专利名称：采用非损伤取样判定褐马鸡雏鸡体质状况及分群饲养方法
技术领域：
本发明涉及一种判定褐马鸡雏鸡体质状况及饲养中育雏分群方法，特别涉及一种褐马鸡育雏方法。
背景技术：
褐马鸡(Crossoptilon mantchuricum)是中国特有的珍稀濒j危鸟类，国家一级保护动物。由于该物种生境破碎化、种群隔离，导致繁殖力退化、种群衰落，世界自然保护联盟(IUCN)、国际鸟类联盟(BirdLife)、公共事业振兴署(WPA)将其列为全球濒危物种，被濒危野生动植物国际贸易公约(CITES)列在附录I。检测和评估珍稀濒危物种的生存状态，并实施必要的人工管护，是保证饲养种群健康质量，放归野外长期存活和建立野生种群的关键环节，但目前这方面研究工作甚少。究其原因，首先，自由生活的雉鸡类动物灵活机警，活动范围广，栖息地隐蔽，想获取其组织样本十分困难；其次，雏鸡出生弱小，捕捉和采集血样品是很强的外界刺激，极易造成雏鸡人为死亡；再者，雏鸡发育成长至亚成体，无损伤的有效的长期的监测其身体健康变化的工作困难重重，严重影响了褐马鸡的育雏工作。显然，受到样品采集和测定等技术方面的制约，迄今未有野生雉鸡类雏鸡免疫生理的研究。雏鸡生长发育过程中免疫生理的变化是评价健康状况的重要途径。因此，作为免疫生理的重要指示指标，免疫球蛋白含量与变化的监测尤为重要。褐马鸡雏鸡免疫球蛋白含量变化的生理状况监测，传统的动物抽血取样方法已经无法适用，亟需探索发展一种简单、快速、非损伤的方法，用于判定褐马鸡雏鸡体质状况及饲养中育雏分群。
发明内容
本发明的目的是提供一种判定褐马鸡雏鸡体质状况及饲养中分群育雏的方法。本发明所提供的褐马鸡育雏方法，为将待育褐马鸡雏鸡按照粪便中免疫球蛋白A的含量不同进行分组隔离饲养。在所述方法中，所述褐马鸡雏鸡可为2 14日龄的褐马鸡。在本发明的一个实施例中，所述褐马鸡雏鸡具体为2 4日龄、7 9日龄或12 14日龄的褐马鸡。进一步，本发明所提供的褐马鸡育雏方法，可为如下(1) (3)中的任一种:(1)将2 4日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养:组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于834ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1133ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于834ng/g和1133ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡；(2)将7 9日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养:组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于1196ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1363ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；
组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于1196ng/g和1363ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡；(3)将12 14日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养:组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于1298ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1556ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡；组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于1298ng/g和1556ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡。在上述方法中，(I) (3)中的所述组A中的所述待育褐马鸡雏鸡均为健康状态不佳，极易发生死亡的雏鸡；所述组C中的所述待育褐马鸡雏鸡均为健康状态良好，不易于发生死亡的雏鸡；所述组B中的所述待育褐马鸡雏鸡为健康状态处于组A和组C之间的雏鸡。本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定褐马鸡雏鸡健康状态的试剂盒及其应用。本发明所提供的应用具体为用于定量检测鸡免疫球蛋白A的物质在制备以粪便(新鲜粪便)为待测样本鉴定或辅助鉴定褐马鸡雏鸡健康状态的试剂盒中的应用。在所述应用中，所述用于定量检测鸡免疫球蛋白A的物质可为鸡免疫球蛋白A特异性抗体或鸡免疫球蛋白A酶联免疫试剂盒。在本发明的一个实施例中，所述用于定量检测鸡免疫球蛋白A的物质为鸡免疫球蛋白A酶联免疫试剂盒，具体为美国Bethyl公司的鸡免疫球蛋白A酶联免疫试剂盒，其产品目录号为 E30-103，即 Chicken IgA ELISA Quantitation Set (E30-103, BethylLaboratories, USA)。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定褐马鸡雏鸡健康状态的试剂盒，包括包被抗体、酶标物和新鲜粪便收集工具；所述包被抗体为鸡免疫球蛋白A特异性抗体，所述酶标物为鸡免疫球蛋白A酶标抗体。所述新鲜粪便收集工具可为一次性手套、镊子、可开盖的小型密闭塑料盒、玻璃制收集瓶、自封袋等。所述试剂盒还包括如下中的至少一种:鸡免疫球蛋白A标准品溶液、鸡免疫球蛋白提取液、底物显色液、终止液、洗涤液、包被缓冲液和封闭液。在所述试剂盒中，所述鸡免疫球蛋白A标准品溶液可以是一定浓度范围内的多种浓度的标准溶液，例如可以在O 1000ng/mL之间，如浓度分别为1000.00ng/mL、500.0Ong/mL、250.00ng/mL>125.00ng/mL、62.50ng/mL、31.25ng/mL>15.60ng/mLo
在所述试剂盒中，所述鸡免疫球蛋白提取液为pH7.2，含有吐温20的0.0lM的磷酸盐缓冲液；所述吐温20在所述鸡免疫球蛋白提取液中的体积百分含量为0.05%。所述
0.0lM的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NaC18.50g/L、Na2HP042.20g/L和KH2PO40.30g/L。在所述试剂盒中，所述底物显色液、所述终止液、所述洗涤液、所述包被缓冲液和所述封闭液为本领域常用的酶联免疫试剂。 在所述试剂盒的使用中，将待测褐马鸡雏鸡的粪便(新鲜粪便)与所述鸡免疫球蛋白提取液按照Ig =IOmL的比例充分混合，得到混合物；将混合物离心，取上清液，使用酶联免疫吸附法对所述上清液进行免疫球蛋白A的定量检测，进一步计算出单位重量的粪便中免疫球蛋白A的含量。本发明的另一个目的是提供以上所述试剂盒的制备方法。所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下(I)或(2)的步骤:(I)将所述包被抗体、所述酶标物和所述新鲜粪便收集工具分别单独包装的步骤；(2)将所述包被抗体、所述酶标物、所述新鲜粪便收集工具和如下中的至少一种分别单独包装的步骤:所述鸡免疫球蛋白A标准品溶液、所述鸡免疫球蛋白提取液、所述底物显色液、所述终止液、所述洗涤液、所述包被缓冲液和所述封闭液。以上所有的 所述雏鸡均可为I 33日龄的褐马鸡；如2 4日龄、7 9日龄，12 14日龄；再如3日龄、8日龄、13日龄、18日龄或33日龄。以上所有的所述褐马鸡雏鸡健康状态，在本发明中，均具体体现在死亡率或存活率这一指标上。在本发明中，死亡率高于70%，视为健康状态差；死亡率低于35%，视为健康状态良好。实验证明，通过监测粪便免疫球蛋白A的含量和变化评价褐马鸡雏鸡健康状态是理想的非损伤方法，将其运用到褐马鸡的育雏过程中，按照待育雏鸡粪便中免疫球蛋白A的含量把雏鸡进行分组隔离饲养，结果显示与随机分组的对照组相比，对于整个雏鸡群体而言，这种饲养方式大大降低了雏鸡的死亡率。本发明对于中国特有濒危物种褐马鸡的保护及人工繁育极其重要意义。
图1为鸡免疫球蛋白A标准曲线。图2为各日龄褐马鸡雏鸡的FA平均值。图3为褐马鸡雏鸡死亡个体粪便IgA (DFA)含量与存活个体粪便IgA (SFA)含量的垂直散点图。图4为褐马鸡雏鸡DFA含量与SFA含量的柱状图，其中*为显著差异(P < 0.05)，**为极显著差异(P < 0.01)。图5为通过Euclidean距离系统聚类分析3日龄褐马鸡雏鸡FA含量。其中，I 14号为存活个体，15 30号为死亡个体。图中上部分19个体为高死亡(HM)组，其余11个体为低死亡(LM)组。图6为通过Euclidean距离系统聚类分析8日龄褐马鸡雏鸡FA含量。其中，I 14号为存活个体，15 30号为死亡个体。图中上部分12个体为HM组，其余18个体为LM组。图7为通过Euclidean距离系统聚类分析13日龄褐马鸡雏鸡FA含量。其中，I 14号为存活个体，15 30号为死亡个体。图中上部分18个体为LM组，其余12个体为HM组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、以粪便为待测样本鉴定褐马鸡雏鸡健康状态临界IgA含量的测定一、待测褐马鸡雏鸡分组及饲养以2011年5月 9月庞泉沟自然保护区人工孵化的褐马鸡雏鸡为研究对象。5月24日 6月12日间，来自野外9个窝的103枚卵孵化出雏鸡93只，孵化率90%。IgA含量的测定研究选取5月29日孵化出生的雏鸡30只，来自3个窝，分别编为A组(14只)、B组(7只)、C组(9只)。雏鸡2日龄时，进行彩色钢环标识，钢环重0.Sg,此后每30天更换I次。雏鸡I 35日龄，保护区饲养的母鸡带雏，以窝为单位，分别饲养在雏鸡饲养室，提供充足的雏鸡饲料及相同的室温。每日10:00 15:00，A-C组雏鸡集中在室外60m2饲养笼内。雏鸡35日龄后,全部放入饲养笼进行饲养。二、粪样的采集2011年5月31日 9月I日，采用非损伤技术的方法，用一次性手套、镊子采集30只彩环标识的褐马鸡雏鸡新鲜粪便(粪便采集重量> 0.5g)。雏鸡2 35日龄阶段，样品采集使用室内焦点观察个体，一对一采集新鲜粪便。雏鸡35日龄后，饲养笼活面积大范围广，使用望远镜远距离焦点观察，待目标个体排粪后，定位采集新鲜粪样。以窝为单位采集褐马鸡雏鸡新鲜粪便，时间选择上午8:00 12:00，采集后粪样装入收集瓶，标记日期、个体编号，并立刻放入移动冰箱，每日工作结束后于专用冰柜_20°C保存。采集以5天为一个周期，60日龄后因天气原因，周期所有延长。研究采集了 18个周期，共采集到新鲜粪便样品338份。三、粪样的提取鸡免疫球蛋白提取液:含有0.05%吐温20 (体积百分含量)的0.0lM的磷酸盐缓冲液，PH7.2 ;所述0.0lM的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NaC18.5g/L、Na2HP042.2g/L 和 KH2PO40.3g/L。提取褐马鸡雏鸡粪样中免疫球蛋白:取0.5g鲜粪置于IOml离心管中，加入5ml鸡免疫球蛋白提取液，涡旋仪器旋转萃取10min，2000r/min离心20min，取上清液Iml于
1.5ml离心管内，再次10000r/min离心20min,取上清液于1.5ml离心管内，_20°C保存,待测。四、粪样IgA的测定酶联免疫吸附法定量测定上述步骤三所得待测上清液中免疫球蛋白A (IgA)的含量，从而计算出单位重量粪便中IgA的含量。使用Chicken IgA ELISA Quantitation Set(E30-103, Bethyl Laboratories, USA)和 ELISA Starter Accessory Kit (E101, BethylLaboratories, USA),根据供应商提供手册制备ELISA检测板，通过酶标仪(MultiskanMK3, Thermo Scientific, USA)在450nm光波下测定上述步骤三所得待测上清液中IgA的含量。具体操作如下:(I)包被抗体:向酶标板(Maxisorp`, Nunc, Denmark)每孔中加入 100 μ I IgA包被抗体(Α30-103Α, Bethyl Laboratories, USA)溶液(用包被缓冲液(E107, BethylLaboratories, USA)按照体积比1:100进行稀释，pH9.6),孵育Ih0(2)洗漆:使用洗板机(Wellwash 4 MK2,Thermo Scientific,USA)室温下每孔加Λ 400 μ I 洗液(Ε106, Bethyl Laboratories, USA)进行洗漆，共洗 5 次,拍干。(3)封闭:每孔加入 200 μ I 封闭缓冲液(E104, Bethyl Laboratories, USA),孵育30mino(4)洗涤:同步骤(2)。(5)标准品稀释与加样:向每孔中加入鸡IgA血清标准品(RS10-102，BethylLaboratories, USA)梯度稀释液(浓度依次为 1000.00ng/mL、500.00ng/mL、250.00ng/mL、125.00ng/mL、62.50ng/mL、31.25ng/mL、15.60ng/mL，用加入体积分数 0.05% 的吐温 20 的E106洗液(Bethyl Laboratories, USA)进行稀释)或上述步骤三所得待测上清液，每孔100 μ 1，孵育 Ih0(6)洗涤:同步骤(2)。(7)加酶标抗体:每孔加入100 μ I的IgA酶标抗体(Α30-103Ρ，BethylLaboratories, USA)稀释液(用加入体积分数0.05%的吐温20的E106洗液(BethylLaboratories, USA)进行稀释，稀释比例为1:100000)，孵育lh。(8)洗涤:同步骤(2)。(9)显色:每孔加入 100 μ I 酶底物(Ε102, Bethyl Laboratories, USA),避光孵育15min,显色后溶液颜色为蓝色。(10)终止:每孔加入 100 μ I 的终止液(El 15, Bethyl Laboratories, USA),终止反应，此时蓝色变为黄色。 (11)测定:用空白对照孔(空白对照孔不经过步骤(5)和步骤(7))调零，使用酶标仪(Multiskan MK3, Thermo Scientific, USA)在450nm光波下分析检测各孔吸光度(0D值)。测定应在加终止液后15min内进行。注意:以上所有操作在23±1°C下进行。根据标准孔的加样浓度值(ng/mL)及各孔测得的0D450值(表I )，制作标准曲线图(图 1)，根据标准曲线方程方程:y=2.815/[1+(χ/609.692Γ1.152]-0.015(R2=0.9994)，得到样品孔(上述步骤三所得待测上清液)中IgA的浓度(ng/mL)。根据公式:每克新鲜粪便中IgA的含量(ng/g)=上述步骤三所得待测上清液中IgA的浓度(ng/ml) X 10ml/g,换算得到每克新鲜粪便中IgA的量(ng/g)。表I标准孔的加样浓度值(ng/ml)及各孔测得的OD值
权利要求
1.褐马鸡育雏方法，为将待育褐马鸡雏鸡按照粪便中免疫球蛋白A的含量不同进行分组隔离饲养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述褐马鸡雏鸡为2 14日龄的褐马鸡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述方法为如下(I) (3)中的任一种: (1)将2 4日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养: 组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于834ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1133ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于834ng/g和1133ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡； (2)将7 9日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养: 组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于1196ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1363ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于1196ng/g和1363ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡； (3)将12 14日龄待育褐马鸡雏鸡分为如下三组，组间隔离饲养: 组A:粪便中免疫球蛋白A的含量低于1298ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组B:粪便中免疫球蛋白A的含量高于1556ng/g的所述待育褐马鸡雏鸡； 组C:粪便中免疫球蛋白A的含量介于1298ng/g和1556ng/g之间的所述待育褐马鸡雏鸡。
4.用于定量检测鸡免疫球蛋白A的物质在制备以粪便为待测样本鉴定或辅助鉴定褐马鸡雏鸡健康状态的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述用于定量检测鸡免疫球蛋白A的物质为鸡免疫球蛋白A特异性抗体或鸡免疫球蛋白A酶联免疫试剂盒。
6.鉴定或辅助鉴定褐马鸡雏鸡健康状态的试剂盒，包括包被抗体、酶标物和新鲜粪便收集工具；所述包被抗体为鸡免疫球蛋白A特异性抗体,所述酶标物为鸡免疫球蛋白A酶标抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括如下中的至少一种:鸡免疫球蛋白A标准品溶液、鸡免疫球蛋白提取液、底物显色液、终止液、洗涤液、包被缓冲液和封闭液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述鸡免疫球蛋白提取液为pH7.2，含有吐温20的0.0lM的磷酸盐缓冲液；所述吐温20在所述鸡免疫球蛋白提取液中的体积百分含量为0.05%。
9.权利要求6 8中任一所述试剂盒的制备方法，包括如下(I)或(2)的步骤: (1)将所述包被抗体、所述酶标物和所述新鲜粪便收集工具分别单独包装的步骤； (2)将所述包被抗体、所述酶标物、 所述新鲜粪便收集工具和如下中的至少一种分别单独包装的步骤:所述鸡免疫球蛋白A标准品溶液、所述鸡免疫球蛋白提取液、所述底物显色液、所述终止液、所述洗涤液、所述包被缓冲液和所述封闭液。
全文摘要
采用非损伤取样判定褐马鸡雏鸡体质状况及分群饲养方法。本发明公开了一种褐马鸡育雏方法。本发明所提供的褐马鸡育雏方法为将待育褐马鸡雏鸡按照粪便中免疫球蛋白A的含量不同进行分组隔离饲养。实验证明，通过监测褐马鸡雏鸡粪便中免疫球蛋白A的含量和变化，可评价褐马鸡雏鸡健康状态，这是理想的非损伤方法，将其运用到褐马鸡的育雏过程中，按照待育雏鸡粪便中免疫球蛋白A的含量把雏鸡进行分组隔离饲养，结果显示与随机分组的对照组相比，对于整个雏鸡群体而言，这种饲养方式大大降低了雏鸡的死亡率。
文档编号G01N33/68GK103168744SQ20131010396
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者齐磊, 胡德夫, 隋金玲, 张文博, 何岚, 邓怀庆 申请人:北京林业大学