示eNOS的微小解偶联/功能障碍。Ang II输注显著地增加L-NAME敏感性超氧化物产生量，所述产生量可通过经口投与FA完全消除。总之，这些数据指示FA在通过恢复主动脉和循环H4B水平来恢复eNOS功能方面高度有效，如图9和10中所示，且通过这些机理，FA阻止输注Ang II的apoE缺失小鼠(广泛认可的经典AAA模型)形成AAA (图11)。图13 —致地证明通过FA治疗因恢复eNOS功能也显著地改进一氧化氮(NO)生物利用性。
[0118]表:动脉瘤在apoE缺失小鼠中的发生率
[0119]
【权利要求】
1.一种检测个体的腹主动脉瘤AAA或对AAA的易感性的方法，所述方法包含: (a)使来自所述个体的测试样品与能够测量所述测试样品中存在的四氢生物喋呤(H4B)的量的分析装置接触；和 (b)比较所述测试样品中存在的H4B的测得量与H4B的标准量； 其中所述测试样品中存在的H4B的量与所述标准物相比降低指示AAA或对AAA的易感性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析装置包含高效液相色谱HPLC柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析装置包含免疫分析试剂盒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品中存在的H4B的所述量与所述标准物相比降低20%指示AAA或对AAA的易感性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品中存在的H4B的所述量与所述标准物相比降低50%指示AAA或 对AAA的易感性。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含血清或全血。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含规定H4B与所述标准物相比降低的所述个体进行AAA的治疗。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗包含叶酸疗法。
9.一种监测个体的AAA的治疗功效的方法，所述方法包含: (a)使于第一时间点获得的来自所述个体的第一测试样品与能够测量所述测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的量的分析装置接触； (b)使于第二时间点获得的来自所述个体的第二测试样品与能够测量所述测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的量的分析装置接触； (c)比较所述第一和第二测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的测得量； 其中在所述第二时间点之前向所述个体投与治疗，且其中所述第二测试样品中存在的H4B的量与所述第一测试样品相比增加指示AAA的有效治疗。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述分析装置包含高效液相色谱HPLC柱。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述分析装置包含免疫分析试剂盒。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二测试样品中存在的H4B的所述量与所述第一测试样品相比增加20%指示AAA的有效治疗。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品包含血清或全血。
14.根据权利要求9所述的方法，其进一步包含规定H4B与所述标准物相比降低或增加的所述个体进行AAA的改良治疗。
15.—种评估个体的腹主动脉瘤AAA的严重程度或AAA的风险的方法，所述方法包含: (a)使来自所述个体的测试样品与能够测量所述测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的量的分析装置接触；和 (b)测量所述测试样品中存在的四氢生物喋呤H4B的所述量； (c)比较所述测试样品中存在的H4B的所述测得量与标准物中存在的H4B的测得量； 其中所述测试样品中存在的H4B的所述量与所述标准物相比降低的程度指示所述个体的AAA的严重程度或风险。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分析装置包含高效液相色谱HPLC柱。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分析装置包含免疫分析试剂盒。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述样品包含血清或全血。
19.根据权利要求15所述的方法，其进一步包含规定H4B与所述标准物相比降低的所述个体进行AAA的治 疗。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述测试样品中存在的H4B的所述量与所述标准物相比降低50%指示严重AAA。
【文档编号】G01N33/53GK103988080SQ201280060568
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2011年10月11日
【发明者】才华 申请人:加利福尼亚大学董事会