专利名称：一种简易快速的猪囊胚差异染色方法
技术领域：
本发明涉及一种简易快速的猪囊胚差异染色方法，属于发育生物学技术领域。
背景技术：
猪既是重要的肉用家畜，又是良好的潜在生物医学模型动物。但是，随着猪相关研究课题的进展，越来越多的学者们意识到猪早期胚胎发育方面的解析远不如小鼠清晰的事实已经构成猪在生物医学模型方面发展的瓶颈。荧光染料在细胞计数上的应用可以被追溯到上个世纪80年代，由Ebert等人在啮齿类动物上的初次尝试和此后陆续在其他哺乳动物研究中的利用。现有技术对于猪囊胚细胞染色存在染色效率较低、染色周期长等缺陷。
发明内容
本发明提供了一种简易快速的猪囊胚差异染色方法。为解决上述技术 问题，本发明的技术方案为:I)酸性操作液去除猪囊胚透明带；2)将囊胚放入液体I中同时进行透膜和滋养层细胞特异性染色过程；3)将囊胚放入液体2中进行囊胚全细胞核染色的过程；4)对胚胎进行常规压片，在正置荧光显微镜上观察。所述液体I的组成为:含10_50ug/mL碘化丙唳(Propidium iodide, PI)和
0.01-0.1%(V/V) TritonX 的 PBS。所述液体2的组成为:含Hoechst33342的PBS。其中液体I 优选组成为:含 30ug/mL PI 和 0.02% (V/V) TritonXlOO 的 PBS0囊胚在液体I中处理时间优选40s。液体2 的优选组成为:含 10ug/mL Hoechst33342 的 PBS。囊胚在液体2中处理时间优选5min。本发明简化了对猪囊胚进行差异染色的实验步骤，大大缩短了实验时间(只需IOmin),并且降低了实验成本。
图1利用24孔板进行猪囊胚差异染色操作的图示。依据所需的平行染色的组数决定添加几行液体。A列加入酸性操作液，作用5s ；B列加入清洗液，作用30s ；C列加入液体1，作用40s ；D列加入清洗液，作用30s ；E列加入液体2，作用5min ；F列加入清洗液，作用 lmin。图2猪囊胚差异染色结果。
具体实施例方式实施例1
液体I 的组成为:含 30ug/mL PI 和 0.02% (V/V) TritonXlOO 的 PBS。液体2 的组成为:含 10ug/mL Hoechst33342 的 PBS。下面结合说明书附图对本发明进一步说明。准备工作:1，实验前按着图1说明在24孔板一行中加入相应的液体。每一行为一组，需要多组进行同步染色时将液体照第一行给出的顺序依次加入24板其他行中。每一行用于一组实验。2，在载玻片上添加5ul防猝灭剂用于最后压片。3，拉制2个直径较囊胚直径大一些的玻璃口吸管，将口烧盾，以免操作中玻璃刺刮破囊胚。4，实验开始时将24孔板避光放在35度温台上。实验操作:1，从培养箱中取出培养6-7天的胚胎，在实体显微镜下挑出囊胚，按着图1所示将囊胚加入24孔板A孔，立即换口吸管。依据所需的平行染色的组数决定添加几行液体。A列加入酸性操作液，作用5s ；B列加入清洗液，作用30s ；C列加入液体1，作用40s ；D列加入清洗液，作用30s ；E列加入液体2，作用5min ；F列加入清洗液，作用lmin。2，经历6孔操作后，将囊胚加入以上准备的防猝灭剂中，盖上18X 18mm盖玻片，在正置荧光显微镜下观察。注意事项:1，A，B孔之间必须更换口吸管，因为用于从培养液中吸出囊胚的口吸管上沾的石蜡油会对去了透明带的囊胚产生破坏。2，实验全程注意避光。3，所有过程在水平摇床上进行，转速调至70rpm以下。结果分析:将制作的片子分别用UV光和564-nm波长激发光下进行拍照。并对，两个图片进
行重叠。由于UV光所得信号为对囊胚所有细胞核进行染色的HoeChst33342的蓝色信号，而564-nm波长激发光所得信号为PI对囊胚外层滋养层细胞细胞核染色的红色信号，经过重叠，外层由于同时发出蓝色和红色荧光而显示为粉色，而内细胞团细胞只显示蓝色信号。图2示例，我们可以清晰的辨认出该囊胚中的滋养层细胞数(粉色核)为48，内细胞团细胞数(蓝色核)为11,总细胞数为59。实施例2与实施例1区别在于:液体I 组成:液体 I 的组成为:含 10ug/mL PI 和 0.1% (V/V) TritonXlOO 的 PBS。液体2 的组成为:含 20ug/mL Hoechst33342 的 PBS。实施例3与实施例1区别在于:液体I 组成:液体 I 的组成为:含 50ug/mL PI 和 0.01% (V/V)TritonX100 的 PBS0液体 2 的组成为:含 20ug/mL Hoechst33342 的 PBS。
权利要求
1.一种简易快速的猪囊胚差异染色方法，其特征在于，步骤如下: 1)酸性操作液去除猪囊胚透明带； 2)将囊胚放入液体I中同时进行透膜和滋养层细胞特异性染色过程； 3)将囊胚放入液体2中进行囊胚全细胞核染色的过程； 4)对胚胎进行常规压片，在正置荧光显微镜上观察； 所述液体I的组成为:含10-50ug/mL碘化丙啶和0.01-0.1%(V/V) TritonX的PBS ； 所述液体2的组成为:含Hoechst33342的PBS。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述液体I组成为含30ug/mLPI和0.02%TritonX100 的 PBS。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述液体2组成为含10ug/mLHoechst33342的 PBS。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，囊胚在液体I中处理时间为40s。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，囊胚在液体2中处理时间为5min。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下: (一)准备工作: 1)在24孔板中A列加入酸 性操作液，B列加入清洗液，C列加入液体1，D列加入清洗液，E列加入液体2，F列加入清洗液； 2)在载玻片上添加5ul防猝灭剂用于最后压片； 3)拉制2个直径较囊胚直径大的玻璃口吸管，将口烧盾，以免操作中玻璃刺刮破囊胚； 4)实验开始时将24孔板避光放在35度温台上； (二)实验操作: 1)从培养箱中取出培养6-7天的胚胎，在实体显微镜下挑出囊胚，将囊胚加入24孔板A孔，立即换口吸管；A列作用5s，B列作用30s，C列作用40s，D列作用30s，E列作用5min，F列作用Imin ； 2)经历6孔操作后，将囊胚加入以上准备的防猝灭剂中，盖上18X18mm盖玻片，在正置突光显微镜下观察。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，A,B列之间更换口吸管。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，操作全程避光。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，操作过程在水平摇床上进行，转速调至70rpm以下。
全文摘要
本发明公开了一种简易快速的猪囊胚差异染色方法，属于发育生物学技术领域。是对猪囊胚进行表面活性剂TritonX100透膜处理后，利用两种核染料碘化丙啶和Hoechst的分子大小上的区别对囊胚外层滋养层细胞和内侧的内细胞团细胞进行差异染色。本发明简化了对猪囊胚进行差异染色的实验步骤，大大缩短了实验时间，并且降低了实验成本。
文档编号G01N1/30GK103245546SQ20131016306
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月7日 优先权日2013年5月7日
发明者格日乐其木格, 刘忠华, 何文腾, 朱江 申请人:东北农业大学