自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，它包括恒温短期孵化器(1)，细胞清洗和加样平台(2)、样品过滤平台(3)、采样和收集平台(4)和机器手多支管分送系统(5)，工作站的软件控制系统与显示界面。该工作站的结构设计合理，可使手工测试成为高通量自动化，可处理大量临床样品，提高工作效率，达到临床应用和样本快速筛选的目的。该多功能工作站可广泛测量其它分子，如蛋白质、脂质、RNA、离子、糖类、激素、维生素、代谢物等的细胞流出动力学特性，应用范围广泛。
【专利说明】自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物分子的高通量分析设备，具体涉及一种可以检测HDL细胞胆固醇流出的活性，也可用于其它分子/化合物，如蛋白质、脂质、离子、激素、代谢物等细胞内外流的定量，可广泛用于生物研究、临床诊断以及药物开发的高通量自动化生物分子的多功能分析系统。
【背景技术】
[0002]心血管疾病是人类健康的主要威胁，具有很高的发病率和死亡率，且出现逐年增长的趋势，尤其是在迅速发展的经济体如中国。据卫生部心血管防治研究中心，随着我国生活水平的提高和人口老龄化，心血管疾病发病率每年以30%的速度递增。
[0003]动脉粥样硬化是导致心血管疾病发病和死亡的主要原因。目前常用的降低危险因素的措施包括改变生活方式和服用降脂药，但仅能减少大约30%的冠脉不良事件，表明亟需发展新的疗法来满足医疗需求。血浆HDL基于其对心血管疾病，特别是动脉粥样硬化的自然防卫能力，已成为预测心血管类疾病及治疗上的重要靶标。但目前国内外市场上尚未见类似本发明提供的可有效评估HDL功能以筛选高危人群及评价治疗效果的仪器。总之，HDL功能检测技术上的限制已成为药物研发和临床试验的瓶颈，而开发新的HDL诊断方法以及开展功能分析是现在乃至相当一段时间内的研发方向，尤其是开发高通量高精度的检测技术。
[0004]HDL的抗粥样硬化效果与它从动脉壁中除去多余的胆固醇(即胆固醇流出)相关。运输到肝脏的胆固醇最终从粪便中排泄，此过程称为胆固醇逆向转运。现在所谓的心血管健康测试仍然基于生物标志物浓度的测量，而测量的标志物包括血浆脂蛋白或与炎症和氧化损伤等相关的生物分子远远不能满足目前的需要。特别是近年来多项研究显示HDL的功能比其血浆水平更重要，后者不再被认为是疾病预测的可靠指标，比如HDL可被修饰而导致其功能障碍。近年来的临床试验提供了有力的证据显示病人血浆或HDL胆固醇流出的活性和动脉壁增厚及动脉粥样硬化的显著改善呈正的相关性，从而更能预测血管和冠脉类疾病的发生。
[0005]胆固醇流出试验在实验室被广泛应用以研究疾病的机制，寻找新的候选药物，以及建立与疾病的关联。通常应用于心血管疾病研究，但也包括代谢(如糖尿病)和神经性疾病等。目前此实验只能在实验室通过手工进行，手工操作涉及大量的血浆稀释、细胞清洗和加样过滤等工作，此实验方法费时且易有人工误差；此外，多次重复的各种清洗和样品添加步骤不仅限制了每次测试的样本量，而且大量耗材，增加检测成本。由于以上缺陷，HDL功能测试在临床诊断或生物技术/药物开发的应用方面十分有限，而且无法用于大样本需要的高通量筛选。
[0006]因此，很有必要在现有技术的基础上，设计研发一种自动化程度高，能够高通量，快速，准确检测HDL细胞胆固醇流出活性和其它生物分子细胞流出的多功能分析系统。
【发明内容】
[0007]发明目的:本发明是为了解决在HDL功能分析方面现有技术的不足，提供一种结构设计合理，操作方便，具有高通量、高精度、低成本，高效率等优点，并且应用范围广泛的高通量自动化HDL功能分析工作站。
[0008]技术方案:为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为:
一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，它包括恒温短期孵化器，与恒温短期孵化器相连的细胞清洗和加样平台、样品过滤平台、与样品过滤平台相连的采样和收集平台、与细胞清洗和加样平台、样品过滤平台以及采样和收集平台均相连的机器手多支管分送系统，工作站的软件控制系统与显示界面。
[0009]作为优选方案，以上所述的高通量自动化多功能分析工作站，所述的机器手多支管分送系统包括多渠道孔矩形板，设置在多渠道孔矩形板下面的金属接头，与金属接头相连的一次性无菌枪头，所述的一次性无菌枪头可通过电控机器手的控制沿X轴，Y轴和Z轴方向移动，从而可达到从细胞培养板孔中快速精准移液的目的。本发明通过利用电控机器手的精密运动来控制清洗步骤和收集样本进行分析，高通量是通过与6孔、12孔、24孔、48孔和96孔培养板相对应的中央多通道自动移液系统来重复实现对细胞培养板多样本的加样和清洗。
[0010]作为优选方案，以上所述的高通量自动化多功能分析工作站，所述的机器手多支管分送系统的功能是通过全自动控制同时从多个样品瓶/多孔培养板吸取具精确体积(0.01 -1毫升)的溶液，用于流出动力学实验中血清稀释和在特定时间点执行对细胞的清洗以及药物/化学处理。
[0011]作为优选方案，以上所述的高通量自动化多功能分析工作站，所述的恒温短期孵化器的温度为25°c或37°C，设有可控自动开关门，可接纳6孔、12孔、24孔、48孔或96孔培养板。所述的细胞清洗和加样平台内配置有滑动板，所述的滑动板可以插入短期恒温孵化器内将培养板推出到细胞清洗和加样平台或在任务完成后将培养板送回恒温短期孵化器内。
[0012]作为优选方案，以上所述的高通量自动化多功能分析工作站，所述的样品过滤平台底座可放置具有和培养板相同标准尺寸的多孔过滤板，利用重力原理过滤去除细胞碎片并收集培养过细胞的调整培养基。
[0013]所述的采样和收集平台上设置有多管管架，多管管架上设有收集试管(瓶)； 所述的电控机器手从样品过滤平台上的多孔过滤板采集样品后，移至采样和收集平台
上的收集试管(瓶)内。
[0014]本发明提供的多功能分析系统，其中短期孵化器能保持恒定温度(25°C，37°C)，维持细胞培养板中的单细胞层；细胞清洗和加样部件可进行各种中间步骤需要的高效清洗，为(预)处理细胞和/或加样做准备；加样在同一平台进行，包括可稀释处理细胞用的生物样品，如临床血清，并将其同步快速加样于培养板孔中。工作站的关键部件是机器手多支管分送系统，同时对多样本执行清洗、样本分配、过滤和收集。在样品过滤平台，细胞和生物样本培养后收集的培养基(含[3H]或荧光标记的胆固醇)被过滤，然后由机器手采样并移至收集试管(瓶)。所有以上操作均按配套的软件控制系统设定进行自动切换，并可自行编程，从而可满足不同实验要求，工作站可自动存入大量样品的编号及分析结果等信息。
[0015]本发明提供的多功能分析系统为一“开放”的技术平台。除了可实时测定胆固醇外流的活性，也可测量其它生物分子的细胞流动活性和其动力学特性，包括蛋白质、脂质、RNA、离子、糖类、激素、维生素、代谢物等。另外，此工作站采取兼容性强的整体设计，能与其它平台或附加模块进行对接。如上述收集的过滤液可送往放射性检测设备或荧光检测仪以量化标记胆固醇的浓度；并可为组学类的研究提供样本前处理，应用非常广泛。
[0016]本发明提供的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，应用范围广泛，如可作为基于以细胞水平的实验方法为基础的的诊断应用工具，包括血清胆固醇流出活性定量，以评估心血管疾病的风险。
[0017]本发明提供的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站也可作为进行细胞水平检测和诊断试验的收费服务平台，包括使用血清样品处理细胞和回收所述的血清样品供后续分析或检测其内的细胞分泌物。
[0018]另外本发明提供的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，还可作为输送和/或筛选天然产物、合成化合物的调节流出和/或细胞分泌效果的工具。作为进一步优选，本发明提供的工作站还可作为输送和/或筛选细胞胆固醇流出的工具。
[0019]另外本发明提供的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，还可作为鉴定用于调节和/或刺激细胞胆固醇流出的候选药物的工具。
[0020]本发明提供的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，可筛选受试化合物对于各种细胞分析物的效应，如脂质，蛋白质，多肽，核酸，离子，维生素和/或进入细胞内的外源性因子如药物，抗生素，和/或杀虫剂。
[0021]有益效果:本发明所提供的高通量自动化和其它生物分子的多功能分析工作站和现有技术相比具有如下优点:
本发明所提供的多功能分析工作站，结构设计合理，操作方便，自动化程度高，检测成本低，应用范围广泛。
[0022]多功能分析系统的主要特点为:
(1)高通量:可对大量的生物/临床标本进行同步测量，从而消除手工操作的滞后时间、并可节省实验时间、人力及试剂，检测成本低；
(2)高精度:本发明提供的多功能分析工作站，检测准确性高和重复性好，从而可避免批间误差，允许更好地比较不同实验室间/不同实验批次的结果，并进行大数据的分析和对比；
(3)通用性:本发明提供的多功能分析工作站，可与其它自动化设备或仪器相连，可用于细胞和系统生物学领域很多不同类型的实验，协助药物筛选，蛋白和基因组学等方面的研究，也可广泛应用于医院、诊所、公司和研究单位。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站的结构示意图。
[0024]图2为本发明多功能工作站的机器手多支管分送系统的结构示意图。【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0026]实施例1
如图1和图2所示，一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，它包括恒温短期孵化器(1)，与恒温短期孵化器(1)相连的细胞清洗和加样平台
(2)、样品过滤平台(3)、与样品过滤平台(3)相连的采样和收集平台(4)、与细胞清洗和加样平台(2)，样品过滤平台(3)以及采样和收集平台(4)均相连的机器手多支管分送系统
(5)，工作站的软件控制系统与显示界面。
[0027]以上所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，所述的机器手多支管分送系统(5)包括多渠道孔矩形板(5-1)，设置在多渠道孔矩形板(5-1)下面的金属接头(5-2),与金属接头(5-2)相连的一次性无菌枪头(5-3),所述的一次性无囷枪头(5_3)由电控机器手控制，可沿X轴，Y轴和Z轴方向移动，所述的金属接头(5-2)连接有多支管系统(5-4)，所述的多支管系统(5-4)上部安装有定量送液泵(5-5)，并且多支管系统(5-4)连接溶液瓶(5-6)，溶液瓶(5-6)上安装有分流阀(5-7)，所述的溶液瓶(5-6)为5个，多支管系统(5-4)和溶液瓶(5-6)之间安装有五通阀(5_8)。
[0028]所述的一次性无菌枪头(5-3)的移液体积为0.01至I毫升，其中I毫升的枪头用来进行样本的清洗，10^200微升的枪头用来进行精确移液以分送待试的血浆或其它样品至细胞培养板的多孔内。
[0029]以上所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，所述的机器手多支管分送系统(5)的功能是通过全自动控制同时从多个样品瓶/多孔培养板吸取0.01~I毫升精确体积的溶液，用于流出动力学实验中血清稀释和在特定时间点执行对细胞的清洗和药物/化学处理。并且所述的机器手多支管分送系统(5)可精确执行以下功能:清洗培养板孔中细胞，稀释血清，快速加样，过滤样品，收集供分析用的培养液。
[0030]以上所述自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，所述的恒温短期孵化器(I)的温度为25°c或37°C，设有可控自动开关门，可接纳6孔、12孔、24孔、48孔或96孔培养板；
并且所述的细胞清洗和加样平台(2)内配置有滑动板，所述的滑动板可以插入短期恒温孵化器(1)内将培养板推出到细胞清洗和加样平台(2)或在任务完成后将培养板送回恒温短期孵化器(1)内。
[0031]以上所述的一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，所述的样品过滤平台(3)的底座设置有和培养板相同标准尺寸的多孔过滤板；
所述的采样和收集平台(4)上设置有多管管架，多管管架上设有收集试管；
所述的电控机器手(5)从样品过滤平台(3)上的多孔过滤板采集样品后，移至采样和收集平台(4)上的收集试管内。
[0032]本发明提供的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，因其快速和高通量的特点，平台的应用范围包括: I)自动化分析胆固醇流出
A.用于基础研究一动脉粥样硬化、脂质和脂蛋白代谢、HDL功能的研究。平台将为以动力学为目的的检测方法和研究提供理想的实验手段，以促进生物医学研究和药物开发。
[0033]B.用于药物研发和临床检测一高通量先导化合物筛选以及临床检测。
[0034]2)自动化分析多种生物分子的细胞流出
用于测量其它生物分子的细胞内外流及其动力学，包括蛋白质、脂质、RNA、离子、糖类、激素、维生素、代谢物等。
3)通用细胞培养/处理工作平台
可与许多生物实验操作系统相连接进行不同类型的细胞和系统生物学实验，如蛋白组学和基因组学方面的研究。
[0035]本发明提供的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站仪器的主要技术性能指标:
每次样本量:1-96 (可多板)
移液通量:0.01-1 ml,高精度移液头(误差 测量时间:(0,5,10分钟至10小时)
测量温度:25 oC, 37°C 系统消毒:紫外线 电源:220 / 110 AC; 50-60HZ 操作温度:18-37 oC
本发明提供的多功能分析系统仪器，可同时检测大量的生物/临床标本，检测时间为几分钟到几个小时，工作站操作准确和可重复性高，从而可减少/消除人为误差，提高检测的准确性。
[0036]实施例2
现以临床检测HDL胆固醇流出为实施例，说明本多功能工作站的工作原理和具体的操作步骤过程。试验细胞株可采用实验室通常应用的哺乳动物巨噬细胞(如J774细胞)，内含[3H]或其它示踪剂，如荧光标记的胆固醇。细胞通常会用生化试剂进行预处理，如通过cAMP激活细胞膜胆固醇转运体ABCA1。以上标记和激活细胞的过程操作相对简易，不在本发明的自动化范围内。
[0037]将试验细胞株按需接种于6、12、24、48或96孔培养板中，在无血清培养基中生长，并让其暴露于恒温短期孵化器(I)的空气中，培养基含有稳定的缓冲溶液，如HEPES或其它缓冲液，细胞在培养板孔中生长的时间可从O到10小时不等，并可以按需过夜或24小时孵化。
[0038]实验开始时清洗和加样平台(2)配置的滑动板插入短期孵化器(I)，将实验培养板移出到清洗和加样平台(2)，通过电控机器手的I ml移液头，用Hank平衡盐溶液冲洗培养板孔中的细胞并重复两次；然后在孔内加入0.2%的牛血清白蛋白(BSA)溶液并放置I小时作封闭之用，以减少背景信号；接着用无血清培养基冲洗培养板(6)孔中的细胞三次。与机器手多渠道孔矩形板(5-1)连接的无菌枪头(5-3)的数量将通过功能单元软件控制，保持和培养板的孔数相匹配。
[0039]在机器手多支管平台，移液头在软件控制下自动切换大小不同的无菌枪头(5-3)，将待试的临床血清样品用含HEPES缓冲液的培养基进行稀释至不同浓度如和1%。
[0040]将稀释过的血浆样品分送至在清洗和加样平台(2)的细胞培养板(6)孔中，并通过滑动板将培养板(6)送入恒温短期孵化器(1)，关闭室门共用孵育4小时(37°C)。如实验目的为动力学(时间依赖性)研究，需在不同的时间点，如0，I, 2，4和8小时将培养板取出并吸取相应孔中的上清培养液，移至过滤平台(3)上的多孔过滤板。
[0041]培养完成后将培养板放回清洗和加样平台(2)，通过无菌枪头(5-3)吸取每孔中的上清培养液并移至过滤平台(3)上的多孔过滤板，多孔过滤板具有和培养板相同的标准尺寸和孔数，利用重力原理过滤去除上清液中可能的细胞碎片。
[0042]电控机器手从过滤平台(3)上的多孔过滤板采集定量的过滤培养基，然后移至收集平台(4)上放置在管架上的微量离心管或其它收集试管(瓶)内，供放射性检测或荧光检测仪之用以量化标记胆固醇的浓度。此浓度值用来计算巨噬细胞的胆固醇流出率。
[0043]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，它包括恒温短期孵化器(I)，与恒温短期孵化器(I)相连的细胞清洗和加样平台(2)、样品过滤平台(3)、与样品过滤平台(3)相连的采样和收集平台(4)、与细胞清洗和加样平台(2)，样品过滤平台(3)以及采样和收集平台(4)均相连的机器手多支管分送系统(5)，工作站的软件控制系统与显示界面。
2.根据权利要求1所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，所述的机器手多支管分送系统(5)包括多渠道孔矩形板(5-1)，设置在多渠道孔矩形板(5-1)下面的金属接头(5-2)，与金属接头(5-2)相连的一次性无菌枪头(5-3)，所述的一次性无菌枪头(5-3)的位置由电控机器手控制，可沿X轴，Y轴和Z轴方向移动，所述的金属接头(5-2)连接有多支管系统(5-4)，所述的多支管系统(5-4)上部安装有定量送液泵(5-5)，并且多支管系统(5-4)连接溶液瓶(5-6)，溶液瓶(5-6)上安装有分流阀(5-7)，所述的溶液瓶(5-6)为5个，多支管系统(5-4)和溶液瓶(5_6)之间安装有五通阀(5-8) ο
3.根据权利要求2所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，所述的机器手多支管分送系统(5)的功能是通过全自动控制同时从多个样品瓶/多孔培养板吸取0.01-1毫升精确体积的溶液，用于流出动力学实验中血清稀释和在特定时间点执行对细胞的清洗以及药物/化学处理。
4.根据权利要求1-3所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，机器手多支管分送系统(5)可精确执行以下功能:清洗培养板(6)孔中细胞，稀释血清或其它待试生物样品，快速加样，过滤样品，收集供分析用的培养液。
5.根据权利要求1所述自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，所述的恒温短期孵化器(I)的温度为25°C或37°C，设有可控自动开关门，可接纳6孔、12孔、24孔、48孔或96孔培养板； 所述的细胞清洗和加样平台(2)内配置有滑动板，所述的滑动板可以插入短期恒温孵化器(I)内将培养板推出到细胞清洗和加样平台(2)或在任务完成后将培养板送回恒温短期孵化器(I)内。
6.根据权利要求1所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站，其特征在于，所述的样品过滤平台(3)的底座设置有和培养板相同标准尺寸的多孔过滤板； 所述的采样和收集平台(4)上设置有多管管架，多管管架上设有收集试管；所述的电控机器手(5)从样品过滤平台(3)上的多孔过滤板采集样品后，移至采样和收集平台(4)上的收集试管内。
7.权利要求1-6任一项所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站作为基于以细胞水平的实验方法为基础的的诊断应用工具，包括血清胆固醇流出活性定量，以评估心血管疾病的风险。
8.权利要求1-6任一项所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站作为进行细胞水平检测和诊断试验的收费服务平台，包括使用血清样品处理细胞和回收所述的处理后的血清/培养基样品供后续分析或检测其内的细胞分泌物。
9.权利要求1-6任一项所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站作为输送和/或筛选天然产物、合成化合物的调节流出和/或细胞分泌效果的工具。
10.权利要求1-6任一项所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站作为输送和/或筛选细胞胆固醇流出的工具。
11.权利要求1-6任一项所述的自动化高通量检测胆固醇以及其它分析物细胞流出的多功能工作站作为鉴定用于调节和/或刺激细胞胆固醇流出的候选药物的工具。
【文档编号】G01N35/00GK103645332SQ201310702939
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】杭渤, 约翰别利茨基 申请人:南京卡迪奥密生物技术有限公司