一种聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti⁴⁺纳米材料的合成方法及其应用的制作方法

专利名称：一种聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti⁴⁺ 纳米材料的合成方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种用于高通量MALD1-T0FMS富集磷酸化肽聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法及其运用。
背景技术：
蛋白质的可逆磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，它调节着如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动，也被形象地描述为细胞生理活动的分子开关。因此，对蛋白质磷酸化的研究有助于全面理解蛋白质的各项功能及其机理。现今，蛋白质磷酸化的研究方法是先将蛋白质酶解，而后利用生物质谱对磷酸化肽段的氨基酸序列和磷酸化位点进行准确地鉴定。但磷酸化蛋白质的含量较低，磷酸化肽段的离子化效率较差，且非磷酸化肽段的存在将严重抑制磷酸化肽段的质谱信号，这些原因导致利用质谱直接对磷酸化肽段进行准确分析面临很大困难。因此在质谱分析前需对磷酸化肽段进行选择性富集，而发展新型的富集技术成为当前蛋白组学研究的热点。为了解决这些问题，很多材料和富集技术被用来富集磷酸化肽。其中金属离子吸附色谱得到了广泛应用。金属离子吸附色谱是通过亚氨基二乙酸、磷酸基或氨三乙酸的酸螯合配位将金属离子如Ti4+、Fe3+等固定在不同的底物如聚合物、介孔材料或纳米材料上。然而传统的金属离子吸附色谱技术在样品制备时常需要高速离心，这不仅费时不便，而且会导致低丰度磷酸化肽的损失。为了发现具有重要生物学意义的磷酸化蛋白和磷酸化肽，迫切需要制定出高灵敏度和高选择性的富集方法进行磷酸化蛋白质组学的深入分析。近来，磁性纳米材料基于自身磁性已应用于生物医学中的多个领域，而功能化磁球作为一种新型的分析技术已在蛋白质组学研究中得到广泛的应用，这种材料操作简便，分离时只需外加一磁场即可。多巴胺是3，4- 二羟基-L-苯丙氨酸的类似物，它可以粘附在许多无机和有机材料包括贵金属、金属、金属氧化物、云母、石英、陶瓷甚至聚合物上并自组装聚合成聚多巴胺。这种聚多巴胺具有优良的环境稳定性、良好的生物相容性和特别是在水中的优良分散性。因此，发展一种以聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料来富集磷酸化肽是一种新的需求。

发明内容
本发明的目的在于提供一种表面由聚多巴胺修饰的磁球并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法及其在磷酸化蛋白质组学的应用。本发明提供了一种表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的合成方法，具体步骤如下:
(1)将磁球分散至多巴胺水溶液中，并使其分散均匀；
(2)在持续机械搅拌下，在步骤(I)所得的产物中快速加入三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液在室温下机械搅拌反应10-16小时；
(4)将步骤(3)所得的产物用去离子水充分洗涤，除去产物表面的杂质与多巴胺单
体；
(5)将步骤(4)中所得产物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室温下机械搅拌2-3小时；
(6)将步骤(5)所得的产物用去离子水充分洗涤，并在真空干燥器中干燥，即得所述纳米材料。本发明中，步骤(I)中磁球与多巴胺水溶液的质量比为1:4。本发明中，步骤(2)中的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为10 mmol/L，pH为
8.0-9.0 ο本发明在质谱检测中的应用，具体步骤为:将纳米材料分散到200 μ L含有磷酸化肽、0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈的离心管中，37 °C富集30min，之后用含0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；然后用5 μ L 0.4 M氨水洗脱10 min，取0.5 μ L洗脱液点靶，进行质谱分析。本发明中，表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料对磷酸化肽段选择性富集的应用。本发明的有益效果在于:所提供的聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法简单，具有良好的生物相容性、热稳定性、高敏感度以及在水中的“溶解”性，可选择性富集磷酸化肽。该材料Ti4+固定方式简单，具有优秀的环境稳定性和生物相容性，在水中分散性好。其合成方法简单、成本低，在磷酸化蛋白质组学MALDI分析中具有灵敏度闻、 目噪比闻等特点。


图1为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+扫描电子显微镜照片；
图2为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+透射电子显微镜照片；
图3为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料元素分析 图4为磁球(a)和聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料(b)在水中分散性的照片说明；` 图5为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料XRD 图6为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集β -casein中的磷酸化肽的质谱 图7为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集混合蛋白(非磷酸化蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 500:1)中的磷酸化肽的质谱 图8为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集磷酸化肽段检测限(2fmol)的质谱 图9为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集人血清中磷酸化肽段(*代表磷酸化肽)。其中，*代表磷酸化肽。
具体实施例方式下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。实施例1
聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料的合成:
(1)将10mg磁球分散至浓度为lmg/mL的40 mL多巴胺水溶液中，并使其分散均勻；
(2)在持续机械搅拌的条件下，在步骤(I)所得的产物中快速加入10mL浓度为10mmol/L (pH为8.5)的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液在室温下机械搅拌反应10-16小时；
(4)将步骤(3)所得的产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质与多巴胺单
体；
(5)将步骤(4)中所得产物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室温下机械搅拌
2-3小时；
(6)将步骤(5)所得的产物用去离子水洗涤三次，并在真空干燥器中干燥，即得所
需广品。所得的聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料的扫描电子显微镜照片(20 KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图1所示，透射电子显微镜照片(200KV，日本株式会社2011显微镜，日本)如图2所示，元素分析图如图3所示，XRD图(200KV，日本株式会社2011显微镜，日本)如图5所示。磁球(左)和聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料(右)在水中分散性的照片说明如图4所示(左为磁球，右为聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料)。从图4可以看出，本发明合成的聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料在水中的“溶解性”和分散性好。实施例2
聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料在富集β-casein中的磷酸化肽的应用:
(I)试样的准备:β -casein 在 25mmol/L NH4HCO3 溶液中 37 °C酶解 16 h。(2)富集:10 uL, 2 mg/mL纳米材料分散到200 μ L含有步骤(I)的磷酸化肽的0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈离心管中，37°C富集30 min ;用0.1%(体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈的缓冲液洗涤并磁性分离3次；5 μ L 0.4 M氨水洗脱10 min。(3)质谱分析:取0.5 UL步骤(2)所得的洗脱液点靶，进行质谱分析，质谱图如图6所示，图8是聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集β -casein中的磷酸化肽段检测限(2 fmol)。实施例3
聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料在富集混合蛋白中的磷酸化肽的应
用
(I)试样的准备:牛血清白蛋白(BSA)先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37 °C酶解16 h。β -casein在25mM NH4HCO3溶液中37°C酶解16 h。将牛血清白蛋白(BSA)和β-casein以摩尔比500:1加到含有0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)
乙腈离心管中。
(2)富集:10 yL, 2 mg/mL实施例1所得的纳米材料分散到200 μ L含有步骤(I)的磷酸化肽的0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈离心管中，37°C富集30min ;用0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈的缓冲液洗涤并磁性分离3次；5 μ L 0.4 M 氨水洗脱 10 min。(3)质谱分析:取0.5 UL步骤(2)所得的洗脱液点靶，进行质谱分析，图7是聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料富集混合蛋白(非磷酸蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 500:1)中的磷酸化肽的质谱图。实施例4
聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的纳米材料在富集人血清中的磷酸化肽的应用
(I)试样的准备:人血清用去离子水稀释10倍。(2)富集:10 uL, 2 mg/mL纳米材料分散到200 μ L含有步骤(I)的磷酸化肽的0.1% (体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈离心管中，37°C富集30min ;用0.1%(体积比)三氟乙酸和50% (体积比)乙腈的缓冲液洗涤并磁性分离3次；5 μ L 0.4 M氨水洗脱10 min。(3)质谱分析:取0.5 UL步骤(2)所得的洗脱液点靶，进行质谱分析，质谱图如图9所示。
权利要求
1.一种表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的合成方法，其特征在于具体步骤如下: (1)将磁球分散至多巴胺水溶液中，并使其分散均匀； (2)在持续机械搅拌下，在步骤(I)所得的产物中快速加入三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液； (3)将步骤(2)所得溶液在室温下机械搅拌反应10-16小时； (4)将步骤(3)所得的产物用去离子水充分洗涤，除去产物表面的杂质与多巴胺单体； (5)将步骤(4)中所得产物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室温下机械搅拌2-3小时； (6)将步骤(5)所得的产物用去离子水充分洗涤，并在真空干燥器中干燥，即得所述纳米材料。
2.根据权利要求1所述的一种表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法，其特征在于步骤(I)中所述磁球与多巴胺水溶液的质量比为1:4。
3.根据权利要求1所述的一种表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法，其特征在于步骤(2)中所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为10 mmol/L, pH 为 8.0-9.0。
4.一种如权利要求1所述合成方法得到的表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料在质谱检测中的应用，其特征在于具体步骤为:将纳米材料分散到200 μ L含有磷酸化肽、0.1%体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的离心管中，37 ° C富集30 min，之后用含0.1%体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；然后用5μ L 0.4 M氨水洗脱10 min，取0.5 μ L洗脱液点靶，进行质谱分析。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述表面由聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+纳米材料对磷酸化肽段选择性富集的应用。
全文摘要
本发明涉及一种聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的磁性纳米材料的合成和应用。将磁球分散到含多巴胺的水溶液中，在机械搅拌的条件下将三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液快速加入磁球分散均匀的多巴胺水溶液中，在室温下机械搅拌10-16小时，水洗并磁性分离得到在水中分散性好的表面由聚多巴胺修饰的磁球纳米材料。然后将该材料分散到100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，室温下机械搅拌2-3小时，水洗并磁性分离得到聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+的磁性纳米材料。本发明固定Ti4+方法非常简单；表面修饰一层聚多巴胺，使该材料具有优秀的环境稳定性和生物相容性，并且在水中分散性好；该材料可以固定大量的Ti4+；以磁球为核心，使得该材料应用起来操作简单，可进行磁性分离；合成方法简单、成本低，可在高通量MALDI-TOFMS富集磷酸化肽。
文档编号G01N27/62GK103151135SQ20131004435
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者邓春晖, 闫迎华, 卜静, 王先颖, 王梦依, 孙念荣, 熊娅 申请人:复旦大学