抗大肠杆菌o157:h7单克隆抗体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的该菌单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌O157:H7，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。
【专利说明】抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，确切地说是抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体及应用。【背景技术】
[0002]肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC)主要包括0157:H7, 026:H11和0111等几种血清型，其中0157:H7是典型菌株。0157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癫等严重并发症，重者可引起死亡。0157: H7引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，在许多国家导致多起爆发流行。0157: H7可引起出血性肠炎，约有10%的患者发展为溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜，死亡率高达30%以上。世界卫生组织(WHO)已把EHEC 0157: H7出血性肠炎列为新发传染病。EHEC 0157:H7感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。
[0003]目前检测EHEC 0157: H7常规采用山梨醇-麦康凯琼脂(SMAC)培养基，选择山梨醇发酵阴性的大肠杆菌，进一步用生化和血清学试验做鉴定，需要24~48 h。采用PCR方法进行检测需要较昂贵的仪器，费用高，不易于基层单位推广。单克隆抗体因具有良好的特异性、稳定性和 可重复性等优点，但是可靠的EHEC 0157: H7的单克隆抗体杂交瘤不容易制备，目前我国一直靠进口。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是一株抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤及其分泌的抗体和应用。
[0005]抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为=CGMCCN0.6251 ；
抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，它是由上述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的；
一种液相芯片检测株大肠杆菌0157:H7的试剂盒，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体；
一种胶体金检测大肠杆菌0157:H7的试纸条，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。
[0006]本发明提供了抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的该菌单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌0157:H7，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1.融合12天后倒直显微镜观察结果；
图2.大肠杆菌0157:H7单克隆抗体ProtienG柱纯化结果；
图3.单克隆抗体亚型测定结果；
图4.BCA法测定单抗蛋白含量标准曲线；
图5.非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力；
图6.捕获抗体最佳工作浓度的确定；
图7.灵敏度检测结果；
图8.特异性检测结果；
图9特异性检测结果；
图10胶体金试纸条的组装顺序。
[0008]【具体实施方式】:
实施例1大肠杆菌0157:H7抗原菌液的制备和BALB/c小鼠免疫取本研究实_80°C保存的标 准大肠杆菌0157:H7 (ATCC11229)，经肉汤培养后，划线法于LB上培养，常规方法增菌培养，6000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用灭菌生理盐水重复离洗三次后进行菌落计数(2.0X 108CFU/mL)，加入终浓度为0.3%的甲醛4°C过夜使菌体灭活。次日将洗脱好的菌液在20KHz、150W的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎，每次破碎10s，间隔10s，总用时20min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量，结果为2.636 mg/mL0
[0009]取8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液(2X 108CFU/mL)与等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以后每隔2周免疫I次，换用弗氏不完全佐剂，剂量同前，共免3次。
[0010]实施例2免疫小鼠血清抗体效价的测定
3免后，小鼠断尾采血，用常规间接ELISA方法检测血清效价。其中，包被抗原是实施例1所制备的大肠杆菌0157:Η7菌液，稀释度为1:50，小鼠血清浓度为200X稀释度开始的梯度浓度，酶标二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗小鼠IgG (稀释度为1:15000)。测定结果表明，抗体效价为1:25600。
[0011]实施例3大肠杆菌0157: Η7单克隆抗体的制备 (I)杂交瘤细胞株的建立
①饲养细胞的制备:正常BABL/C小鼠断颈处死，将8mL HAT培养液注入腹腔，轻轻摇动小鼠身体数下后抽出培养液，调整细胞浓度至IO5个/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100 μ L，置细胞培养箱中培养过夜备用，此即为饲养细胞。
[0012]②骨髓瘤细胞的培养与细胞悬液的制备:融合前一周复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)，隔I天传代I次，融合选在传代后I天进行。融合前取约4瓶(25cm2) SP2/0细胞，用RPM1-1640培养液吹下各瓶细胞，1200r/min离心10min，重复2_3次，使用细胞计数板计数。
[0013]③脾细胞悬液的制备:免疫小鼠摘眼球采血，4°C过夜后2500r/min离心10min，取血清于-20°C保存备用。小鼠处死后，常规方法取脾并用RPM1-1640培养液制备脾细胞悬液，计数。[0014]④细胞融合:调整上述制备SP2/0细胞与脾细胞数量比为1:5。1200r/min离心lOmin，弃上清液。轻弹离心瓶底，使细胞松散。在30s内逐滴缓慢加入37°C预热的PEG
0.8mL，静置60s。逐滴加入R/MINI1640培养液，稀释离心瓶内PEG浓度，逐渐加快滴加速度，共加入R/MINI1640培养液30mL。融合过程在8min内完成。1200r/min离心10min，弃上清液，加入40mL预热的HAT培养液，静置15min，滴到前一天制备的饲养细胞板中，每孔IOOyL0置于37°C，5%的0)2培养箱中培养。融合后3-4天，在倒置显微镜下观察融合成功的细胞团出现，计算克隆数。第3-4天，6-7天用HAT培养液进行半量换液，第9-10天起用HT培养液进行半量换液。
[0015]⑤阳性杂交瘤细胞株的筛选:待融合细胞生长至1/2视野(100倍镜下)以上时，如图1所示，可以进行上清效价检测，方法为常规间接ELISA法(阴性对照用SP2/0培养上清)。
[0016](2)杂交瘤细胞株亚克隆及扩大培养
①杂交瘤细胞的亚克隆:用HT完全培养液将检测阳性孔中的融合细胞轻轻吹打至1.5mL EP管中，计数细胞后取出100个细胞至IOmL HT中。将此细胞悬液滴至前一天制备的饲养细胞板中，每孔100 μ L。放入37°C，5%C02的培养箱中培养。第4天起观察细胞生长状况及进行半量换液。第1次换液前纪录每孔克隆数，待克隆细胞生长至1/2视野(100倍镜下)以上时，常规间接ELISA法检测上清抗体效价，选取单克隆阳性孔进行再次克隆，直到所有的克隆细胞孔都为阳性。
[0017]②杂交瘤细胞的扩大培养:将进行3-4次阳性亚克隆后达到阳性率100%，长满视野80%以上的孔中细 胞吹起，移至24孔板中，进行传代和移至6孔板及细胞培养瓶中。
[0018]在众多杂交瘤中，意外获得的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株；5C3B12F1册D1，已于2012年06月20日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市北辰西路I号院3号)保藏，保编号为=CGMCC N0.6251。
[0019](3)单克隆抗体的大量制备(腹水法)
接种杂交瘤细胞前一周将降植烷打入小鼠腹腔，每只0.lmL。用R/MIN1-1640培养液将细胞吹下，1000r/min离心10min，重悬后计数，调整细胞浓度为IO6个/mL，每只鼠腹腔注射0.5mL。观察小鼠腹腔变化，至腹部明显明显膨大，行动不便时，在腹部插入5mL注射器，抽取淡黄色腹水。一般可抽取2-3次。并用SP2/0细胞打入另外的小鼠腹腔制备阴性对照腹水。
[0020](4)腹水的纯化与保存
①粗提腹水IgG:腹水3000r/min离心20min,吸弃表层脂肪,上层几乎透明的液体为未纯化腹水。腹水中加入4倍体积的醋酸缓冲液(0.06mol/L,pH4.0)，逐滴加入辛酸(33 μ I/mL腹水)边加边搅，加完后水浴震荡lOmin，全速漩涡震荡30s，重复3次后4°C静止2h，6000r/min,离心30min,去沉淀。取上清加入1/10体积的PBS (0.lmol/L),依次加入终浓度为33%、50%的饱和硫酸铵，每次加完后4°C静置2h或过夜，6000r/min，离心15min。弃上清，将沉淀溶于少量0.01mol/L PBS中。
[0021]②ProtienG柱纯化腹水IgG:粗提后的腹水经0.22 μ m过滤，使用AKTA蛋白纯化系统进行过滤。选用IgG纯化柱洗脱得到纯化后的小鼠腹水IgG。用PBS对得到的单克隆抗体进行超滤离心(超滤离心管为30KD)，6000r/min，30min，重复4_5次，去除盐离子及浓缩，收集第二峰流出液，如图2所示。纯化后的单克隆抗体中可加入终浓度0.03%叠氮纳，于-20°C保存。
[0022]实施例4单克隆抗体性质的鉴定
(I)单克隆抗体效价的测定
纯化浓缩后的0157:H7单克隆抗体采用间接ELISA法测定其效价，方法同实施例2。测得抗体OD值与阴性腹水OD值比较，经AKTA纯化后的腹水效价为1:512000，如表1所示。
[0023]表1大肠杆菌0157:H7单克隆抗体效价测定(0D450nm)
【权利要求】
1.抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为=CGMCCN0.6251。
2.抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，它是由权利要求1所述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的。
3.一种液相芯片检测株大肠杆菌0157:H7的试剂盒，它的检测抗体为权利要求2所述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。
4.一种胶体金检测大肠杆菌0157:H7的试纸条，它的检测抗体为权利要求2所述的抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/577GK103898065SQ201310555729
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年11月9日 优先权日:2013年11月9日
【发明者】孟日增, 宋战昀, 芦春梅, 刘韬, 赵庆松, 王玮 申请人:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局