烟草中不同形态钙的分离分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草中不同形态钙元素的分离分析方法，该方法依次采用乙醇溶液、去离子水、果胶酶溶液、乙酸溶液、盐酸溶液分别提取出烟草中的醇溶钙、水溶性有机酸钙、果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙，剩下的残渣使用硝酸与过氧化氢的混合酸消化分解，最后通过离子色谱测定提取液和消化液中钙元素的含量。该方法可操作性强，分析结果准确可靠，为确定钙元素在烟草中的形态分布提供了科学依据。
【专利说明】烟草中不同形态钙的分离分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及烟草中化学成分的分离分析方法，具体涉及一种烟草中不同形态钙的分离分析方法。
【背景技术】
[0002]在烟草含有的无机元素中，钙的含量经常高于钾，钙与钾占烟叶灰分总量的70%左右。烟草中的钙主要以水溶性钙、果胶酸钙、草酸钙、磷酸钙、碳酸钙和硅酸钙形态存在，不同的存在形态有着不同的生理功能。烟草中的水溶性钙和果胶酸钙是具有生理活性的，此种形态的钙称为生理活性钙。其中水溶性钙主要包括游离钙离子以及易溶性的钙盐，比如:氯化钙、苹果酸钙等。果胶酸钙是植物细胞壁中交层的主要组成成分，可使细胞间形成相互交连，从而增加细胞的坚韧性。同时果胶酸钙还能有效提高植物抵御真菌等病原微生物侵染的能力。草酸钙晶体增多可促使新稍从营养生长向生殖生长转化。草酸钙的量与钙的有效性密切相关，因而烟草植物可通过包括草酸钙在内的非溶性钙与水溶性钙的相互转化来完成某些生理调控作用。磷酸钙具有解毒作用，然而形成的磷酸钙增多又将导致能量代谢受阻。细胞壁是钙的主要累积部位，而大部分的磷酸钙和草酸钙则主要沉淀在液泡之中。某些植物中不同形态钙的测定，已报道的方法，如《不同施钙措施对番茄果实钙含量和钙形态的影响》(董彩霞等，植物营养与肥料学报，2004，10 (I):91-95)—文中，分别使用80%乙醇溶液、去离子水、I 11101/1氯化钠溶液、2%乙酸溶液、0.6 mol/L盐酸溶液对番茄果实进行提取，分别提取番茄果实中的醇溶钙、水溶性有机酸钙、果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙等。然而使用I mol/L氯化钠溶液提取果胶酸钙，其机理是钠离子置换出果胶酸钙中的钙离子，其提取效率没有果胶酶的特异性高，而且在体系中引入了非常高浓度的钠离子，在使用离子色谱分析时，钠离子浓度远远超过目标分析物钙离子浓度，在钙离子浓度保持在色谱检测合适范围内的情况下，钠离子浓度远远超过色谱柱所能承受量，导致色谱峰严重变形，影响定量准确性。
[0003]烟草中钙元素存在形态和含量的分析对于了解烟草中钙的生理活性、烟草品质具有重要意义，但是目前报道的烟草中钙的测定，往往测定的是烟草总钙含量，而对烟草中不同形态钙含量测定则未有涉及。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种烟草中不同形态钙的分离分析方法，该方法操作简便、
准确可靠。
[0005]为了实现以上目的，本方法采取的技术方案为:烟草中不同形态钙的分离分析方法包括以下步骤:
(1)将烟草样品磨成粉末状，过筛，测定水分，备用；
(2)加入乙醇溶液提取步骤(I)得到的粉末状样品，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙醇水溶液连续提取两次，合并上清液，得到醇溶钙样品A ；(3)加入去离子水提取步骤(2)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用去离子水连续提取两次，合并上清液，得到水溶性有机酸钙样品B ；
(4)加入果胶酶溶液提取步骤(3)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用果胶酶溶液连续提取两次，合并上清液，得到果胶酸钙样品C ；
(5)加入乙酸溶液提取步骤(4)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙酸溶液连续提取两次，合并上清液，得到磷酸钙和碳酸钙样品D ；
(6)加入盐酸提取步骤(5)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用盐酸连续提取两次，合并上清液，得到草酸钙样品E ；
(7)使用硝酸与过氧化氢的混合酸微波消解步骤(6)剩下的残留物，得到残渣钙样品
F；
(8)取步骤(2)至步骤(7)得到的各形态样品溶液，利用离子色谱测定钙元素含量，并计算不同形态钙元素的分布。
[0006]步骤(2)所述的乙醇溶液为80%体积比的乙醇水溶液。
[0007]步骤(4)所述的果胶酶为诺维信果胶酶溶液，组成成分为:甘油45%，水40%，多聚半乳糖醛酸酶10%，氯化钾5%，活力为7900 U/mL,密度近似值为1.16g/mL,果胶酶溶液用量为样品质量的I~5倍，优选3倍。
[0008]步骤(5)所述的乙酸溶液为2%体积比的乙酸水溶液。
[0009]步骤(6)所述的盐酸溶液为0.6 mol/L的盐酸水溶液。
[0010]步骤(7)所述的酸消解液为体积比5:1的硝酸与过氧化氢的混合酸。
[0011]步骤(8)所述的离子色谱法的分析条件为:色谱柱为CS12A、保护柱为CG12A、淋洗液为甲基磺酸、淋洗浓度为20 mmol/L、流速为1.0 mL/min、抑制器为CSRS 300 4 _、抑制电流为59 mA、柱温:30 °C、进样量为25 μ?、外标法定量。
[0012]本发明提供的本发明提供的烟草中不同形态钙的分离分析方法，可操作性强，通过采用乙醇溶液、去离子水、果胶酶溶液、乙酸溶液、盐酸溶液分别提取出烟草中的醇溶钙、水溶性有机酸钙、果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙，剩下的残渣使用硝酸与过氧化氢的混合酸消化分解得到残渣钙，最后通过离子色谱测定测定钙元素的含量，实验结果准确度和精确到高，为确定钙元素在烟草中的形态分布提供了科学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法流程图。
[0014]图2果胶酶溶液提取液色谱图，
图3氯化钠溶液提取液色谱图。
【具体实施方式】
[0015]下面实施例对本发明的进行详细的描述。
[0016]一种烟草中不同形态钙的分离分析方法，具体包括以下步骤:
(1)将烟草样品磨成粉末状，过筛，测定水分，备用；
(2)加入乙醇溶液提取步骤(1)得到的粉末状样品，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙醇水溶液连续提取两次，合并上清液，得到醇溶钙样品A (主要为硝酸钙和氯化钙等);
(3)加入去离子水提取步骤(2)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用去离子水连续提取两次，合并上清液，得到水溶性有机酸钙样品B(主要为苹果酸钙和柠檬酸钙等);
(4)加入果胶酶溶液提取步骤(3)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用果胶酶溶液连续提取两次，合并上清液，得到果胶酸钙样品C ；
(5)加入乙酸溶液提取步骤(4)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙酸溶液连续提取两次，合并上清液，得到磷酸钙和碳酸钙样品D ；
(6)加入盐酸提取步骤(5)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用盐酸连续提取两次，合并上清液，得到草酸钙样品E ；
(7)使用硝酸与过氧化氢的混合酸微波消解步骤(6)剩下的残留物，得到残渣钙样品F(主要为硅酸钙等)；
(8)取步骤(2)至步骤(7)得到的各形态样品溶液，利用离子色谱测定钙元素含量，并计算不同形态钙元素的分布。
[0017]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(I)将烟草磨成粉末状并过40目筛，有利于保持样品的均匀性和提高提取液的提取效率。测定水分含量是为了最后计算结果时扣除样品所含水分。作为优选方案，称取0.3 g粉状烟草样品(精确至
0.0OOlg)。
[0018]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(2)使用80%(即体积比)的乙醇水溶液对样品进行提取。作为优选方案，每次乙醇水溶液体积为5 mL,每次振荡提取8小时，共提取三次。合并得到的上清液用去离子水定容至100 mL容量瓶待测。
[0019]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(3)使用去离子水对样品进行提取。作为优选方案，每次去离子水体积为5 mL，每次振荡提取8小时，共提取三次。合并得到的上清液用去离子水定容至100 mL容量瓶待测。
[0020]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(4)使用果胶酶溶液对样品进行提取。该果胶酶为诺维信果胶酶溶液，组成成分为:甘油45%，水40%，多聚半乳糖醛酸酶10%，氯化钾5%，活力为7900 U/mL，密度近似值为1.16g/mL。作为优选方案，果胶酶用量与样品质量之比为3:1，每次加入果胶酶后再加入5 mL去离子水进行提取，每次振荡提取8小时，共提取三次。合并得到的上清液用去离子水定容至100 mL容量瓶待测。
[0021]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(5)使用2% (即体积比)乙酸溶液对样品进行提取。作为优选方案，每次乙酸溶液用量为5 mL，每次振荡提取8小时，共提取三次。合并得到的上清液用去离子水定容至100 mL容量瓶待测。
[0022]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(6)使用0.6 mol/L盐酸溶液对样品进行提取。作为优选方案，每次盐酸溶液用量为5 mL，每次振荡提取8小时，共提取三次。合并得到的上清液用去离子水定容至100 mL容量瓶待测。
[0023]以上所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其中步骤(7)使用体积比5:1的硝酸与过氧化氢的混合酸对残渣进行微波消解。消解液用去离子水定容至500 mL待测。
[0024]本发明提供的烟草中不同形态钙的分离分析方法，步骤(8)使用离子色谱进行提取液和消解液中钙离子的测定，其分析条件为:色谱柱为CS12A、保护柱为CG12A、淋洗液为甲基磺酸、淋洗浓度为20 mmol/L、流速为1.0 mL/min、抑制器为CSRS 300 4 mm、抑制电流为59 mA、柱温:30 °C、进样量为25 μ?、外标法定量。
[0025]实施例1烟梗中不同形态钙的分析
1.1果胶酶溶液提取与氯化钠溶液提取的比较
为了验证果胶酶溶液在对果胶酸钙的提取效率和色谱分析上优于氯化钠溶液，进行了果胶酶溶液提取与氯化钠溶液提取比较实验。使用已提取出水可溶性钙的烟草浆料粉末
0.1 g，分别加入0.3 g果胶酶溶液与5 mL去离子水的混合液和5 mL I mol/L氯化钠溶液进行提取，提取结束后进行离心，上清液用去离子水定容至100 mL进行离子色谱分析。结果如表1和图1、图2所不。
[0026]表1果胶酶溶液与氯化钠溶液提取效率的比较
【权利要求】
1.烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将烟草样品磨成粉末状，过筛，测定水分，备用； (2)加入乙醇溶液提取步骤(1)得到的粉末状样品，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙醇水溶液连续提取两次，合并上清液，得到醇溶钙样品A ; (3)加入去离子水提取步骤(2)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用去离子水连续提取两次，合并上清液，得到水溶性有机酸钙样品B ； (4)加入果胶酶溶液提取步骤(3)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用果胶酶溶液连续提取两次，合并上清液，得到果胶酸钙样品C ； (5)加入乙酸溶液提取步骤(4)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用乙酸溶液连续提取两次，合并上清液，得到磷酸钙和碳酸钙样品D ； (6)加入盐酸提取步骤(5)剩下的残留物，恒温振荡提取一定时间后，进行离心，取出上清液，再用盐酸连续提取两次，合并上清液，得到草酸钙样品E ； (7)使用硝酸与过氧化氢的混合酸微波消解步骤(6)剩下的残留物，得到残渣钙样品F； (8)取步骤(2)至步骤(7)得到的各形态样品溶液，利用离子色谱测定钙元素含量，并计算不同形态钙元素的分布。
2.根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(2)所述的乙醇溶液为80%体积比的乙醇水溶液。
3.根根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(4)所述的果胶酶为诺维信果胶酶溶液，组成成分为:甘油45%，水40%，多聚半乳糖醛酸酶10%，氯化钾5%，活力为7900 U/mL，密度近似值为1.16g/mL，果胶酶溶液用量为样品质量的I~5倍，优选3倍。
4.根根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(5)所述的乙酸溶液为2%体积比的乙酸水溶液。
5.根根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(6)所述的盐酸溶液为0.6 mo I/L的盐酸水溶液。
6.根根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(7)所述的酸消解液为体积比5:1的硝酸与过氧化氢的混合酸。
7.根根据权利要求1所述的烟草中不同形态钙的分离分析方法，其特征在于:步骤(8)所述的离子色谱法的分析条件为:色谱柱为CS12A、保护柱为CG12A、淋洗液为甲基磺酸、淋洗浓度为20 mmol/L、流速为1.0 mL/min、抑制器为CSRS 300 4 mm、抑制电流为59 mA、柱温:30 °C、进样量为25 μ?、外标法定量。
【文档编号】G01N30/06GK103675161SQ201310691742
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】伊奥尔, 向能军, 汤建国, 柏婷, 孟昭宇, 拔丽, 乔丹娜, 张凤梅, 牟定荣, 朱瑞芝 申请人:红塔烟草(集团)有限责任公司