专利名称：利用线虫幼虫检测塑化剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测塑化剂的方法。
背景技术：
塑化剂为邻苯二甲酸酯同系物。包括DEHP、DINP、DN0P、DBP、DMP、DEP等6种邻苯二甲酸酯类塑化剂，2011年6月I日卫生部紧急发布公告，将邻苯二甲酸酯(也叫酞酸酯)类物质，列入食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单。而2012年年底被曝光的“酒鬼”酒塑化剂超标2. 6倍，引起人们关于塑化剂及对白酒特别是高档酒食品安全的恐慌和质疑。作为一种环境激素，塑化剂对人和动物会造成免疫力及生殖力下降。目前各国可容忍的60公斤成人每日摄取量范围为1. 2-8. 4毫克，一些研究表明塑化剂对幼儿的潜在危害会更大，表现出一定的发育毒性。邻苯类塑化剂用量巨大，使用范围广，污染面积和影响人数就都蔚为可观，目前邻苯二甲酸酯类可以说是全球分布最为广泛的一类人工合成环境污染物，在空气、水、土壤和灰尘中都可以检测到。邻苯二甲酸酯类在生物体重还有富集作用，水生生物体内有明显的该类化合物的残留物，最终人们通过食物和空气等途径暴露其中。关于塑化剂的检测尚无统一标准。常规化学检测和仪器分析中存在操作复杂，仪器依赖度大，成本高的不足。
发明内容
本发明为了解决解决常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题，提供了一种利用线虫幼虫检测塑化剂的方法。利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下—、称取1. Og胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液称取13. 6g KH2PO4U. 8g K0H，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、将15 20g 琼脂粉、2 3g 蛋白胨、O. 10 O. 12g CaCl2、0. 11 O. 13g MgSO4和2 3g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至IOOOml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌15 25min，然后降温至50 60°C，在无菌环境下加入O. 5 5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入培养皿中，在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为I X IO9个/mL 2 X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液O. 8 1. 2mL,于37°C培养8 12h，接入8 12条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率，虫幼虫死亡率> 10%，则表明待检测白酒含有塑化剂。本发明通过测定线虫L2期幼虫死亡率，借助塑化剂对线虫L2期幼虫的特殊毒性鉴定白酒中是否含有塑化剂。适量酒精对线虫各阶段的发育没有影响，将微量白酒添加入线虫培养基中，如果此培养基上生长的线虫幼虫出现明显死亡，便可确定此类白酒还有塑化剂。本发明与传统的利用分析仪器鉴定白酒中塑化剂的方法相比，敏感度高，利用线虫胁迫响应特性，可以直观高效的确定白酒中是否含有塑化剂。本检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握。
图1是实验一至实验四中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，图中a表示实验一中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，b表示实验二中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，c表示实验三中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，d表示实验四中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，e表示实验五中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，f表示实验六中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，g表示实验七中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，h表示实验八中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，i表示实验九中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下—、称取1. Og胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液称取13. 6g KH2PO4U. 8g KOH，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、将15 20g 琼脂粉、2 3g 蛋白胨、O. 10 O. 12g CaCl2、0. 11 O. 13g MgSO4和2 3g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至IOOOml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌15 25min，然后降温至50 60°C，在无菌环境下加入O. 5 5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入培养皿中，在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为I X IO9个/mL 2 X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液O. 8 1. 2mL,于37°C培养8 12h，接入8 12条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率，线虫幼虫死亡率> 10%，则表明待检测白酒含有塑化剂。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中将16 19g琼脂粉、2g蛋白胨、O.1Og CaCl2、0· Ilg MgSO4和2g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中将15g琼脂粉、2g蛋白胨、O.1Og CaCl2、0· Ilg MgSO4和2g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中将20g琼脂粉、3g蛋白胨、0.12g CaCl2、0.13g MgSO4和3g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中降温至52 58 °C。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六:本实施方式与具体实施方式
一不同的是骤四中降温至55°C。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中在温度为20°C的无菌环境下干燥10h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中向线虫培养基中均匀涂入浓度为I X IO9个/mL 2 X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液lmL。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中于37°C培养IOh0其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中接入10条L2期的线虫幼虫。其它与具体实施方式
一相同。实验一:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中不加入任何其他物质，本实验中12h时幼虫死亡率为零，S卩无虫子死亡，为正常线虫培养基中生长的线虫正常发育。实验二:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgS04、2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入5ml无水乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入不含包括塑化剂在内任何杂质的纯酒精，本实验中12h后幼虫死亡率为零，即无虫子死亡，在线虫培养基中生长的线虫正常发育。实验三:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取15g 琼脂粉、2g 蛋白胨、0.1Og CaCl2、0.1lg MgSO4,2g NaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌15 25min，然后降温至50 60°C，于超净工作台无菌环境下加入0.5ml无水乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得到线虫培养基；五、向制备好的线虫培养基中均勻涂入浓度为I X IO9个/mL个/mL大肠杆菌0P50菌液0.8mL，37°C培养8h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入不含包括塑化剂在内任何杂质的纯酒精，本实验中12h后幼虫死亡率为零，即无虫子死亡，线虫培养基中生长的线虫正常发育。实验四:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL，调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入5mL质量浓度为53%的乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入不含塑化剂的乙醇质量浓度为53%的白酒，本实验中12h后幼虫死亡率为零，即无虫子死亡，为线虫培养基中生长的线虫正常发育。实验五:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至IOOOml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入5mL质量浓度为42%的乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入乙醇质量浓度为42%的白酒，本实验中12h后幼虫死亡率为零，即无虫子死亡，线虫培养基生长的线虫正常发育。实验六:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入ImL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.lmg/L的42%乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入塑化剂含量为0.lmg/L、乙醇质量浓度为42%的白酒，本本实验中12h后幼虫死亡率显著高于正常线虫培养基中生长的线虫的死亡率。实验七:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入ImL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.2mg/L、质量浓度为42%的乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入塑化剂含量为0.2mg/L、乙醇的质量浓度为42%的白酒，本实验中12h后幼虫死亡率显著高于正常培养基中生长的线虫的死亡率。实验八:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:—、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g KOH，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至IOOOml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入ImL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.3mg/L、乙醇的质量浓度为42%的乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.3mg/L、乙醇的质量浓度为42%的白酒，本实验中12h后幼虫死亡率显著高于正常线虫培养基中生长的线虫的死亡率。实验九:利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下:一、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g Κ0Η，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ;三、称取18g琼脂粉、2.5g 蛋白胨、0.1lg CaCl2、0.12g MgSO4,2.5gNaCl、于 IOOOmL烧杯，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml ；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌20min，然后降温至55°C，于超净工作台无菌环境下加入5mL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.lmg/L、乙醇质量浓度为42%的乙醇，在超净工作台无菌环境下将混合物倒入培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2X109个/mL大肠杆菌0P50菌液ImL，于37°C培养10h，接入10条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率。本实验步骤四中加入大量的含塑化剂的42%白酒，本实验中12h后幼虫死亡率显著高于正常线虫培养基中生长的线虫的死亡率。
权利要求
1.利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下: 一、称取1.0g胆固醇,溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液； 二、配制磷酸盐缓冲液:称取13.6g KH2PO4U.8g KOH，加蒸馏水定容至IOOmL,调节pH值为6.0 ; 三、将15 20g 琼脂粉、2 3g 蛋白胨、0.10 0.12g CaCl2、0.11 0.13g MgSO4 和2 3g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中，加入Iml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至IOOOml ； 四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120°C灭菌15 25min，然后降温至50 60°C，在无菌环境下加入0.5 5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入培养皿中，在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得线虫培养基； 五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为IX IO9个/mL 2X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液0.8 1.2mL，于37°C培养8 12h，接入8 12条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率，线虫幼虫死亡率> 10%，则表明待检测白酒含有塑化剂。
2.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤二中将16 19g琼脂粉、2g蛋白胨、0.1Og CaCl2、0.Ilg MgSO4和2g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。
3.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤二中将15g琼脂粉、2g蛋白胨、0.1Og CaCl2、0.Ilg MgSO4和2g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。
4.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤二中将20g琼脂粉、3g蛋白胨、0.12g CaCl2、0.13g MgSO4和3g NaCl加入到IOOOmL的烧杯中。`
5.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤四中降温至52 58。。。
6.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤四中降温至55。。。
7.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤四中在温度为20°C的无菌环境下干燥10h。
8.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤五中向线虫培养基中均匀涂入浓度为I X IO9个/mL 2 X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液lmL。
9.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤五中于37°C培养I Oh。
10.根据权利要求1所述利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，其特征在于步骤五中接入10条L2期的线虫幼虫。
全文摘要
利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，它涉及一种鉴定塑化剂的方法。本发明解决了常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题。本方法如下一、配制胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液；三、制备线虫培养基；四、向线虫培养基中均匀涂入大肠杆菌OP50菌液，于37℃培养8～12h，接入8～12条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率，线虫幼虫死亡率＞10％，则表明待检测白酒含有塑化剂。本检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握。
文档编号G01N33/50GK103076445SQ20131000241
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者王云彪, 邓茗芩, 徐镜波 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所