专利名称：一种快速测定奶制品中三聚氰胺的方法
技术领域：
本发明专利公开了一种简单、快速、灵敏、准确检测奶制品中三聚氰胺的方法，采用紫外分光光度计进行测定。属于食品质量检测。
背景技术：
三聚氰胺(含氮量66%)与蛋白质(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子，因此被一些造假者利用，添加在奶制品中以造成产品中蛋白质含量较高的假象。然而，三聚氰胺能导致肾脏中的不溶性三聚氰胺一三聚氰酸结合晶体的形成，从而导致肾功能衰竭。2008年9月，中国发生了骇人听闻的含三聚氰胺的婴幼儿问题奶粉事件，被三聚氰胺污染的奶粉，导致上万的婴幼儿患肾结石病住院，甚至有数名死亡。为了确保食品供应三聚氰胺不受掺假，一些国家和组织已采取积极措施，例如增加进口乳源配料和成品的取样和测试。2008年11月，美国FDA将婴幼儿配方奶粉中的三聚氰胺的限量值设定在lmg/kg。2008年12月，世卫组织专家会议规定了婴儿配方奶粉中的三聚氰胺含量为1.0mg/kg。与此同时，中国发布了测定原料乳与乳制品中三聚氰胺的三项国家标准方法:高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱/质谱法，检出限分别为2mg/kg、0.0 lmg/kg和0.05mg/kg
(中华人民共和国国家标准GB/T 22388-2008，原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，2008-10-07发布)，及一项原料奶和液态奶中三聚氰胺的快速测定的国家标准方法，检出限为50g/kg(中华人民共和国国家标准GB/T 22400-2008，原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，2008-10-15发布)。2011年，我国公布三聚氰胺在食品中的限量值规定:婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为lmg/kg，其他普通食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg (卫生部公告2011年第10号)。2012年7月，食品法典委员会第35届会议审查制定了婴儿配方奶粉中的三聚氰胺限量为0.15 mg/kg。四项国家标准方法均使用了色谱技术或色谱-质谱联用技术，需要专属的仪器且成本昂贵，不能适用于一般实验室及现场的快速、简便、廉价检测的需求。此外，由于奶制品中存在复杂的基质，上述方法通常耗时或需要用有机溶剂对样品进行预处理，如萃取。导数分光光度法、标准添加法和H-点标准加入法(HPSAM)是几种不需事先分离就能测定复杂样品中的化合物的方法。与直接吸收光谱法相比，导数光谱法能够提高分辨率、提供更明确的指纹特征、辨别由混池或非特异性基质的 吸收所产生的宽带干扰(F.Sanchez Rojas, C.BoschOjeda, Recent development in derivative ultraviolet/visible absorptionspectrophotometry: 2004 - 2008.Analytica Chimica Acta, 2009, 635, 22-44.)。导数分光光度法在解决两个重叠的光谱和消除基质的干扰时，常使用零交点技术。但有些时候却没有合适的零交点存在。标准加入法能消除样品基质产生的误差，当标准和样品存在如离子强度、盐度、粘度等方面不同的性质，或者其它类型的杂质和干扰时，该法特别有用(Bader，M.Asystematic approach to standard addition methods in instrumental analysis.J.Chem.Educ.1980，57，703-706)。但该方法不能消除样品中的其他组分的恒定光谱干扰。它要求线性方程通过坐标原点，即空白溶液的吸光度应为零。1988 年，Bosch-Reig 和 Campins-Falco 建立了 HPSAM。它可以将由共存干扰物和空白试剂产生的不可校正的恒定系统误差转变为可校正误差，然后加以校正和消除(Habibollah Eskandar1.H-point standard addition method—First derivativespectrophotometry for simultaneous determination of palladium and cobalt.Spectrochimica Acta Part A, 2006, 63，391-397.)。最初的 HPSAM 是基于双波长分光光度法和标准加入法的结合，在两个波长下构造两条标准加入曲线。后来HPSAM发展到使用两个不同的反应时间来构造两条标准加入曲线(J.Zolgharnein, H.Abdollahi, D.Jaefarifar, G.H.Azim1.Simultaneous determination of Fe (II) and Fe (III) bykinetic spectrophotometric H-point standard addition method.Talanta, 2002,57，1067-1073.)。构造两条标准加入曲线的两个波长或反应时间需满足:共存组分(或试剂空白)在这两个波长处或反应时间的吸收相同。无法满足这个条件时就不能应用HPSAM。
发明内容
本发明首先对HPSAM进行了改进:使用化学反应浓度变量，而不是波长或反应时间，来构建两个标准HPSAM加入曲线。在此基础上，针对现有三聚氰胺的检测方法存在的耗时长、操作繁琐、成本昂贵等问题，结合在盐酸中使用硅胶沉淀离心除去样品基质的简单前处理，建立了一种简单、快速、灵敏、准确检测奶制品中三聚氰胺的方法。本发明的方法由下列技术方案组成:样品经过在较浓的酸性条件下，采用硅胶沉淀，离心除去蛋白质等基质的前处理，所得上清液分别在两个酸浓度下加入一系列三聚氰胺标准溶液，用紫外分光光度计测定一阶导数光谱，以229nm处的dA/d λ峰值与242nm处的dA/cU谷值间的差值相对于加入的三聚氰胺浓度作图，得两条H-点标准加入曲线，由H-点可求得样品中的三聚氰胺含量。该方法的具体实施步骤如下:0.54g奶粉和21ml蒸馏水加入到试管中，在超声波水浴中超声处理5min使其充分溶解(或用16.5ml蒸懼水稀释4.5ml的液态奶),然后加入9ml盐酸(5mol/l)和1.8g娃胶。将该混合物润流混合Imin,然后在4000rpm下离心3min。取所得到的上清液适量，加入盐酸(5mol/l)和三聚氰胺的标准溶液，并用蒸馏水将该混合物稀释至5ml。以水为参比，记录溶液的一阶导数紫外光谱图，测定229nm处的dA/cU峰值与242nm处的dA/d λ谷值间的差值，即Δ dA/d λ。分别以在0.75 mol/1和2.5mol/l盐酸测量浓度下的Λ dA/d λ对加入的三聚氰胺浓度作图，构建两个标准加入曲线。并由两个标准加入曲线的交叉点确定样品中的三聚氰胺的含量。对未加入三聚氰胺的奶液用该方法平行测定三次，得到检测限为0.008Pg/ml，对应的奶液浓度为0.009g/ml,相当于在奶粉中的检测限为0.89mg/kgo
图1为用H-点标准加入法测定品牌1#奶粉中的三聚氰胺 图2为用H-点标准加入法测定品牌2#奶粉中的三聚氰胺 图3为用H-点标准加入法测定品牌3#液态奶中的三聚氰胺图； 具体实施例子
实施实例1:品牌1#奶粉
0.54g奶粉和21ml蒸馏水加入到试管中，在超声波水浴中超声处理5min使其充分溶解。然后加入9ml盐酸(5mol/l)和1.8g硅胶，将该混合物涡流混合lmin，然后在4000rpm下离心3min，得到上清液。取8支试管，分两组编号，每管各加入2.5ml上清液，然后第一组4支各加入1.75ml盐酸(5mol/l)，第二组4支不加盐酸。两组的I至4号管分别加入
0,0.25,0.5,0.75ml三聚氰胺(56.7Pg/ml)，并用蒸馏水定容至5ml。以水为参比，测定各管的一阶导数紫外图谱，测出229nm处的dA/d λ峰值与242nm处的dA/d λ谷值间的差值，即Λ dA/d λ，以加入的三聚氰胺浓度为横坐标，Λ dA/d λ为纵坐标作图得到测量的盐酸浓度分别为0.75和2.5mol/l下的两条标准加入曲线，其方程分别为:y=0.0125χ_0.0188，y=0.0183χ-0.0182。两条曲线的交点(H点)的横坐标为x=0.1034 (Pg/ml)，相当于在实际样品中的含量为11.48 mg/kg奶粉。回收率实验:0.54g奶粉、0.6ml三聚氰胺和20.4ml蒸馏水加入到试管中，在超声波水浴中超声处理5min使其充分溶解。然后加入9ml盐酸(5mol/l)和1.8g硅胶，将该混合物涡流混合lmin，然后在4000rpm下离心3min，得到上清液，该上清液中的三聚氰胺浓度为0.567Pg/ml。然后用上述的标准加入法得到两条曲线，在测量的盐酸浓度为0.75和
2.5mol/l下的方程分别为:y=0.0125χ_0.0127，y=0.0182χ_0.0089 ;并得到H点，该点的横坐标为x=0.6667 (Pg/ml)。则回收率为99.3%。见图1。另外两次回收率分别为97.8%、103.3%ο实施实例2:品牌2#奶粉
与品牌1#奶粉处理方式相同，在测量的盐酸浓度为0.75和2.5mol/l下的方程分别为:y=0.0126x-0.0202, y=0.0183χ_0.0201，则 H 点的横坐标为 χ=0.0175 (gg/ml)，相当于在实际样品中的含量为1.94mg/kg奶粉；回收率实验时，在测量的盐酸浓度为0.75和 2.5mol/l 下的方程分别为:y=0.0128x-0.0165，y=0.0182χ-0.0134, H 点的横坐标为χ=0.5741 (Pg/ml)，则回收率为 98.16%。见图 2。实施实例3:品牌3#液态奶
样品前处理部分为:用16.5ml蒸懼水稀释4.5ml的液态奶,然后加入9ml盐酸(5mol/I)和1.8g硅胶，将该混合物涡流混合lmin，然后在4000 rpm下离心3min，得到上清液。之后的部分与以上两种奶粉操作步骤相同。在测量的盐酸浓度为0.75和2.5mol/l下的方程分别为:y=0.0127x-0.0202，y=0.0186χ_0.02，则 H 点的横坐标为 χ=0.0338 (Pg/ml)，相当于在实际样品中的含量为3.75mg/kg奶粉；回收率实验时，在测量的盐酸浓度为
0.75 和 2.5mol/l 下的方程分别为:y=0.0127χ_0.014, y=0.0188χ-0.0103，H 点的横坐标为χ=0.6066 (Pg/ml)，则回收率为 101.0%。见图 3。
权利要求
1.一种快速测定奶制品中三聚氰胺的方法，包括样品的沉淀离心前处理、以及以一阶导数紫外吸收光谱测量值为分析信号的改进的H-点标准加入法，其特征在于整个方法不使用有机溶剂、显色剂，操作简便、快速、结果准确。
2.根据权利要求1所述的三聚氰胺的分析技术，其特征在于，所述的样品沉淀离心前处理是在较浓的酸性条件下采用薄层色谱用硅胶沉淀，离心除去蛋白质等基质。
3.根据权利要求1所述的三聚氰胺的分析技术，其特征在于，所述的改进的H-点标准加入法采用两个不同的测定酸度下的两条标准加入曲线之交点来确定H-点。
4.根据权利要求1和3所述的改进的H-点标准加入法，其特征在于，所述的标准加入曲线为在两个测定酸浓度下的分析信号(一阶导数紫外吸收光谱上229nm带的dA/cU峰值与242nm处的dA/d λ谷值间的差值)对添加的三聚氰胺标准溶液浓度制作所得的曲线。
5.根据权利要求1、3和4所述的改进的H-点标准加入法，其特征在于，由H-点求得样品中的三聚氰胺含量。
全文摘要
本发明公开了一种采用紫外分光光度计快速、简便、灵敏、准确检测奶粉中三聚氰胺的方法。针对现有检测奶粉中三聚氰胺方法存在的耗时长、操作繁琐、成本昂贵等问题，本发明采用硅胶在酸性水溶液中除去样品基质的前处理方法，结合一阶导数紫外吸收光谱-H点标准加入法，最终得到三聚氰胺的含量。该方法样品前处理简便快速，测量过程仅用到紫外分光光度计，以化学反应试剂浓度为变量，而不是波长或反应时间，来构建两条H点标准加入曲线。本方法检测限低、精密度好、回收率高，低成本。
文档编号G01N1/28GK103163101SQ201310080440
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者梁冰, 李从 申请人:四川大学