基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于Au?NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感【技术领域】。该检测系统包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA、Au?NPs标记的发夹结构DNA和组装在金片表面的发夹结构DNA。当没有腺苷时，Au?NPs标记DNA保持发夹结构而不能与金片表面的发夹DNA杂交，无法将Au?NPs捕获到金片表面。当存在腺苷时，腺苷与其适配体结合，探针DNA则从适配体/探针DNA双链中释放出来而与Au?NPs标记的发夹DNA杂交使其开环，开环后的AuNPs标记DNA与金片表面的DNA杂交将Au?NPs捕获到金片上，替换出来的探针DNA引发下一轮DNA链替换反应，如此循环，单个腺苷分子可引发大量Au?NPs组装到金片上，获得增强的SPR信号，用于对腺苷的高灵敏检测。
【专利说明】基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感【技术领域】。
【背景技术】
[0002]适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与抗体为识别元件相比，适配体具有配体广泛、易合成、易标记、化学稳定性好等优势，被广泛应用于目标分子的识别与检测。迄今为止，已有各种以核酸适配体为识别元素的比色传感器、荧光传感器、电化学传感器、发光传感器、石英晶体微天平传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器的报道。其中，基于SPR检测法的适配体传感器因无需标记、高灵敏及实时监测等优势而具有良好的应用前景。大部分SPR适配体传感器采用夹心检验法、目标引发构像改变或目标引发链替换与竞争相结合等原理实现对生物分子的检测。尽管这些传感器对目标分子的检测具有较高的选择性和灵敏度，但它们大多按1:1的信号:目标物比例输出信号，无法实现低浓度物质特别是小分子和核酸等的高灵敏检测。因此，发展高灵敏的SPR传感技术用于检测低浓度生物分子具有重要意义。
[0003]近年来，核酸分子扩增技术被广泛用于提高适配体传感器的检测灵敏度，如，靶诱导替换聚合、滚环放大、聚合酶链反应、基于核酸内切酶的信号放大反应等。这些方法虽然提高了检测灵敏度，但它们往往需要用到蛋白酶，不仅增加了分析成本，还需要精确控制蛋白酶的反应条件，大大限制了应用。发展无酶放大方法用于生物分子的高灵敏检测尤为重要。基于杂交和链替换的无酶放大技术(如杂交链扩增反应、熵驱动催化、目标催化发夹组装)，由于模式固有、易于扩展、无需使用蛋白酶等特点，具有广阔的应用前景。然而，迄今尚未见基于无酶放大技术的SPR适配体传感器用于小分子高灵敏检测的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，它具有检测灵敏和选择性好的优点。
[0005]本发明是这样来实现的，在包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA(c-DNAl)、Au NPs标记的发夹结构DNA (Au-H-DNAl)、预组装在SPR金片上的巯基化发夹结构DNA (H-DNA2)的实验体系中，当没有目标分子腺苷存在时，Au-H-DNAl上的H-DNAl保持发夹结构而不能与预组装在金片表面的发夹结构H-DNA2杂交，无法将Au NPs捕获到金片表面。然而，当存在目标分子腺苷时，腺苷与适配体特异性结合促使适配体发生折叠而构象改变，使得c-DNAl从适配体/c-DNAl双链中释放出来与Au-H-DNAl杂交使其开环，开环后的Au-H-DNAl与预组装在金片表面的H-DNA2杂交将Au NPs捕获到金片上，同时替换出c-DNAl，替换出来的c-DNAl则引发下一轮DNA链替换循环。通过如此DNA链替换循环，单个腺苷分子则可引发大量Au-H-DNAl组装在SPR金片上。Au NPs对SPR信号的放大效应，使得SPR测量信号大大增强，对腺苷的检测限低至PM级别。同时，适配体的高特异性，使得传感器具有良好的抗干扰能力。本发明基于Au NPs对SPR信号耦合放大效应和目标物引发DNA链替换循环双重放大策略构建的SPR适配体传感器，为低浓度生物小分子的高灵敏和选择性检测提供了普适性平台，具有良好的应用前景。
[0006]为成功构建所述的适配体传感器，本发明采用以下技术方案:
基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建包括以下步骤:
(1)AuNPs的制备:将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入I mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 ° C保存备用；
(2)Au NPs-H-DNAl的制备:巯基化H-DNAl用100 μ L新配制的I mM 二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与I mL步骤(I)制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用PBS缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的H-DNAl ;将获得的Au NPs-H-DNAl重悬于PBS缓冲溶液中，4 ° C下保存备用；
(3)SPR适配体传感界面的构建:将金片在体积比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2min，用二次水冲洗干净，浸入10 mM的巯基己醇溶液中2 h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池；注入50 μ LU.2 μΜ的巯基化发夹结构H-DNA2溶液反应2 h，制得预组装了 H-DNA2的传感界面；
上述步骤中，步骤(2)中，所述的二硫苏糖醇溶液用浓度为170 mM、pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液配制。所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.4，含0.1 M NaCl。步骤(3)中，所述的巯基己醇溶液用无水乙醇配制。所述的巯基化发夹结构DNA溶液用浓度为10mM、pH为7.4且含0.1 M NaCl的磷酸盐缓冲溶液配制。
[0007]基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器的应用，是指它在腺苷检测中的应用:20 μ LU.0 μ M的腺苷适配体和相同比例的探针DNA在37 ° C孵育2 h，形成适配体/c-DNAl双链；加入20 μ L不同浓度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h，腺苷与其适配体特异性结合而将探针DNA从适配体/c-DNAl双链中释放出来；取25 μ L上述溶液加入到25 μ L Au NPs-H-DNAl溶液中，将该混合溶液注入到SPR检测池中使其与预组装于传感界面的H-DNA2反应I h ;用蠕动泵将反应溶液排出并注入50 μ L 二次水进行清洗；随着腺苷浓度的增大，捕获到传感界面的Au NPs逐渐增多，SPR响应信号迅速增强，SPR角度变化与腺苷浓度在0.5-50 ρΜ范围内呈良好的线性关系，检测限为0.21 PM，可用于对腺苷的超灵敏和超低浓度检测。
[0008]本发明的技术效果是:本发明结合Au NPs对SPR信号的耦合放大效应和目标引发DNA链替换放大技术，发展了一种无酶SPR适配体传感器，用于对腺苷的高灵敏和选择性检测。优点如下:(1)采用目标引发DNA链替换循环放大技术，通过多次循环放大，单个腺苷分子可以引发大量Au NPs组装到SPR传感界面上；(2)Au NPs具有高分子质量和高介电常数，而且，SPR金膜与Au NPs还具有电场耦合谐振作用，这些都使得Au NPs能够极大地提高SPR响应信号，进而提高检测灵敏度；(3)利用本发明的双重放大方法，可实现ρΜ级腺苷的检测，比基于单重放大如Au NPs放大或DNA链替换循环放大效应构建的传感器对腺苷的检测限低3个数量级；(4)适配体对其目标物的高特异性，使得本发明构建的传感器对腺苷具有良好的选择性。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是SPR适配体传感器构建及其对腺苷检测的原理图。
[0010]图2是(a)Au NPs和(b) Au-H-DNAl的紫外-可见吸收光谱图。
[0011]图3 是(a)裸电极，(b)MCH, (c)H_DNA2 和(d)Au-H-DNAl/H_DNA2 修饰电极的(A)循环伏安曲线和(B)交流阻抗曲线。内插图为等效电路图；RS，Zw, Rrt和Cdl分别为溶液电阻，Warburg电阻，电子转移阻抗和双层电容。
[0012]图4是(A)链替换循环时间，(B)H-DNA2浓度，(C)H-DNAl浓度对SPR传感器性能的影响。
[0013]图5是不同方式检测50 PM腺苷的SPR响应曲线:(a)链替换循环放大，(b) AuNPs放大，(C)Au NPs与链替换循环双重放大。
[0014]图6是(A)裸金片，(B)Au NPs与链替换循环双重放大检测50 ρΜ腺苷后的金片和(C) Au NPs放大检测50 ρΜ腺苷后的金片表面的SEM图。
[0015]图7是(A)Au NPs与链替换循环双放大检测腺苷的SPR曲线:a-1分别为0，0.5，1，5，10，30，40，50和100 ρΜ的腺苷。(B)腺苷检测校正曲线:(a) Au NPs与链替换循环双放大，(b) Au NPs放大和(c)链替换循环放大。
[0016]图8是基于Au NPs与链替换循环双重放大检测方式构建的传感器对腺苷、尿苷、鸟苷和胞苷的SPR响应曲线。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；
实施例1
(1)AuNPs的制备:将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入I mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 ° C保存备用；
(2)AuNPs-H-DNAl的制备:巯基化H-DNAl用100 μ L新配制的I mM 二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与I mL步骤(I)制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于PBS缓冲溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用PBS缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的H-DNAl ;将获得的Au NPs-H-DNAl重悬于PBS缓冲溶液中，4 ° C下保存备用；
采用紫外-可见光谱对Au NPs标记H-DNAl探针的制备进行了表征，结果如图2所示。曲线a中520 nm处的吸收峰表明合成的Au NPs粒径约13 nm。当将巯基化H-DNAl修饰于Au NPs表面后，520 nm处的吸收峰红移至526 nm,表明巯基化的H-DNA1与Au NPs发生了相互作用，形成了 Au-H-DNAl探针，而且，形成的Au-H-DNAl在浓度为0.1 M的NaCl溶液中非常稳定。[0018]实施例2
SPR适配体传感器的制备过程
Cl)将金片在体积比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2 min，用二次水冲洗干净，浸Λ10 mM的巯基己醇溶液中2 h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池。注入50μ LU.2 μ M的H-DNA2溶液反应2 h，制得预组装了 H-DNA2的传感界面；
(2)将20 μ LU.0 μ M的腺苷适配体和相同比例的c-DNAl在37 ° C孵育2 h，加入20 μ L不同浓度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h ;取25 μ L上述溶液加入到25 μ L AuNPs-H-DNAl溶液中，将该混合溶液注入到SPR检测池中使其与预组装于传感界面的H-DNA2反应I h;用蠕动泵将反应溶液排出并注入50 μ L 二次水进行清洗；
采用循环伏安法和电化学交流阻抗法对SPR传感器的制备过程进行表征。由图3Α可见，裸金电极上呈现一对可逆的[Fe(CN)6]3_/4_的氧化还原峰(曲线a);当在电极表面组装一层MCH后，[Fe(CN) 6]3_/4_的氧化还原峰电流减小(曲线b);通过金-巯键将H-DNA2修饰于金电极表面后，峰电流进一步减小(曲线c);当50 ρΜ腺苷与腺苷适配体/c-DNA双链反应
2h后，加入Au NPs-H-DNAl并注入SPR检测池孵育I h，[Fe (CN)6]3_/4_在电极表面的氧化还原电流进一步减小(曲线d)，这是由于大量Au-H-DNAl被固定于SPR金片表面的H-DNA2捕获，增加了电极表面的负电荷密度，阻碍了 [Fe(CN)6] 3 74向电极表面的电子转移。图3B为不同修饰电极的EIS表征，裸金电极的电子传递阻抗0?rt)仅为0.2 ΚΩ (曲线a);当在电极表面组装上MCH后式t增大为12 ΚΩ (曲线b);进而通过金-巯键组装上H-DNA2后，/Pet增大为16.8 ΚΩ (曲线c);当50 PM腺苷存在时，DNA链替换循环被启动，使得大量AuNPs-H-DNAl开环并被捕获到SPR金片表面，TPet显著增大至24.4 ΚΩ (曲线d)。EIS与CV结果一致，表明传感界面已按照预定方案成功构建。
[0019]实施例3.
SPR适配体传感器对腺苷的检测
(I)链替换循环时间，H-DNA2浓度，H-DNAl浓度的优化
图4A为不同链替换循环反应时间时传感器对50 ρΜ和O ρΜ腺苷的SPR响应。由图可见，对50 ρΜ腺苷，随着链替换循环反应时间的延长，SPR响应强度随之增强，I h后趋于稳定；当没有腺苷存在时，随着反应时间的延长，SPR响应强度随之稍有增强。因此，选择链替换循环反应为I h。图4B为H-DNA2浓度对SPR传感响应的影响。当H-DNA2浓度为1.2 μ M时，传感器的信噪比最佳，进一步增加H-DNA2浓度，SPR响应稍有下降，这是由于尽管组装在金片上的捕获探针密度增加，但高密度的发夹结构探针增加了空间位阻而不利于H-DNA2与Au-H-DNAl的杂交。因此，实验选择1.2 μ M为H-DNA2的最佳浓度。图4C为H-DNAl浓度对SPR传感响应的影响。随着H-DNAl浓度的增加(0.5-0.9 μ Μ)，传感器的背景信号与其对50 ρΜ腺苷的SPR信号均增大，进一步增加H-DNAl浓度，SPR信号下降，这是由于修饰在Au NPs上的H-DNAl过密，其空间位阻效应抑制了杂交效率。因此，选择H-DNAl的最佳浓度为0.9 μ Mo
[0020](2)为了验证Au NPs与链替换循环双放大效应对腺苷检测的放大效果，对仅基于Au NPs或链替换循环放大技术构建的传感器对50 ρΜ腺苷的SPR响应进行了考察，结果如图5所示。由图可见，链替换循环放大方式对50 ρΜ腺苷的SPR响应只有14.1 m° (曲线a)，而Au NPs放大方式对50 ρΜ腺苷的SPR响应为80.3 m0 (曲线b)，是基于链替换循环放大响应的5.7倍；Au NPs与链替换循环双放大方式对50 ρΜ腺苷的SPR响应为996 m(曲线c)，是基于Au NPs放大响应的12.5倍，表明Au NPs与链替换循环双重放大方式对腺苷检测具有明显的放大增强效果。这是由于链替换循环模式促使大量的Au-H-DNAl组装到SPR金片表面，Au NPs与金膜间的电子耦合作用，使得SPR信号被高效放大。而在Au NPs放大方式中，一条短链DNA (C-DNA2)代替了发夹H-DNA2固定在SPR金片表面。C-DNA2含有12个碱基，能与Au-H-DNAl的临近3’端的12个碱基杂交，但是，该杂交过程不能将c-DNAl链从Au-H-DNAI/c-DNAI双链中释放出来，因而不能引发DNA链替换循环，故Au-H-DNAl与C-DNA2按1:1的化学计量比杂交固定到SPR金片上，无法实现对SPR信号的进一步放大；米用扫描电子显微镜对三种不同放大方式检测50 ρΜ腺苷后的金片表面形貌进行了表征，结果如图6所示。SPR金片表面较为光滑(图6A)，当采用Au NPs与链替换循环双重放大方式检测50 PM腺苷后，大量Au NPs均匀地负载于金片表面(图6B)，表明通过链替换循环模式促使溶液中大量的Au-H-DNAl与金片表面的H-DNA2发生杂交而捕获到SPR金片上。当采用Au NPs放大方式检测50 ρΜ腺苷后，在金片表面只有少量的Au NPs (图6C)，覆盖率远低于图6B,这是由于Au-H-DNAl与固定于金片表面的短链C-DNA2只能以1:1的形式杂交，限制了 Au-H-DNAl固定到金片上的量。
[0021](3)在优化条件下，按照图1所示对腺苷进行了检测，SPR曲线如图7A所示。SPR角度变化(AAngle)随着腺苷的浓度增加而增大，AAngle与腺苷浓度(C)在0.5-50 ρΜ范围内有良好的线性关系，线性回归方程为Angle (m0)= 164.28 +16.31 C (R=0.9949)，检测限为0.21 ρΜ。在相同实验条件下，考察了仅基于Au NPs或链替换循环放大方式对腺苷的响应，结果如图7B所示。由图可见，基于Au NPs或链替换循环放大方式对腺苷检测的SPR响应明显低于Au NPs与链替换循环双重放大方式的SPR响应，检测限分别为0.52 nM和
1.13 nM。可见，Au NPs与链替换循环双重放大方式可用于腺苷的高灵敏检测。
[0022](4)以核苷家族的其它三种核苷(尿苷、鸟苷和胞苷)为干扰物,考察了传感器对腺苷检测的选择性，结果如图8所示。由图可见，在相同的实验条件下，传感器对50 ρΜ腺苷的SPR响应最大，而对50 PM尿苷、鸟苷和胞苷几乎没有响应，表明本发明构建的传感器对腺苷检测具有良好的选择性。
【权利要求】
1.基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于所述构建包括以下步骤: .(1)AuNPs的制备:将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入I mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 ° C保存备用； .(2)AuNPs标记发夹结构DNA的制备:巯基化DNA用100 μ L新配制的I mM 二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与I mL步骤(I)制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于磷酸盐缓冲溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的DNA ;将获得的Au NPs标记的发夹结构DNA重悬于磷酸盐缓冲溶液中，4 ° C下保存备用； .(3)SPR适配体传感界面的构建:将金片在体积比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2min，用二次水冲洗干净，浸入10 mM的巯基己醇溶液中2 h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池；注入50 μ LU.2 μ M的巯基化发夹结构DNA溶液反应2 h，制得预组装了巯基化发夹结构DNA的传感界面。
2.根据权利要求1所述的基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤(2)中，所述的二硫苏糖醇溶液用浓度为170 mM、pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液配制。
3.根据权利要求1所述的基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤(2)中，所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.4，含0.1 M NaCl。
4.根据权利要求1所述的基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤(3)中，所述的巯基己醇溶液用无水乙醇配制。
5.根据权利要求1所述的基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤(3)中，所述的巯基化发夹结构DNA溶液用浓度为10 mM、pH为7.4且含0.1M NaCl的磷酸盐缓冲溶液配制。
6.基于AuNPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器的应用，是指它在腺苷检测中的应用:其特征在于，20 μ LU.0 μ M的腺苷适配体和相同比例的探针DNA在37 ° C孵育2h，形成适配体/探针DNA双链；加入20 μ L不同浓度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h，腺苷与其适配体特异性结合而将探针DNA从适配体/探针DNA双链中释放出来；取25 μ L上述溶液加入到25 μ L Au NPs标记发夹结构DNA溶液中，将该混合溶液注入到SPR检测池中使其与预组装于传感界面的发夹结构DNA反应I h ;用蠕动泵将反应溶液排出并注入50μ L 二次水进行清洗；随着腺苷浓度的增大，捕获到传感界面的Au NPs逐渐增多，SPR响应信号迅速增强，SPR角度变化与腺苷浓度在0.5-50 PM范围内呈良好的线性关系，检测限为0.21 PM，可用于对腺苷的超灵敏和超低浓度检测。
【文档编号】G01N21/55GK103439296SQ201310329115
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】邱建丁, 姚桂红, 梁汝萍 申请人:南昌大学