一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法
【专利摘要】本发明公开一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法；将浓度为1~5×105·孢子·ml-1的烟曲霉放置于无菌玻璃细胞爬片，静置于35~37℃生化培养箱中培养，然后分别在培养的不同时间用阿利新蓝刚果红复合染色染胞外多糖，光镜下观察烟曲霉生物膜胞外多糖的变化。本发明提供的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法实验操作简单、快速准确得出结果和重复性好，适用于临床检验和实验室研究。
【专利说明】一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及以一种用阿利新蓝刚果红染色法检测烟曲霉生物膜胞外多糖的方法。
【背景技术】
[0002]近年来随着恶性肿瘤、HIV、器官移植等患者增加，烟曲霉感染呈现出快速发展趋势,感染率仅次于白色念珠菌,成为免疫低下患者主要的死亡原因。烟曲霉导致的侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)死亡率达到30-100%,耐药是导致治疗失败的一个重要原因，一项临床研究检测了 1385个IA患者的烟曲霉株，发现对唑类耐药的IA患者死亡率达88%，而敏感菌株感染者死亡率为48%。体内外研究发现烟曲霉能形成生物膜，它不但可以在植入的外源性生物材料如人工心脏瓣膜、静脉插管、导尿管等表面生成，还可以在肺部空洞和支气管上皮直接形成。生物膜状态的烟曲霉不仅能形成持续的感染源造成慢性感染，而且还能作为天然屏障抵御抗真菌药，逃避机体免疫，使烟曲霉的耐药性提高几十至几百倍。鉴于生物膜作为烟曲霉耐药的重要机制，国内外对烟曲霉生物膜的研究日益重视。
[0003]研究发现70%_80%的烟曲霉能形成生物膜，而烟曲霉生物膜引起的感染与浮游状态烟曲霉引起的感染的治疗策略是不相同的，因此临床上需要通过检测烟曲霉是否形成生物膜来决定治疗策略。另外，科学实验研究也时常需要反复对生物膜的变化情况进行观测，但是目前公认而常用的形态学观察方法如扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)和激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscrope, CLSM)都存在仪器设备要求高，价格昂贵，扫描电镜检测样品流程要经过取材-漂洗-固定-漂洗-后固定-脱水-干燥-镀膜-扫描等繁琐的步骤，不易普及并难以在临床上推广，因而寻找到一种快速简便可靠的真菌生物膜形态学观察方法有重要的意义。王源等人首先发现阿利新蓝刚果红染色能运用于细菌胞外糖染色，如今此方法已经在细菌生物膜研究中得到广泛运用，但是由于细菌和真菌特点不同，它们所形成的生物膜特性也不完全相同，阿利新蓝刚果红染色法能否运用于烟曲霉生物膜的胞外多糖染色未见报道。临床上急需一种快速准确检测真菌生物膜形态学的方法，这已成为限制真菌生物膜检测进一步发展的一大难题。
【发明内容】
[0004]本发明的目是提供一种快速、简便、可靠的真菌生物膜形态学检测方法，提供一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法，具体检测步骤如下:
1)制备载体将直径为1(T15mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；
2)收集菌株将烟曲霉经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；
3)制备烟曲霉生物膜载体将步骤2)获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35?37°C培养箱培养活化3飞天，用5?IOml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPM1-1640液体培养液调整浓度为1~5X IO5 ?孢子2ml孢子悬液加入步骤I)制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37°C生化培养箱中孵育；
4)阿利新蓝刚果红染色方法
A:配制阿利新蓝和刚果红染液，将2~5g阿利新蓝、97~100ml无菌双蒸水和3~5ml冰乙酸置于烧杯中，并不断搅拌至阿利新蓝颗粒完全溶解，得阿利新蓝染液；将1.5^3g刚果红和95~105ml无菌双蒸水置于烧杯中，并不断搅拌至刚果红颗粒完全溶解，得刚果红染液；
B:用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗步骤3)制备的烟曲霉生物膜载体，去除浮游菌；
C:将步骤A获得的15~20 μ I阿利新蓝染液滴加到步骤B漂洗干净的烟曲霉生物膜载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min ；
D:将步骤C染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，距离红外高温灭菌器3-5cm，使染液彻底干燥并固定；
E:将步骤A获得的15~20μ I 刚果红染液滴加到步骤D固定的烟曲霉生物膜载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min ；
F:将步骤E染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，距离红外高温灭菌器3-5cm,使染液干燥并固定；
G:将步骤F获得的载体用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直至洗脱液无色为止；
5)菌株观察方法
将步骤3)制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2~10个，并按步骤4)进行染色，在普通光镜下放大200倍观察，观察菌株变化。
[0005]以上所述的烟曲霉生物膜生物膜载体静置于35~37°C生化培养箱中培养48飞0h，间隔24h用MOPS缓冲的RPM1-1640换液。
[0006]以上所述的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，距离红外高温灭菌器3-5cm，使染液彻底干燥并固定，待自然冷却至室温，再滴加刚果红染液。
[0007]以上所述的红外高温灭菌器保持温度在65(T700°C。
[0008]以上所述的阿利新蓝为2~3g，无菌双蒸水为97~99ml，冰乙酸3~4ml。
[0009]以上所述的刚果红为1.5~2g，无菌双蒸水为95~100ml。
[0010]以上所述的烟曲霉生物膜载体滴加阿利新蓝染液的量为18~20μ1，静置时间5~8min。
[0011]以上所述的烟曲霉生物膜载体滴加刚果红染液的量为18~20μ 1，静置7~lOmin。
[0012]扫描电镜观察:
(1)将以上制成的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、4811取出，每次取2~10个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定载体2h ；
(2)依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水IOmin；
(3)临界干燥仪干燥；
(4)真空喷镀金粉；
(5)观察和摄片，条件:电压20kV，放大倍数2000倍。[0013]本发明突出的实质性特点和显著的进步是:
1.操作简单
电镜要经过固定，几次脱水，喷金，操作麻烦；而本发明检测方法只需经过两次染色，两次干燥固定后即可扫描，操作方便简单。
[0014]2.快速、准确
扫描电镜固定时间需要两个小时以上，脱水几次，也需要I个小时以上，加上干燥、喷金和观察整个扫描过程下来需要数小时才能完成，而本发明检测方法从取样到得出结果，只需要十几分钟；因为静止培养的烟曲霉生物膜胞外基质90%是由胞外多糖构成的，所以扫描电镜观察到的胞外基质实际上大部分就是胞外多糖。将本发明检测结果与扫描电镜过结果进行对比，发现阿利新蓝刚果红染色方法看到的胞外多糖的变化过程与扫描电镜中观察到的胞外基质的变化过程一致，证实了阿利新蓝刚果红染色的准确性。
[0015]3.重现性好、适用于临床检验
按照本发明检测步骤进行检测，就能快速获得结果。其他检测方法如扫描电镜和激光共聚焦显微镜都存在仪器设备要求高，价格昂贵，而本发明使用的试剂易获得且价格低廉，对仪器设备要求低，检测快速、准确，适用于临床上快速得出结果。解决临床上不能检测烟曲霉株是否形成生物膜，导致盲目用药的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明实施例2阿利新蓝刚果红染色结果在普通光学显微镜放大200倍进行观察，A-8h，B-12h，C-16h，D_20h，E_24h，F_48h。
[0017]图2是本发明实施例2扫描电镜结果放大2000倍观察，A_8h，B_12h，C_16h，D-20h, E-24h, F_48h。
[0018]具体实施方法 实施例1
1.载体:玻璃细胞爬片，直径13_ (江苏海门市盛邦实验器材有限公司)。
[0019]2.菌株:在2012年9月至2013年5月于广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到30株烟曲霉，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。
[0020]3.试验试剂和器材:阿利新蓝8GX (上海源叶生物科技有限公司)、刚果红(天津市光复精细化工研究所)、PDA (北京路桥)、M0PS (Sigma)、RPM1-1640粉(Gibco)、扫描电镜SEMCS-3400N,日本日立)、显微照相系统(MT-2，日本0LYMPAS)、普通光学显微镜(BH22，日本 0LYMPAS)。
[0021]4.制备烟曲霉生物膜载体以灭菌后的玻璃细胞爬片(直径13mm)作为载体。将受试烟曲霉株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于37°C培养，活化3天之后用5ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，20ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为1?5X IO5.Hir1Jf Iml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于37°C生化培养箱中培养48h，间隔24h用MOPS缓冲的RPM1-1640换液。分别于孵育8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取2个，分别进行阿利新蓝刚果红染色和扫描电镜观察。[0022]5.阿利新蓝刚果红染色方法
Cl)配制阿利新蓝和刚果红染液，阿利新蓝染液:阿利新蓝2g、无菌双蒸水97ml、冰乙酸3ml，刚果红染液:刚果红2g，无菌双蒸水IOOml ；
(2)用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；
(3)滴加20μ I阿利新蓝染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置5min ； (4)用红外高温灭菌器加热载体，使染液彻底干燥并固定；
(5)滴加20 μ I刚果红染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置5min ；(6)用红外高温灭菌器加热载体，使染液干燥并固定；
(7)将载体用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直到洗脱液无色为
止;
(8)普通光镜下放大200倍观察，其中孢子和菌丝被染成蓝色，胞外多糖为深红色。
[0023]6.扫描电镜观察:
(1)将以上制成的烟曲霉生物膜于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定2h;
(2)依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水IOmin；
(3)临界干燥仪干燥；
(4)真空喷镀金粉；
(5)观察和摄片，条件:电压20kV，放大倍数2000倍。
[0024]实施例2阿利新蓝刚果红染色结果和扫描电镜结果
将实施例1中制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2个，并进行阿利新蓝刚果红染色，后在普通光学显微镜放大200倍进行观察，结果如图1所示，A:8h时部分孢子萌芽:12h时菌丝延长；C:16h时菌丝继续生长，蓝色的菌丝周围开始有少许深红色的胞外多糖包绕；D:20h时菌丝更多，菌丝与菌丝之间已经有胞外多糖连接在一起；E:24h时菌丝已经形成三维结构，载体表面基本布满胞外多糖，只有顶部的少许菌丝没有被胞外多糖完全覆盖而呈现蓝色；F:48h时菌丝已经形成有序的三维立体结构，胞外多糖基本把菌丝完全覆盖，但是其分布是不均匀的。
[0025]将实施例1制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2个，按步骤6进行处理，后在电镜下放大2000倍观察，结果如图2所示，A:到8h时孢子萌芽；B:12h时菌丝延长，菌丝周围未见胞外基质；C: 16h时菌丝继续生长，部分菌丝周围隐约可见少量胞外基质；D:20h时菌丝较前多，菌丝周围的胞外基质有所增加；E:24h时菌丝形成三维结构，胞外基质未能完全覆盖菌丝；F:48h时胞外基质基本覆盖了菌丝，菌丝轮廓仅隐约可见。
[0026]实施例3
1.载体:玻璃细胞爬片，直径15_ (江苏海门市盛邦实验器材有限公司)。
[0027]2.菌株:在2012年12月至2013年7月于广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到30株烟曲霉，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。
[0028]3.试验试剂和器材与实施例1相同。
[0029]4.制备烟曲霉生物膜载体以灭菌后的玻璃细胞爬片(直径15mm)作为载体。将受试烟曲霉株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35°C培养，活化5天之后用IOml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，25ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为1~5X IO5.ml—1，将Iml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于37°C生化培养箱中培养50h，间隔24h用MOPS缓冲的RPM1-1640换液。分别于孵育8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取2个，分别进行阿利新蓝刚果红染色和扫描电镜观察。
[0030]5.阿利新蓝刚果红染色方法
(1)配制阿利新蓝和刚果红染液，阿利新蓝染液:阿利新蓝5g、无菌双蒸水100ml、冰乙酸5ml,刚果红染液:刚果红3g,无菌双蒸水105ml ；
(2)用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；
(3)滴加15μ I阿利新蓝染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置IOmin ； (4)用红外高温灭菌器加热载体，使染液彻底干燥并固定；
(5)滴加15 μ I刚果红染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置IOmin ; (6)用红外高温灭菌器加热载体,使染液干燥并固定；
(7)将载体用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直到洗脱液无色为止；
(8)普通光镜下放大200倍观察，其中孢子和菌丝被染成蓝色，胞外多糖为深红色。
[0031]6.扫描电镜观察:
(1)将以上制成的烟曲霉生`物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定2h ；
(2)依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水IOmin；
(3)临界干燥仪干燥；
(4)真空喷镀金粉；
(5)观察和摄片，条件:电压20kV，放大倍数2000倍。
[0032]实施例4
1.载体:玻璃细胞爬片，直径IOmm (江苏海门市盛邦实验器材有限公司)。
[0033]2.菌株:在2013年3月至2013年10月于广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到30株烟曲霉，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。
[0034]3.试验试剂和器材与实施例1相同。
[0035]4.制备烟曲霉生物膜载体以灭菌后的玻璃细胞爬片(直径IOmm)作为载体。将受试烟曲霉株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于36°C培养，活化4天之后用8ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，23ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为1~5X IO5.Hir1Jf Iml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于37°C生化培养箱中培养49h，间隔24h用MOPS缓冲的RPM1-1640换液。分别于孵育8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取2个，分别进行阿利新蓝刚果红染色和扫描电镜观察。
[0036]5.阿利新蓝刚果红染色方法
(!)配制阿利新蓝和刚果红染液，阿利新蓝染液:阿利新蓝3g、无菌双蒸水99ml、冰乙酸4ml,刚果红染液:刚果红1.5g,无菌双蒸水95ml ；
(2)用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；
(3)滴加18μ I阿利新蓝染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置8min ； (4)用红外高温灭菌器加热载体，使染液彻底干燥并固定；
(5)滴加18 μ I刚果红染液到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，之后静置7min ； (6)用红外高温灭菌器加热载体,使染液干燥并固定；
(7)将载体用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直到洗脱液无色为止；
(8)普通光镜下放大200倍观察，其中孢子和菌丝被染成蓝色，胞外多糖为深红色。
[0037]6.扫描电镜观察:
(1)将以上制成的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定2h ；
(2)依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水IOmin；
(3)临界干燥仪干燥；
(4)真空喷镀金粉；
(5)观察和摄片，条件:电压20kV，放大倍数2000倍。
【权利要求】
1.一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法，具体检测步骤如下: O制备载体将直径为1(T15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体； 2)收集菌株将烟曲霉经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株； 3)制备烟曲霉生物膜载体将步骤2)获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37°C培养箱培养活化3飞天，用5~IOml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPM1-1640液体培养液调整浓度为1~5X IO5 ?孢子2ml孢子悬液加入步骤I)制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37°C生化培养箱中培养； 4)阿利新蓝刚果红染色方法 A:制备阿利新蓝和刚果红染液，将2~5g阿利新蓝、97~100ml无菌双蒸水和3~5ml冰乙酸置于容器中，并不断搅拌至阿利新蓝颗粒完全溶解，得阿利新蓝染液；将1.5^3g刚果红和95~105ml无菌双蒸水置于容器中，并不断搅拌至刚果红颗粒完全溶解，得刚果红染液； B:用无菌磷酸盐缓冲液漂洗步骤3)制备的烟曲霉生物膜载体，去除浮游菌； C:将步骤A获得的15~20 μ I阿利新蓝染液滴加到步骤B漂洗干净的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min ； D:将步骤C染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定； E:将步骤A获得的15~20μ I刚果红染液滴加到步骤D固定的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min ； F:将步骤E染色的烟曲霉生物膜载体在用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定； G:将步骤F获得的载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直至洗脱液无色为止； 5)菌株观察方法 将步骤3)制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2~10个，并按步骤4)进行染色，在普通光镜下放大200倍观察，观察菌株变化。
2.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述步骤3)制备的烟曲霉生物膜载体静置于35~37°C生化培养箱中培养48飞0h，间隔24h用MOPS缓冲的RPM1-1640换液。
3.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述步骤4)中D用红外高温灭菌器加热，距红外高温灭菌器3~5cm，待染液干燥并固定，让其自然冷却至室温，再滴加刚果红染液。
4.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述步骤4)红外高温灭菌器保持温度在65(T700°C。
5.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述的阿利新蓝为2~3g，无菌双蒸水为97~99ml，冰乙酸3~4ml。
6.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述的刚果红为1.5~2g，无菌双蒸水为95~100ml。
7.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述的烟曲霉生物膜载体滴加阿利新蓝染液的量为18~20μ 1，静置时间5~8min。
8.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于:所述的烟曲霉生物膜载体滴加刚果红染液的量为18~20μ 1，静置7~lOmin。
【文档编号】G01N21/78GK103698326SQ201310720493
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】陈一强, 黄宏, 孔晋亮 申请人:广西医科大学