一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法
【专利摘要】本发明涉及一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法，包括步骤为：（1）对细胞装载具有声敏性的药物或者声敏性的药物的前体，待声敏剂被细胞吸收或者转化后，给予超声辐照；（2）检测声敏剂与TSPO的结合能力，筛选诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂。本发明提供了一个筛选声敏剂的靶点，用来筛选可以诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂，并且为声敏剂药物的筛选提供了一种有效的方法，有利于声敏剂药物的研究和开发，有助于推动声动力治疗的理论研究和临床应用。
【专利说明】一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法，具体涉及一种声动力治疗诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选有效的声敏剂的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]声动力治疗(sonodynamic therapy, SDT)是超声结合临床实践产生的一种新型抗肿瘤方法，它是借助超声激活癌细胞内富集并长时间滞留的声敏剂如血卟啉(HP)及其衍生物，杀伤肿瘤细胞的一种治疗癌症和其他增生性疾病的新方法。由于SDT具有不良反应小，且无创的优点，一经提出立刻受到全世界学者的高度重视。声动力治疗是借助超声和声敏剂的协同作用，诱导靶细胞死亡的方法。声敏剂的选择已成为当前SDT领域中最为关键的问题，声敏剂的选择直接影响声动力作用的靶点和靶细胞的死亡途径和细胞死亡后的局部炎症反应。声敏剂的研发直接影响到SDT能否在临床广泛推广和应用。目前已报道的声敏剂有卟啉及其衍生物、抗癌药物和非留体类抗炎药等。
[0003]凋亡是细胞的程序性死亡，与细胞坏死相比，细胞凋亡不会引起炎症反应。在肿瘤或其他增生、炎症性疾病中，如果能诱导细胞凋亡则能即达到诱导细胞死亡的目的，又避免了加重局部炎症的副作用。而在声动力治疗中，损伤细胞的死亡方式与声敏剂的定位，作用方式有很大的关系。
[0004]已有研究表明线粒体膜上的外周型苯二氮卓受体转运蛋白(the mitochondrial18 kDa translocator protein, TSP0)处产生活性氧,可以诱导细胞发生线粒体凋亡。由于空间位置上的接近，线粒体膜转运蛋白(TSPO)位置产生的活性氧，能够氧化与其邻近蛋白，引起细胞色素C释放，诱导细胞的线粒体途径凋亡。声动力治疗，作为一种诱导细胞凋亡的有效方法，已经在治疗肿瘤，动脉粥样硬化等疾病的研究中取得了良好的研究成果，能够有效的诱导肿瘤细胞或巨噬细胞的凋亡，在这个过程中，我们希望细胞可以走向线粒体途径的凋亡。已经有研究表明线粒体`途径的凋亡能够促进凋亡细胞被有效吞噬。
【发明内容】
[0005]为达到上述目的，本发明提供了一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法。
[0006]一种声敏剂在声动力治疗中诱导细胞走向何种途径的凋亡或死亡，其在细胞中结合的位点是很关键的。我们通过检测声敏剂与TSPO的结合能力，可以筛选出有可能诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]1、首先对细胞装载具有声敏性的药物或者声敏性的药物的前体，待声敏剂被细胞吸收或者转化后，给予超声辐照，声敏剂在超声能量的激发下，发生能级跃迁，产生活性氧；
[0009]2、检测声敏剂与TSPO的结合能力，筛选出诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂。[0010]细胞线粒体内的TSPO对作为声敏剂的原卟啉IX (PpIX)具有较强的亲和力，所以，TSPO对PpIX有一定的蓄积作用，这部分声敏剂在超声的激发下产生活性氧引起细胞线粒体内膜上的细胞色素C (cyt C)经过线粒体通透性转化孔(mPTP)释放到线粒体外，细胞色素C的释放会引起细胞线粒体途径的凋亡，如图1所示。活性氧性质活跃，仅能对与其位置接近的目标发挥作用，比如邻近TSPO的心磷脂。
[0011]本发明的有益效果如下:
[0012]本发明提供了一个筛选声敏剂的靶点，用来筛选可以诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂，并且为声敏剂药物的筛选提供了一种有效的方法，有利于声敏剂药物的研究和开发，有助于推动声动力治疗的理论研究和临床应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为声动力在TSPO产生活性氧诱导细胞色素C释放图；
[0014]图2为PK11195抑制细胞内PpIX荧光图；
[0015]图3为PKl 1195抑制SDT后细胞线粒体膜电位降低图；
[0016]图4为PK11195抑制SDT诱导的巨噬细胞凋亡图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替`换均落入本发明的保护范围内。
[0018]实施例1诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法
[0019]首先对细胞装载具有声敏性的药物或者声敏性的药物的前体药物之后，进行超声辐照，产生声动力作用，观察各不同处理的实验分组的不同反应，推断TSPO及心磷脂氧化在声动力诱导的细胞线粒体途径凋亡中所发挥的作用。
[0020]具体步骤如下:
[0021]细胞采用THP-1细胞系(ATCC)佛波酯诱导72小时后分化为巨噬细胞
[0022]声敏剂采用5-氨基酮戊酸(ALA)，ALA在体内代谢成具有声敏性的PpIX发挥作用。
[0023]以下实例中，ALA的药物浓度为ImM，PpIX的药物浓度为20 μ g/ml。
[0024]声动力治疗组在巨噬细胞加入ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小时，给予超声辐照，超声参数为频率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，辐照时间为5min。用PK11195作为PpIX与TSPO结合的特异性抑制剂，在声动力作用前12小时将PK11195与细胞共同孵育，PKl1195 的浓度为 50ymol/Lo
[0025]1、TSPO蛋白对PpIX特异亲和性的检测
[0026]实验分为四组，ALA,组给予ImMALA孵育3小时，PK11195+ALA组，PKl1195孵育12小时后，给予相同浓度(ImM) ALA同样孵育3小时后，检测细胞内药物荧光，比较两组间PpIX荧光强度。PpIX组，给予20 μ g/ml的PpIX孵育3小时，PK11195+PpIX组为预给予ΡΚ1119512小时后，给予相同浓度(20 μ g/ml)的PpIX3小时后观察药物荧光。[0027]在荧光显微镜下可以观察到细胞内的药物荧光，荧光强度可以反映出细胞内可以发荧光的声敏剂的量。如图2所示，PKl1195作为TSPO的配体，对PpIX结合在TSPO上产生了竞争性结合的抑制作用，使得孵育相同时间后，PK11195组较未加抑制剂组荧光强度明显下降，ALA组和PpIX组分别下降了 24%(P〈0.05)和28%(P〈0.001)。检测结果显示，TSPO对PpIX具有亲和性，并且可以被PKl 1195抑制。
[0028]2、与TSPO结合的PpIX在声动力引起的细胞线粒体膜电位降低中的作用检测
[0029]确定了 PpIX与TSPO的特异性结合，进一步用TSPO的抑制剂来验证PpIX-SDT对线粒体膜电位的影响，在其后诱导细胞凋亡中的作用。 [0030]实验分为3组，分别为对照组，声动力治疗组，Pkll95声动力治疗组。其中对照组不做任何处理；声动力治疗组ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小时，给予超声辐照，超声参数为频率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，辐照时间为5min ;PK11195声动力治疗组，Pkll95孵育12小时候，给予和声动力组相同处理。
[0031]声动力治疗3小时后，用线粒体膜电位检测试剂盒染色，并用流式细胞仪观察，结果与对照组相比声动力治疗使细胞线粒体膜电位明显下降，而给予PKl 1195抑制声敏剂和TSPO结合后，声动力使线粒体膜电位下降的程度降低约43%，如图3所示。线粒体膜电位降低是细胞发生线粒体途径凋亡的重要早期表现，可见与TSPO结合的PpIX在声动力引起的细胞线粒体膜电位降低中起重要作用。
[0032]3、与TSPO结合的PpIX在声动力诱导的细胞凋亡中作用的检测
[0033]实验分为3组，分别为对照组，声动力治疗组，Pkll95声动力治疗组。其中对照组不做任何处理；声动力治疗组ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小时，给予超声辐照，超声参数为频率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，辐照时间为5min ;PK11195声动力治疗组，Pkll95孵育12小时候，给予和声动力组相同处理。
[0034]声动力治疗3小时后对巨噬细胞进行Annexin V/PI双染，并用流式细胞仪分析，结果如图4所示，对照组细胞早期凋亡率为13%，声动力治疗组为39%，而Pkll95组为19%。分析上述结果，声动力治疗能够诱导细胞凋亡，而这种凋亡能被PK11195抑制，也就是说，部分抑制声敏剂与TSPO蛋白的结合，可以对声动力治疗引起的凋亡起抑制作用，可见TSPO结合的声敏剂在声动力治疗诱导细胞凋亡中起重要作用。
【权利要求】
1.一种诱导细胞线粒体途径凋亡中筛选声敏剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)对细胞装载具有声敏性的药物或者声敏性的药物的前体，待声敏剂被细胞吸收或者转化后，给予超声辐照； (2)检测声敏剂与TSPO的结合能力，筛选诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂。
2.TSPO在筛 选诱导细胞线粒体途径凋亡的声敏剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK103550774SQ201310516615
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】田野, 孙鑫, 郭淑媛, 程佳丽 申请人:哈尔滨医科大学