骨·软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的制作方法

骨·软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供含有非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物作为有效成分的骨·软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂等。
【专利说明】骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂

【技术领域】
[0001]本发明涉及使用非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂等。另外，本发明涉及用于选拔诱导PPARY表达并由此诱导细胞凋亡或脂肪细胞分化的物质来作为骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法。

【背景技术】
[0002]作为骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤，已知有骨中产生的骨巨细胞瘤、软组织中产生的腱鞘巨细胞瘤、色素性绒毛结节性滑膜炎等。
[0003]骨巨细胞瘤是在青年?中老年的膝关节周围好发的良性肿瘤，男女比例为1:1.3?1.5，女性的患病率高。另外，占全部骨肿瘤中的约5%，占良性骨肿瘤中的约20%，虽是良性肿瘤，但复发率高达10?30%，另外，有时存在因肺转移、恶性转化而使治疗困难的情况。依病理所见，多核巨细胞和单核细胞的增生是主体，其间观察到梭形细胞。认为肿瘤的主体并非该多核巨细胞，而是存在于间质的成纤维细胞样的梭形细胞。此外，由于在膝关节、肩关节、手关节等关节附近产生，所以最重要的是如何进行预防复发且保护关节功能的治疗。
[0004]腱鞘巨细胞瘤是由腱鞘、关节、滑液囊的滑膜产生的肿瘤性疾病。基于病变的增殖型，被分为局限型和弥漫型，一般认为，局限型的病变与腱鞘巨细胞瘤的意思相同，弥漫型的腱鞘巨细胞瘤与色素性绒毛结节性滑膜炎的意思相同。腱鞘巨细胞瘤好发于30?50岁的女性，约85%在手指的关节附近、屈肌腱上产生，其次在脚趾产生。也有时浸润到骨内。依病理所见，卵圆形?梭形的组织细胞样单核细胞是主体，多核巨细胞和泡沫细胞中伴随含铁血黄素沉着。治疗依照良性肿瘤而进行肿瘤切除术(单纯摘除术)，复发率被报告为4 ?30%。
[0005]色素性绒毛结节性滑膜炎在40岁以下的相对年轻的成年人中女性略多，膝关节最多，在股、足、肘、肩关节等也产生。关节内发生滑膜的绒毛像、结节样的增殖，屡见关节血症，另外，也浸润到骨内，因此产生二次变形性关节症。依病理所见，滑膜细胞样的单核细胞和多核巨细胞、泡沫细胞、含铁血黄素吞噬细胞、炎症性细胞等混合存在。治疗是在手术中切除肿瘤，但难以完全切除，复发率高达40?50%。
[0006]对于骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤、色素性绒毛结节性滑膜炎，目前均没有开发出手术以外的有效治疗法。
[0007]软骨肉瘤占原发性恶性骨肿瘤的约20%，仅次于骨肉瘤，频率高。组织学上被分成普通型软骨肉瘤、骨膜性软骨肉瘤、间叶性软骨肉瘤、去分化型软骨肉瘤、透明细胞型软骨肉瘤、骨外粘液型软骨肉瘤等。普通型好发于30?50岁，男性多。最多发生在骨盆骨，其次在肋骨.股骨近端.肱骨近端.股骨远端多发。间叶性软骨肉瘤与普通型软骨肉瘤相t匕，好发于年轻的10?30岁人群，好发于颚骨.脊椎.髂骨.肋骨.股骨远端部等。去分化型软骨肉瘤是由低恶性普通型软骨肉瘤产生非软骨性高恶性肿瘤的，两者具有明显的边界并邻接。好发于50?60岁，股骨最多，其次在骨盆?肱骨也多。透明细胞型软骨肉瘤好发于20?50岁，约2/3在肱骨骨头.股骨骨头产生。除此之外，在头盖骨.脊椎.手足的骨头产生。骨外粘液型软骨肉瘤好发于40?50岁，在大腿等四肢的近端部、躯干的深部软组织、四肢末端部、纵隔、后腹膜等软组织中产生。现在，对于这些肿瘤，除手术以外的有效治疗尚未开发出来。
[0008]另夕卜，过氧化物酶体增殖剂激活受体Y (PPAR y:PeroxisomeProliferator-Activated Receptor y )是属于核受体超家族的蛋白质，也作为转录因子发挥功能。PPARY主要分布在脂肪组织，与脂肪细胞分化等相关，除此之外，还发现在巨噬细胞、血管内皮细胞等表达，但是作为其它作用，报告了具有抗糖尿病作用、抗动脉硬化作用、骨代谢、抗肿瘤作用、抗炎作用。例如，报告了 PPARY的活化引起各种肿瘤的细胞凋亡(非专利文献1、2)，确认了 PPARy在乳癌(非专利文献3)、大肠癌(非专利文献4)、肺癌(非专利文献5)等各种癌细胞中表达。另外，报告了 PPARY的活化除受PPARY配体诱导之外，还受非留体抗炎剂诱导，诱导细胞死亡(非专利文献6)。
[0009]然而，目前为止并没有关于以骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤的PPAR Y的表达和PPAR γ为祀的治疗的报告，仅公开了对作为腱鞘巨细胞瘤或骨巨细胞瘤的类似疾病的色素性绒毛结节性滑膜炎具有IL-6产生抑制带来的细胞增殖抑制、抗炎作用的咪唑立宾(专利文献1)。
[0010]专利文献
[0011]专利文献1:TO2008/026729
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1:Jpn J Cancer Res.1999 ；90:75-80
[0014]非专利文献2:FEBS Lett.1999 ；455:135-139
[0015]非专利文献3:B1chem Pharmacol.2011 ；82:464-475
[0016]非专利文献4:Cancer Lett.2010 ；297:65-74
[0017]非专利文献5:Mol Pharmacol.2007 ；72:674-685
[0018]非专利文献6:J Pharmacol Exp Ther.2002 ；302:18-25


【发明内容】

[0019]本发明的目的在于提供一种在骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中诱导PPARY表达且诱导介由PPARY进行的细胞凋亡或脂肪细胞分化的物质作为骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。本发明进一步的目的在于提供一种用于选拔诱导PPARY表达从而诱导细胞凋亡或脂肪细胞分化的物质作为骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法。
[0020]本发明人等确认了在骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中PPARY通常不表达。此外，另一方面确认了在被给予了扎托洛芬的骨巨细胞瘤中PPARY表达，诱导细胞凋亡、向脂肪细胞的分化，其中，所述扎托洛芬属于非甾体抗炎剂之一，具有PPAR y激动活性，所述骨巨细胞瘤属于骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤。
[0021 ] 本发明人等基于上述见解进一步进行了深入研究，结果完成了本发明。
[0022]S卩，本发明提供如下技术等:
[0023][1] 一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂，含有非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物作为有效成分；
[0024][2]根据上述[1]记载的预防或治疗剂，非留体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛；
[0025][3]根据上述[1]记载的预防或治疗剂，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；
[0026][4]根据上述[1]?[3]中任一个记载的预防或治疗剂，骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎；
[0027][5] 一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法，包括以下工序:
[0028](1)将来自骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞在被检物质存在的条件下或不存在的条件下进行培养的工序；
[0029](2)在两个条件下，分别测定PPARY基因的表达，和
[0030](i)细胞凋亡相关基因的表达，或者
[0031](ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达的工序；
[0032](3)与被检物质不存在的条件下进行比较，选择有意地使PPARY基因的表达，和
[0033](i)细胞凋亡相关基因的表达，或者
[0034](ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达改变的被检物质的工序；
[0035][6]根据上述[5]记载的筛选方法，骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎；
[0036][7] 一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗方法，包括向对象给予有效量的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物；
[0037][8]根据上述[7]记载的预防或治疗方法，非留体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛芬；
[0038][9]根据上述[7]记载的预防或治疗方法，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；
[0039][10]根据上述[7]?[9]中任一个记载的预防或治疗方法，骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎；
[0040][11] 一种用于骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗的非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物；
[0041][12]根据上述[11]记载的非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物，非甾体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛芬；
[0042][13]根据上述[11]记载的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；
[0043][14]根据上述[11]?[13]中任一个记载的非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物，骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎。
[0044]通过使用本发明的预防或治疗剂，能够向骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤患者给予来作为外科手术前或后的化学疗法剂，或者向可能患有骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的人给予来作为预防剂。另外，根据本发明，通过选择控制PPARy和细胞凋亡或脂肪细胞分化的被检物质，能够探索骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的新型预防或治疗剂。

【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0046]图2是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞的Tunel检测的结果的图。
[0047]图3是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞中的Tunel阳性细胞的比例的图。
[0048]图4是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞的Caspase3染色的结果的图。
[0049]图5是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞中的Caspase3阳性细胞的比例的图。
[0050]图6是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞的PPAR y染色的结果的图。
[0051]图7是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞中的PPARy阳性细胞的比例的图。
[0052]图8是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞的脂质染色的结果的图。
[0053]图9是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的GCT培养细胞中的脂质阳性细胞的比例的图。
[0054]图10是表示来自被给予扎托洛芬的GCT患者的GCT标本的Tunel检测和Caspase3染色的结果的图。
[0055]图11是表示来自被给予扎托洛芬的GCT患者的GCT标本的PPAR y染色的结果的图。
[0056]图12是表示在含有对乙酰氨基酚、吲哚美辛、双氯芬酸或曲格列酮的培养基中培养的GCT培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0057]图13是表示在含有对乙酰氨基酚、吲哚美辛、双氯芬酸或曲格列酮的培养基中培养的GCT培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0058]图14是表示PPAR γ siRNA对在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的GCT培养细胞的效果的图。
[0059]图15是表示PPAR γ siRNA对在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的GCT培养细胞的效果的图。
[0060]图16是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0061]图17是表示在含有曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0062]图18是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞的Tunel检测的结果的图。
[0063]图19是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞中的Tunel阳性细胞的比例的图。
[0064]图20是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的Tunel检测的结果的图。
[0065]图21是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞中的Tunel阳性细胞的比例的图。
[0066]图22是表不在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞的CaSpaSe3染色的结果的图。
[0067]图23是表不在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞中的Caspase3阳性细胞的比例的图。
[0068]图24是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的CaSpaSe3染色的结果的图。
[0069]图25是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞中的CaSpaSe3阳性细胞的比例的图。
[0070]图26是表不在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞的PPARY染色的结果的图。
[0071]图27是表不在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞中的PPAR Y阳性细胞的比例的图。
[0072]图28是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的PPARY染色的结果的图。
[0073]图29是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培养基中培养的来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞中的PPAR Y阳性细胞的比例的图。
[0074]图30是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的脂质染色的结果的图。
[0075]图31是表示在含有扎托洛芬的培养基中培养的来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞中的脂质阳性细胞的比例的图。
[0076]图32是表示在含有吡格列酮的培养基中培养的GCT培养细胞、来自腱鞘巨细胞瘤的培养细胞、来自色素性绒毛结节性滑膜炎的培养细胞的增殖抑制的结果的图。
[0077]图33是表示扎托洛芬服用前的骨盆部骨巨细胞瘤复发患者的骨盆部的X射线图像的图。
[0078]图34是表示扎托洛芬服用前的骨盆部骨巨细胞瘤复发患者的骨盆部的MRI图像的图。
[0079]图35是表示扎托洛芬服用后经过2个月后的骨盆部骨巨细胞瘤复发患者的骨盆部的MRI图像的图。箭头表示肿瘤的坏死区域。
[0080]图36是表示扎托洛芬服用后经过4个月后的骨盆部骨巨细胞瘤复发患者的骨盆部的MRI图像的图。箭头表示肿瘤的坏死区域。
[0081]图37是表示扎托洛芬给予前的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部矢状面的MRI图像的图。
[0082]图38是表示扎托洛芬给予前的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部横截面的MRI图像的图。
[0083]图39是表示扎托洛芬给予后经过3个月后的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部矢状面的MRI图像的图。箭头表示MRI造影效果的减弱。
[0084]图40是表示扎托洛芬给予后经过3个月后的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部横截面的MRI图像的图。箭头表示MRI造影效果的减弱。
[0085]图41是表示扎托洛芬给予前的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部冠状面的MRI图像的图。
[0086]图42是表示扎托洛芬给予前的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部横截面的MRI图像的图。
[0087]图43是表示扎托洛芬给予后经过2个月后的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部冠状面的MRI图像的图。箭头表示肿瘤的缩小。
[0088]图44是表示扎托洛芬给予后经过2个月后的右膝部色素性绒毛结节性滑膜炎复发患者的右膝部横截面的MRI图像的图。箭头表示肿瘤的缩小。
[0089]图45是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培养基中培养的来自软骨肉瘤的细胞株的增殖抑制的结果的图。
[0090]图46是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培养基中培养的来自软骨肉瘤的细胞株的Caspase3染色的结果的图。
[0091]图47是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培养基中培养的来自软骨肉瘤的细胞株中的Caspase3阳性细胞的比例的图。
[0092]图48是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培养基中培养的来自软骨肉瘤的细胞株的PPARY染色的结果的图。
[0093]图49是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培养基中培养的来自软骨肉瘤的细胞株中的PPAR γ阳性细胞的比例的图。

【具体实施方式】
[0094]本发明人等发现在来自骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤患者的细胞中PPARY不表达，并且发现具有PPARy激动活性的特定物质在骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤中诱导PPARy表达，同时诱导细胞凋亡或脂肪细胞分化。因此，本发明提供一种能够利用PPARy表达诱导活性和PPARy激动活性，在骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤中诱导介由PPARy进行的细胞凋亡或脂肪细胞分化的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤的预防或治疗剂。另外，本发明还提供一种能够利用PPARy表达诱导活性和PPARy激动活性，诱导介由PPARy进行的细胞凋亡或脂肪细胞分化的软骨肉瘤的预防或治疗剂。
[0095]作为可适用本发明的预防或治疗剂的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤，只要是观察到骨?软组织中产生的巨细胞的肿瘤，就没有特别限制。特别优选适用于在骨、关节或腱鞘周边产生巨细胞的肿瘤。另外，作为观察到骨?软组织中产生的巨细胞的肿瘤，优选是良性肿瘤。作为这样的肿瘤，例如，可举出骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤、色素性绒毛结节性滑膜炎等。另外，作为其它的骨.软组织中产生的良性巨细胞性肿瘤，还可举出成软骨细胞瘤、非骨化性纤维瘤、成骨细胞瘤、动脉瘤样骨囊肿等。
[0096]另外，作为可适用本发明的预防或治疗剂的软骨肉瘤，可举出普通型软骨肉瘤、骨膜性软骨肉瘤、间叶性软骨肉瘤、去分化型软骨肉瘤、透明细胞型软骨肉瘤、骨外粘液型软骨肉瘤等。
[0097]或者，本发明的预防或治疗剂也可以用于确认PPARy的表达。作为确认PPARy的表达的肿瘤，可举出乳癌、大肠癌、肺癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤等。
[0098]PPARy是属于核受体超家族的蛋白质，通过形成作为核受体之一的维甲酸X受体(RXR)和异二聚体来识别PPAR反应区(PPRE)，活化下游基因的转录。
[0099]本发明中，作为具有PPARY表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质，可举出非甾体抗炎剂。因此，所谓能够利用PPARy表达诱导活性和PPARy激动活性在骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中诱导介由PPARy进行的细胞凋亡或脂肪细胞分化的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂，在一个实施方式中就是含有非留体抗炎剂作为有效成分的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。在此，所谓非留体抗炎剂，只要是通过阻碍环氧合酶来阻碍前列腺素和血栓素的合成而发挥抗炎作用的化合物，就没有特别限制，例如，可举出扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚、酮洛芬等，优选举出扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛。另外，除了非甾体抗炎剂以外，例如，还可举出噻唑烷衍生物。因此，所谓能够利用PPARy表达诱导活性和PPARy激动活性在骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中诱导介由PPARy进行的细胞凋亡或脂肪细胞分化的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂，就是含有噻唑烷衍生物作为有效成分的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。噻唑烷衍生物被已知活化PPARy，是促进脂联素基因转录的PPARy激动剂。作为噻唑烷衍生物，例如，可举出曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮、利格列酮坐寸。
[0100]本发明中，含有非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物的具有PPARy的表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质的PPARy表达诱导活性能够用后述的公知的方法确认，例如，通过用通常的方法从骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中提取mRNA并使用能够扩增PPARy转录产物的引物而进行逆转录反应和PCR的方法；或者通过将骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤固定或提取细胞粉碎物并使用针对PPARy翻译产物的抗体而利用了抗原抗体反应的方法，能够确认PPARy的表达。PPARy的转录产物、翻译产物是公知的，例如，作为转录产物，基因库(GenBank)的登录号(access1n)N0.BC006811中公开了碱基序列信息，作为翻译产物，基因库的登录号N0.AAH06811中公开了氨基酸序列信息。另外，PPARy激动活性例如可以通过测定下游基因的表达水平或脂质的表达水平来确认。作为PPARy的下游基因，例如，可举出细胞凋亡相关基因、脂肪细胞分化相关基因、动脉硬化相关基因、抗炎相关基因等。在此，作为细胞凋亡相关基因，可以是承担细胞凋亡信号的基因，也可以是细胞凋亡的标记基因。作为细胞凋亡相关基因，例如，可举出Caspase3 (天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶_3)、p53等。作为Caspase3的转录产物，基因库的登录号N0.BC016926中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH16926中公开了氨基酸序列信息。作为p53的转录产物，基因库的登录号N0.NM_000546中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.NP_000537中公开了氨基酸序列信息。另外，作为脂肪细胞分化相关基因，可以是诱发向脂肪细胞的分化的基因，也可以是脂肪细胞分化的标记基因。作为脂肪细胞分化相关基因，例如，可举出 Setd8 (SET domain containing (lysine methyltransferase) 8:含有SET结构域的赖氨酸甲基转移酶)、Setdbl (SET domain, bifurcated 1:组蛋白甲基转移酶)、LPL (Lipoprotein Lipase:脂蛋白脂肪酶)、Leptin(瘦素)、FABP4/aP2 (fattyacid-binding protein-4:脂肪酸结合蛋白-4)、Adiponectin (脂联素)、a2Col6 ( a chain2 of type6 collagen:1V型胶原蛋白a2链)等。作为Setd8的转录产物，基因库的登录号N0.NM_020382中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.NP_065115中公开了氨基酸序列信息。作为Setdbl的转录产物，基因库的登录号N0.BC028671中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH28671中公开了氨基酸序列信息。作为LPL的转录产物，基因库的登录号N0.BC011353中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH11353中公开了氨基酸序列信息。作为L印tin的转录产物，基因库的登录号N0.BC069452中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH69452中公开了氨基酸序列信息。作为FABP4/aP2的转录产物，基因库的登录号N0.BC003672中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH03672中公开了氨基酸序列信息。作为Adiponectin的转录产物，基因库的登录号N0.BC096308中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH96308中公开了氨基酸序列信息。作为a2Col6的转录产物，基因库的登录号N0.BC002483中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH002483中公开了氨基酸序列信息。作为动脉硬化相关基因，例如，可举出ATlR(ang1tensin II receptor 1:血管紧张素II的I型受体)等。作为AT1R的转录产物，基因库的登录号N0.BC068494中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.AAH68494中公开了氨基酸序列信息。作为抗炎相关基因，例如，可举出NF- κ B (nuclear factor kappa-1 ight-chain-enhancer of activated B cells:核因子活化B细胞κ轻链增强子)等。作为NF-κ B的转录产物，基因库的登录号N0.NM_003998中公开了碱基序列信息，另外，作为其翻译产物，基因库的登录号N0.NP_003989中公开了氨基酸序列信息。另外，作为脂质，只要是脂肪细胞或组织中所含的脂质，就没有特别限制，可举出磷脂、糖脂、脂蛋白、中性脂肪、神经酰胺等。
[0101]具体而言，PPARy表达诱导活性的测定可以通过从细胞中制备RNA(例如:总RNA、mRNA)组分，检测该组分中含有的PPARy基因的转录产物来实施。RNA组分的制备可以采用胍-氯化铯超速离心法、AGPC法等公知的方法进行，也可以使用市售的RNA提取用试剂盒(例如:RNeasy Mini Kit ;QIAGEN制等)，从少量的细胞迅速且简便地制备高纯度的总RNA。作为检测RNA组分中的该基因的转录产物的手段，例如，可举出利用杂交(Northern印迹、斑点印迹、DNA芯片解析等)的方法、或者利用PCR(RT-PCR、竞争PCR、实时PCR等)的方法等。从能够由微量试样迅速且简便地定量精确地检测该基因的表达变化的角度考虑，优选竞争PCR、实时PCR等定量PCR法。
[0102]利用Northern印迹或斑点印迹杂交时，PPARy基因的检测例如可以使用能够特异性地检测出该基因的转录产物的核酸探针来进行。PPARy表达诱导活性的测定中使用的核酸探针是包含约15个碱基以上、优选为约18?约500个碱基、更优选为约18?约200个碱基、进一步优选为约18?约50个碱基的连续的该基因的一部分或全部的多核苷酸或包含其互补序列的多核苷酸。作为PPARy基因的一部分或全部，可举出上述公知的PPARy的碱基序列的一部分或全部。该多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合体。可优选举出DNA。另外，作为探针使用的多核苷酸可以是双链，也可以是单链。在双链的情况下，可以是双链DNA、双链RNA或者DNA:RNA的杂交体。在单链的情况下，可以使用反义链。
[0103]另外，PPARy表达诱导活性的测定中使用的核酸探针是PPARy基因的转录产物中含有在严格条件下杂交的核苷酸序列的多核苷酸。杂交可以根据本身公知的方法或者基于该公知方法的方法，例如分子克隆(Molecular Cloning)第2版(J.Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989)中记载的方法等进行。作为严格条件，例如，可举出在6 XSSC (sodium chloride/sodium citrate:氯化钠/梓檬酸钠)中于45°C进行杂交反应后，在0.2XSSC/0.1% SDS中于65 °C进行一次以上的清洗等。本领域技术人员通过适当地变更杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针的长度、错配数、杂交反应的时间、清洗液的盐浓度、清洗的温度等，能够容易地调节成所希望的严格度。
[0104]作为能够检测PPAR γ基因的表达的探针而发挥功能的核酸可以通过如下方式获得，即，使用能够扩增该基因的转录产物的一部分或全部的后述的引物对(Primer Set),以来自个体(例如:人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等，优选人)的所有细胞[例如，肝细胞、脾细胞、神经细胞、胶质细胞、胰岛β细胞、骨髓细胞、系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、Τ细胞、Β细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞或间质细胞、或者这些细胞的祖细胞、干细胞或癌细胞等]或者存在这些细胞的所有组织[例如，脑、脑的各部位(例如，嗅球、杏仁核、大脑基底核、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、脑垂体、胃、胰腺、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肺、消化道(例如，大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、下颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、脂肪组织、骨骼肌等]的cDNA或基因组DNA为模板并利用PCR法扩增所希望的长度的核酸，或者从来自上述细胞.组织的cDNA或基因组DNA文库，利用菌落或菌斑杂交等将上述基因或cDNA克隆，根据需要使用限制酶等形成适当长度的片段而获得。杂交例如可以根据分子.克隆(Molecular Cloning)第2版(上述)中记载的方法等进行。或者，该核酸也可以通过基于上述PPARy基因的碱基序列信息，使用市售的DNA/RNA自动合成仪等化学合成该碱基序列和/或其互补链序列的一部分或全部来获得。另外，也可以通过在硅、玻璃等固相上直接原位(在芯片上)合成该核酸，制成该核酸被固相化的芯片。
[0105]另外，作为能够扩增PPARy基因的转录产物的一部分或全部的引物而发挥功能的核酸，可以通过基于上述PPARy基因的碱基序列信息，使用市售的DNA/RNA自动合成仪等化学合成该碱基序列及其互补链序列的一部分来获得。
[0106]为了能够检测?定量靶核酸，优选利用标记剂标记该核酸。作为标记剂，例如，可使用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，例如，可使用〔32p〕、〔3h〕、〔14C〕等。作为酶,优选稳定且比活性大的酶,例如,可使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，例如，可使用荧光胺、异硫氰酸荧光素等。作为发光物质，例如，可使用鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、光泽精等。此外，也可以在探针与标记剂的结合中使用生物素-(链霉)抗生物素蛋白。
[0107]利用Northern印迹杂交时，可以将如上所述制备的RNA组分用凝胶电泳分离后，转印到硝酸纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯等的膜上，在含有如上所述制备的标记探针的杂交缓冲液中，使之特异性杂交后，用适当的方法以带(band)为单位测定与膜结合的标记量，由此测定PPARy基因的表达量。在斑点印迹的情况下，将点样有RNA组分的膜同样地用于杂交反应，测定斑点的标记量，由此测定该基因的表达量。
[0108]利用DNA芯片解析时，例如，由如上所述制备的RNA组分利用逆转录反应合成导入了 T7启动子等适当的启动子的cDNA，进一步使用RNA聚合酶来合成cRNA (此时，通过使用以生物素等标记的单核苷酸为基质，可得到被标记的cRNA)。通过使该标记cRNA与将上述探针固相化的芯片接触而使之进行杂交反应，测定与固相上的各探针结合的标记量，由此能够测定PPARy基因的表达量。
[0109]根据其它优选的实施方式，作为测定PPARY基因的表达的方法，可使用定量PCR法。作为定量PCR，例如，有竞争PCR、实时PCR等。
[0110]作为在PCR中被用作引物的寡核苷酸组，例如，可举出能够特异性检测上述PPARy基因的转录产物的核酸引物。一个优选的方式中，作为在本发明的检查方法中使用的核酸引物，可举出具有约15个碱基以上、优选为约15?约50个碱基、更优选为约15?约30个碱基、进一步优选为约15?约25个碱基的连续的核苷酸序列的长度且以扩增约lOObp?数kbp的DNA片段的方式设计的与多核苷酸(正义链)序列互补的多核苷酸，以及能够与具有与上述多核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸(反义链)杂交的多核苷酸的寡核苷酸组。
[0111]竞争RT-PCR是指将能够被可扩增目的DNA的弓丨物对扩增的已知量的其它模板核酸作为竞争子(competitor)并使之在反应液中共存而发生竞争性扩增反应，通过比较扩增产物的量，计算目的DNA的量的方法。因此，利用竞争RT-PCR时，除使用上述引物对之夕卜，还使用能够用该引物组扩增且扩增后能够与靶核酸(即，PPARy基因的碱基序列信息的转录产物)的扩增产物区别(例如，扩增尺寸不同、限制酶处理片段的电泳图谱不同等)的已知量的竞争子核酸。靶核酸和竞争子核酸争夺引物而竞争性地发生扩增，扩增产物的量比反映原模板的量比。竞争子核酸可以是DNA，也可以是RNA。在DNA的情况下，利用逆转录反应由如上所述制备的RNA组分合成cDNA后，在上述引物组和竞争子共存的条件下进行PCR即可，在RNA的情况下，向RNA片段中添加竞争子而进行逆转录反应，再添加上述引物组而实施PCR即可。在后者的情况下，由于还考虑到逆转录反应的效率，所以能够推定原mRNA的绝对量。
[0112]另一方面，实时PCR是使用荧光试剂来实时监测扩增量的方法，需要将热循环仪和荧光分光光度计一体化的装置。这样的装置已市售。根据所使用的荧光试剂，存在几种方法，例如，嵌入法、TaqMan?探针法、分子信标(Molecular Beacon)法等。均是在利用逆转录反应由如上所述制备的RNA组分合成cDNA后，将上述引物组和如下荧光试剂添加到PCR反应体系中的方法，所述荧光试剂是SYBR Green 1、溴化乙锭等通过与双链DNA结合而产生荧光的试剂(嵌入剂)、将能够作为上述探针使用的核酸(其中，该核酸在扩增区域内与靶核酸杂交)的两端分别用荧光物质(例如:FAM、HEX、TET、FITC等)和消光物质(例如:TAMRA、DABCYL等)修饰的试剂(TaqMan?探针或分子信标探针)等荧光试剂(探针)。嵌入剂与被合成的双链DNA结合并通过照射激发光而产生荧光，因此通过测定荧光强度，能够监测扩增产物的生成量，由此推定原模板cDNA量。TaqMan?探针是将两端分别用荧光物质和消光物质修饰而得的能够在靶核酸的扩增区域杂交的寡核苷酸，退火时与靶核酸杂交，但是因消光物质的存在而不发出荧光，在延伸反应时利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性而被分解，荧光物质游离，由此发出荧光。因此，通过测定荧光强度，能够监测扩增产物的生成量，由此能够推测原模板cDNA量。分子信标探针是将两端分别用荧光物质和消光物质修饰而得的能够在靶核酸的扩增区域杂交并且能够形成发卡型二级构造的寡核苷酸，形成发卡构造时因消光物质的存在而不发出突光，退火时与祀核酸杂交，突光物质与消光物质的距离变宽，由此发出荧光。因此，通过测定荧光强度，能够监测扩增产物的生成量，由此能够推定原模板cDNA量。由于实时RT-PCR能够实时监测PCR的扩增量，所以不需要电泳，能够更迅速地解析PPAR y基因的表达。
[0113]或者，细胞中的PPARY基因的表达可以通过从该细胞提取蛋白质组分，检测该组分中含有的该基因的翻译产物(即，PPARy)来实施。PPARy的检测也可以通过使用特异性识别该蛋白质的抗体，利用免疫学测定法(例如:ELISA、FIA、RIA、免疫印迹法等)进行，也可以通过利用公知的方法测定该蛋白质所具有的活性来进行。或者，该蛋白质的检测也可以利用MALD1-T0FMS等质量分析法进行。
[0114]特异性识别PPARY的抗体可以通过使用该蛋白质所含的多肽、具有其抗原性的部分肽的全部或具有相当于表位的部分的部分肽作为免疫原，利用现有的一般制造方法制造。本说明书中，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)等天然型抗体，能够使用转基因技术制造的嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及它们的结合性片段，但不限于这些。优选抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或它们的结合性片段。结合性片段是指具有特异性结合活性的上述抗体的一部分的区域，具体而言，例如可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb 等(Exp.0pin.Ther.Patents, Vol.6, N0.5, p.441-456,1996)。抗体的类型没有特别限定，也包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意具有同型的抗体。优选为IgG或IgM，如果考虑到精制的容易性等，则更优选IgG。
[0115]在将各免疫学测定法用于PPARy表达诱导活性的测定时，不需要特别的条件、操作等的设定。在各方法的通常的条件、操作方法中加入本领域技术人员的通常技术考虑来构建PPARy的测定体系即可。关于这些常规技术手段的详细内容，可以参照总论、专著等。例如，可以参照入江宽编“放射免疫分析”(讲谈社，昭和49年发行)、入江宽编“放射免疫分析续”(讲谈社，昭和54年发行)、石川荣治等编“酶免疫测定法”(医学书院，昭和53年发行)、石川荣治等编“酶免疫测定法”(第2版)(医学书院，昭和57年发行)、石川荣治等编“酶免疫测定法”(第3版)(医学书院，昭和62年发行)、“酶学方法(Methods in ENZYMOLOGY，，Vol.70 (免疫学技术(Immunochemical Techniques) (PartA))、“酶学方法”Vol.73(免疫学技术(PartB))、“酶学方法”Vol.74 (免疫学技术(PartC))、“酶学方法” Vol.84(免疫学技术(PartD:特异性免疫(Selected Immunoassays)))、“酶学方法” Vol.92 (免疫学技术(PartE:单克隆抗体和常规免疫分析法(Monoclonal Antibodiesand General Immunoassay Methods)))、“酶学方法” Vol.121 (免疫学技术(Part1:杂交瘤技术和单克隆抗体(Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)))(以上为Academic Press公司发行)等。
[0116]另外，PPARy激动活性的测定与上述PPARy表达诱导活性的测定同样地可以通过从细胞制备RNA组分、蛋白质组分或脂质组分，检测该组分中含有的PPARy的下游基因(例如，细胞凋亡相关基因、脂肪细胞分化相关基因、动脉硬化相关基因、抗炎相关基因等)的转录产物、翻译产物或脂质来实施。RNA组分、蛋白质组分的制备方法及其检测方法可以按照上述的PPARy表达诱导活性的测定方法。作为脂质的制备方法，可以使用公知的方法制备，例如，加入为试样的数倍量的氯仿-甲醇混合物等溶剂而从含有脂质的试样中提取的Folch法、加入数倍量的氯仿-甲醇-水混合物等溶剂来进行提取的Bligh-Dyer法等。另外，作为分离出的脂质的检测方法，可以采用液相色谱法(LC)，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)等公知的方法检测。或者，也可以采用直接检测脂肪细胞、组织所含有的脂质的方法。能够在这样的方法中使用的试剂等已市售，例如，可以使用HCS LipidTOX磷脂症/脂质症检测试剂盒(Invitrogen公司)等。
[0117]可适用本发明的含有具有PPARY的表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质、优选含有非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物作为有效成分的骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防/治疗剂的人，例如可举出临床诊断患有骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的患者、疑似患者、或者被预测将来发病的人。另外，以骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤为原发病灶的转移癌也优选适用本发明的治疗剂。作为这样的转移癌，可举出肺癌、大肠癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、血液肿瘤等。
[0118]本发明的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂根据需要可以以包有糖衣的片剂、胶囊剂、酏剂、微胶囊剂等形式经口使用，或者以与水或其以外的药学上允许的液体的无菌性溶液、或悬浊液剂等注射剂的形式非经口使用。该治疗或预防齐U可以通过与生理学上被认可的载体、矫味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、粘合剂等以通常认为的制剂实施所要求的单位用量形态进行混合而形成制剂。这些制剂的有效成分量可考虑后述的给予量而适当地选择。
[0119]作为能够在片剂、胶囊剂等中混合的添加剂，例如，使用明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯树胶之类的粘合剂，结晶纤维素之类的赋形剂，玉米淀粉、明胶、海藻酸等之类的膨化剂，硬脂酸镁之类的润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂，薄荷、白珠油或樱桃之类的矫味剂等。在制剂单位形态为胶囊的情况下，上述类型的材料中可以进一步含有油脂之类的液态载体。用于注射的无菌组合物可以根据使注射用水之类的媒介物中的活性物质、胡麻油、椰子油等之类的产自天然的植物油等溶解或悬浮等通常的制剂实施方式设计处方。
[0120]作为注射用的水性液，例如，可举出生理盐水、含葡萄糖或其它辅助药的等渗液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，也可以并用适当的溶解辅助剂，例如，醇(例如，乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非离子型表面活性剂(例如，聚山梨酯80?、HC0-50等)等。作为油性液，例如，可举出芝麻油、大豆油等，可以并用苯甲酸苄酯、苯甲醇等作为溶解辅助剂。另外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、舒缓剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白，聚乙二醇等)、保存剂(例如，苯甲醇、苯酚等)、抗氧化剂等。所制备的注射液通常填充到适当的安瓿中。
[0121]由此制得的制剂安全且低毒性，因此可以给予给例如哺乳动物(例如，人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。
[0122]本发明的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的治疗或预防剂的给予量因骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的严重度、给予对象、给予途径等不同而异，例如，经口给予时，一般对于成人(体重60kg)而言，一日约0.lmg?约lOOmg，优选为约1.0?约50mg，更优选为约1.0?约20mg。非经口给予时，该治疗/预防剂的给予量也因给予对象、严重度等不同而异，例如，以注射剂的形式给予成人(体重60kg)时，一日约0.01?约30mg左右，优选为约0.1?约20mg左右，更优选为约0.1?约10mg左右。给予对象为人以外的动物时，可以投入换算成体重60kg的量。
[0123]另外，至今为止，作为骨巨细胞瘤的治疗方法，利用外科手术进行的患部除去成为主流，通过切除患部的肿瘤并使用同种骨、自体骨、人工骨填充骨缺失部而进行治疗。然而，就这种方法而言，肿瘤的复发率高，在反复复发的过程中孕育着转移、恶性转化的危险性。通过使在填充骨缺失部时使用的人工骨含有本发明的具有PPAR γ的表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质、优选含有非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物，可以期待骨巨细胞瘤复发的预防效果。因此，本发明提供含有具有PPARy的表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质、优选含有非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物的人工骨。
[0124]本发明的人工骨所含的具有PPAR y的表达诱导活性且具有PPAR y激动活性的物质、优选非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物可以使用如上所述的物质。
[0125]作为本发明的人工骨所使用的材料，可举出公知的整形外科用生物体材料，例如，金属材料、陶瓷材料、高分子材料、蛋白质材料或它们的复合材料。
[0126]作为上述金属材料，例如、可举出钛、钛合金、不锈钢、钴-铬合金等。
[0127]作为上述陶瓷材料，例如，可举出氧化铝陶瓷、单晶氧化铝陶瓷、氧化锆陶瓷等生物惰性陶瓷、生物玻璃(Hench等，B1med.Master.Symp.，2，117 (1972))、羟基磷灰石(青木等，Ceramics, 10,469 (1975))、憐灰石-娃灰石(AW)-玻璃(Bull.1nst.Chem.Res.KyotoUn1.，60，260 (1982))、TCP 陶瓷(Ca3 (P04)2)等生物活性陶瓷。
[0128]作为上述高分子材料，例如，可举出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、高密度聚乙烯(HDP)、硅橡胶、特氟龙(Teflon)、聚酯、聚乳酸、PVA水凝胶等。
[0129]作为上述蛋白质材料，例如，可举出胶原蛋白、纤维蛋白、甲壳素、壳聚糖等。
[0130]将具有PPARY的表达诱导活性且具有PPARY激动活性的物质、优选非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物与人工骨材料混合或被覆而成的本发明的人工骨中，具有PPAR y的表达诱导活性且具有PPARy激动活性的物质、优选非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物的含量为约1%?约20%，优选为约15%?约20%。
[0131]如上所述，本发明人等发现具有PPARY激动活性的特定的化合物在骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中诱导PPARy表达，同时诱导细胞凋亡或脂肪细胞分化。因此，本发明还提供骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法。
[0132]本发明的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法包括以下工序。
[0133](1)在被检物质存在的条件下或不存在的条件下培养来自骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞的工序；
[0134](2)在两个条件下，分别测定PPARy基因的表达，和
[0135](i)细胞凋亡相关基因的表达，或者
[0136](ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达的工序；
[0137](3)与被检物质不存在的条件下进行比较，选择有意地使PPARY基因的表达，和
[0138](i)细胞凋亡相关基因的表达，或者
[0139](ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达改变的被检物质的工序。
[0140]本发明的筛选方法中使用的来自骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞可以是来自临床被诊断患有骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的患者的原代培养细胞，也可以是已经被建立细胞系的细胞。细胞的细胞系建立可以根据该领域通常实施的方法、公知文献来制备。另外，来自骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞可以是包含该细胞的任意组织(例如，滑膜、关节、软骨等)，就组织、脏器等而言，可以将它们从生物体中分离出来并培养，或者向生物体本身给予被验物质，经过一定时间后分离出这些生物体试样。
[0141]本发明的筛选方法中，在来自上述骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞为培养细胞时，在被检物质存在的条件下或不存在的条件下培养该细胞。
[0142]本发明中，被检物质并没非被特别限制，例如，可使用肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，这些化合物可以是新的化合物，也可以是公知的化合物。其中，优选使用具有PPARy的表达诱导活性且具有PPARy的激动活性的物质。作为这样的被检物质，可举出非甾体抗炎剂。作为非甾体抗炎齐U，与上述同样地举出扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛等。另外，除了非留体抗炎剂以外，例如，可与上述同样地举出噻唑烷衍生物。作为噻唑烷衍生物，例如，举出罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、巴格列酮、利格列酮等。
[0143]培养只要在适当的细胞培养基材上进行即可，例如，可举出烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿(dish)、陪替氏培养皿、组织培养用培养皿、多孔培养皿、微型板(microplate)、微孔板(micro well plate)、多级板(multiplate)、多孔板(multi well plate)、腔室玻片、平皿(schale)、管、托盘、培养袋、滚瓶。
[0144]就上述来自骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞而言，只要使以单细胞的形式悬浮的该细胞悬浮在培养基中并播种在上述的细胞培养基材上即可。培养通常是在5% C02/95%空气、37°C的培养箱内培养到成为汇合为止。
[0145]被验物质与上述细胞的接触在测定PPARy基因和细胞凋亡相关基因的表达时，可以通过如下方式来实施，即，例如向适合该细胞的细胞凋亡的培养基(例如,含有约5?20%的胎牛血清(FBS)的最少必需量培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等)和各种缓冲液(例如，HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris-HCl缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液等)中添加被验物质，使其与细胞接触一定时间。被添加的被验物质的浓度因化合物的种类(溶解度、毒性等)不同而异，例如，在约1 μ Μ?约1000 μ Μ、优选为约5 μ Μ?约500 μ Μ、更优选为约50 μ Μ?约200 μ Μ的范围适当地选择。作为接触时间，例如，可举出约1小时?约48小时，优选为约5小时?36小时，更优选为约10小时?24小时。另外，测定PPARy基因和脂肪细胞分化相关基因或脂质的表达时，可以通过如下方式来实施，即，例如向适合该细胞的脂肪细胞分化的无血清培养基(最小必需量培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等)和各种缓冲液(例如，HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris-HCl缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液等)中添加被验物质，使其与细胞接触一定时间。另外，上述培养基中根据需要可以适当地加入血清(例如，约5?20%的胎牛血清(FBS))、脂肪细胞的诱导辅助剂(例如，异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素等)。此外，作为其它的添加剂，可举出转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、皮质醇、asc、泛酸钙、生物素等。另外，可以使用公知的市售的脂肪细胞分化用试剂盒。被添加的被验物质的浓度因化合物的种类(溶解度、毒性等)不同而异，例如，在约ΙμΜ?约ΙΟΟΟμΜ、优选为约5μΜ?约500 μ Μ、更优选为约50 μ Μ?约200 μ Μ的范围适当地选择。作为接触时间，例如，可举出约1小时?约48小时，优选为约5小时?36小时，更优选为约10小时?24小时。脂肪细胞分化诱导时，可以在与被检物质的接触的同时在脂肪分化诱导培养基中培养，也可以在与被检物质接触一定时间后，在脂肪分化诱导培养基中培养。
[0146]本发明的筛选方法中，在被检物质存在的条件下或不存在的条件下，分别测定PPARy基因的表达和⑴细胞凋亡相关基因的表达或(ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达。PPARy基因的表达可以根据上述的PPARy表达诱导活性的测定方法测定。另外，关于细胞凋亡相关基因、脂肪细胞分化相关基因、脂质的表达，也可以根据上述的PPARy激动活性的测定方法测定。
[0147]如后述的实施例所示，在骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中没有观察到PPARy的表达。另外，通过具有PPARy激动效果的非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物的给予或接触，确认了 PPARy的诱导表达。并且，伴随着该诱导表达，能够确认Caspase3或脂质的表达。因此，上述筛选中，能够介由PPARy在骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤中诱导细胞凋亡或脂肪细胞分化，能够选拔骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。
[0148]根据PPAR Y基因和细胞凋亡相关基因、脂肪细胞分化相关基因、脂质的表达水平的比较结果，被给予了被检物质的细胞中的该基因或脂质的表达水平与未给予的细胞相比相对较高(或较低)时，能够选拔该被检物质作为介由PPARy进行的骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。例如，只要与被验物质不存在的条件下的情况比较在统计上有意义即可，可以选择PPARy基因、细胞凋亡相关基因、脂肪细胞分化相关基因、脂质的表达量的量增加(或减少)约20%以上、优选为约30%以上、更优选为约50%以上的被验物质作为骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂。
[0149]实施例
[0150]以下，通过实施例和参考例对本发明进一步具体说明，但是本发明不限于这些实施例和参考例。
[0151]实施例1骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞中添加扎托洛芬后的细胞增殖抑制和细胞凋亡的解析
[0152]用96孔的培养板培养GCT培养细胞(easel:右股骨远端部骨巨细胞瘤患者，20?30岁；case2:右股骨远端部骨巨细胞瘤患者，20?30岁)，以各浓度(5、10、50、100、200 μ Μ)添加扎托洛芬，24 小时后用 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo 公司)发色，3小时后测定450nm的吸光度(图1)。其结果，能够确认细胞增殖是扎托洛芬浓度依赖性地被抑制。
[0153]另外，在腔室盖玻片上培养上述easel的GCT培养细胞，24小时后以各浓度(100、200 μ Μ)添加扎托洛芬。在8小时后和24小时后，用4%多聚甲醛固定，进行了 Caspase3的染色和Tunel检测，对于有无细胞凋亡进行解析。观察是用Keyence公司的荧光显微镜(BZ-9000)进行，定量观察各浓度下的阳性图像(图2-5)。其结果，能够确认Tunel阳性率和Caspase3阳性率是扎托洛芬浓度和给予小时依赖性地上升。
[0154]实施例2骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞中添加扎托洛芬后的PPARy免疫染色
[0155]在腔室盖玻片上培养上述easel的GCT培养细胞，24小时后，以各浓度(10、50、100、200μΜ)添加扎托洛芬。24小时后，用4%多聚甲醛固定，进行了 PPARy的染色。观察是用Keyence公司的荧光显微镜(BZ-9000)进行，定量观察各浓度下的阳性图像(图6、7)。其结果，对照组中PPARy的表达为约15%，但是能够确认PPARy的表达是扎托洛芬浓度依赖性地亢进。
[0156]实施例3骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞中添加扎托洛芬后的GCT培养细胞的脂肪细胞分化的解析
[0157]报告显示PPARY是脂肪细胞分化所必需的转录因子。因此，在腔室盖玻片上培养上述easel的GCT培养细胞，成为汇合时，以各浓度(10、50、100μΜ)添加扎托洛芬。24小时后进一步在脂肪分化诱导培养基(STREMPRO Adipogenesis Differentiat1n Kit:脂肪细胞分化试剂盒；Invitrogen 公司)培养 7 ?14 天，用 HCS LipidTOX Green neutral lipidstain (Invitrogen公司)解析向脂肪细胞的分化(图8、9)。其结果，对照组中有少量HCSLipidTOX Green的阳性图像，但是能够确认HCS LipidTOX Green的阳性图像是扎托洛芬浓度依赖性地亢进。
[0158]实施例4来自被给予了扎托洛芬的骨巨细胞瘤(GCT)患者的细胞的细胞凋亡的解析
[0159]对针对由肿瘤引起的疼痛，将作为扎托洛芬片的Soleton片80(通用名称:扎托洛芬80mg，NIPPON CHEMIPHAR株式会社)以3片/日给予约28天后执行手术的30?40岁男性的手术切除标本和作为对象的未给予扎托洛芬的骨巨细胞瘤的手术切除标本进行Caspase3的染色和Tunel检测，对于有无细胞凋亡进行解析。观察是用Keyence公司的突光显微镜(BZ-9000)进行的(图10)。其结果，来自未给予扎托洛芬的GCT患者的的细胞中几乎不能确认Tunel阳性细胞和CaSpaSe3阳性细胞，但是在来自被给予了扎托洛芬的患者的细胞中，能够确认Tunel阳性细胞和Caspase3阳性细胞。
[0160]实施例5来自被给予了扎托洛芬的骨巨细胞瘤(GCT)患者的细胞的PPARy免疫染色
[0161]对针对由肿瘤引起的疼痛，将作为扎托洛芬片的Soleton片80 (通用名称:扎托洛芬80mg，NIPPON CHEMIPHAR株式会社)以3片/日给予约28天后执行手术的30?40岁男性的手术切除标本和作为对象的未给予扎托洛芬的骨巨细胞瘤的手术切除标本进行PPARy的染色，解析PPARy的表达。观察是用Keyence社的荧光显微镜(BZ-9000)进行的(图11)。其结果，在来自未给予扎托洛芬的GCT患者的细胞中几乎不能确认PPARy表达细胞，但是在来自被给予了扎托洛芬的患者的细胞中，能够确认PPAR Y表达细胞，进而确认了脂肪分化。
[0162]实施例6骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞中添加非留体抗炎剂后的细胞增殖抑制的解析
[0163]用与实施例1同样的方法，培养GCT培养细胞(casel、case2),以各浓度添加非甾体抗炎剂(对乙酰氨基酚、吲哚美辛或双氯芬酸)或曲格列酮来测定450nm的吸光度(图12、13)。其结果，能够确认细胞增殖是非留体抗炎剂浓度依赖性地被抑制。
[0164]实施例7 PPAR y siRNA对添加非甾体抗炎剂后的骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞的效果
[0165]用96孔的培养板培养细胞(casel、case2)，仅使PPAR y siRNA、阴性对照组siRNA和转染试剂(Thermo Scientific DharmaFECT:Thermo Scientific 公司)反应 48 小时之后，用通常的培养液培养48小时，其后以200 μ Μ添加扎托洛芬或以60 μ Μ添加曲格列酮，72小时后用Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo公司)发色，3小时后测定450nm的吸光度(图14、15)。其结果，PPARy siRNA添加组中，能够确认扎托洛芬的效果被显著地抑制。
[0166]实施例8来自腱鞘巨细胞瘤(GCT of tendon sheath)的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎(弥漫型巨细胞瘤)的细胞中添加非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物后的细胞增殖抑制及细胞凋亡的解析
[0167]与实施例1同样地培养腱鞘巨细胞瘤培养细胞(右膝腱鞘巨细胞瘤患者，30?40岁)和色素性绒毛结节性滑膜炎培养细胞(左膝色素性绒毛结节性滑膜炎患者，30?40岁)，以各浓度添加扎托洛芬或曲格列酮，测定吸光度(图16、17)。其结果，能够确认细胞增殖是扎托洛芬或曲格列酮浓度依赖性地被抑制。
[0168]另外，与实施例1同样地对腱鞘巨细胞瘤培养细胞和色素性绒毛结节性滑膜炎培养细胞进行Caspase3的染色和Tunel检测，解析有无细胞凋亡(图18-25)。其结果，能够确认以400 μ Μ浓度添加了扎托洛芬或以200 μ Μ浓度添加了曲格列酮的细胞与对照组相t匕，Tunel阳性率和Caspase3阳性率上升。
[0169]实施例9来自腱鞘巨细胞瘤(GCT of tendon sheath)的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎(弥漫型巨细胞瘤)的细胞中添加非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物后的PPARy免疫染色
[0170]与实施例2同样地向来自腱鞘巨细胞瘤的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的细胞中以浓度400 μ Μ添加扎托洛芬或以浓度200 μ Μ添加曲格列酮，观察PPAR y阳性图像(图26-29)。其结果，在添加了扎托洛芬或曲格列酮的细胞中能够确认PPARy的表达。
[0171]实施例10来自添加非甾体抗炎剂后的腱鞘巨细胞瘤(GCT of tendon sheath)的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎(弥漫型巨细胞瘤)的细胞的脂肪细胞分化的解析
[0172]与实施例3同样地，报告显示PPARY是脂肪细胞分化所必需的转录因子。因此，向来自腱鞘巨细胞瘤的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎的细胞中以浓度400 μ Μ添加扎托洛芬，解析向脂肪细胞的分化(图30、31)。其结果，添加了扎托洛芬的细胞中能够确认HCS LipidTOX Green的阳性图像与对照组相比亢进。
[0173]实施例11骨巨细胞瘤(GCT)培养细胞中添加吡格列酮后的细胞增殖抑制的解析
[0174]用与实施例1同样的方法，培养GCT培养细胞(caSel、caSe2)、来自腱鞘巨细胞瘤(GCT of tendon sheath)的细胞或来自色素性绒毛结节性滑膜炎(弥漫型巨细胞瘤)的细胞，以各浓度添加作为噻唑烷衍生物的吡格列酮来测定450nm的吸光度(图32)。其结果，能够确认细胞增殖是吡格列酮浓度依赖性地被抑制。
[0175]实施例12被给予了扎托洛芬的骨巨细胞瘤(GCT)患者、腱鞘巨细胞瘤患者或色素性绒毛结节性滑膜炎患者的MRI图像的解析
[0176]让骨巨细胞瘤患者、腱鞘巨细胞瘤患者或色素性绒毛结节性滑膜炎患者按3片/日(早?中.晚各服用1片)服用Soleton片80 (通用名称:扎托洛芬80mg，NIPPONCHEMIPHAR株式会社)，每隔数月用MRI评价肿瘤的尺寸。作为代表症例，在骨巨细胞瘤的骨盆部复发例(34岁，女性:图33、34)中，在2个月后(图35)、4个月后(图36)能够确认肿瘤逐渐缩小。另外，在右膝的色素性绒毛结节性滑膜炎的复发例(26岁，女性:图37、38)中，在3个月后(图39、40)能够确认MRI造影效果的减弱，在疼痛.膝关节可动区域看到改善。此外，在其它的右膝的色素性绒毛结节性滑膜炎的复发例(38岁，女性:图41、42)中在2个月后(图43、44)能够确认肿瘤的缩小，看到疼痛改善。
[0177]实施例13来自软骨肉瘤的细胞株(H-EMC-SS)中添加非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物后的细胞增殖抑制及细胞凋亡的解析
[0178]与实施例1同样地培养来自软骨肉瘤的细胞株，以各浓度添加曲格列酮、吡格列酮或扎托洛芬，测定吸光度(图45)。其结果，能够确认细胞增殖是曲格列酮、吡格列酮或扎托洛芬浓度依赖性地被抑制。
[0179]另外，与实施例1同样地对来自软骨肉瘤的细胞株进行Caspase3的染色，解析有无细胞凋亡(图46、47)。其结果，能够确认以浓度200 μ Μ添加了扎托洛芬、以浓度100 μ Μ添加了曲格列酮或以浓度200 μ Μ添加了吡格列酮的细胞与对照组相比，Caspase3阳性率上升。
[0180]实施例14来自软骨肉瘤的细胞株(H-EMC-SS)中添加非甾体抗炎剂或噻唑烷衍生物后的PPARy免疫染色
[0181]与实施例2同样地向来自软骨肉瘤的细胞株中以浓度200μΜ添加扎托洛芬，以浓度100 μ Μ添加曲格列酮或以浓度200 μ Μ添加吡格列酮，观察PPAR y阳性图像(图48、49)。其结果，在添加了扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的细胞中能够确认PPARy的表达。
[0182]产业上的可利用性
[0183]本发明的预防或治疗剂针对骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤患者或可能发生骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤疾病的人群有效。另外，根据本发明，通过选择控制PPARy基因和细胞凋亡或脂肪细胞分化的被检物质，能够对骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤探索新型治疗药。
[0184]本申请以在日本申请的特愿2012-070351 (申请日:平成24年3月26日)和特愿2012-235784(申请日:平成24年10月25日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。
【权利要求】
1.一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂，含有非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，非留体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛芬。
3.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮。
4.根据权利要求1?3中任I项所述的预防或治疗剂，其中，骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎。
5.一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗剂的筛选方法，包括以下工序: (1)将来自骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的细胞在被检物质存在的条件下或不存在的条件下进行培养的工序； (2)在两个条件下，分别测定PPARY基因的表达，和 (i)细胞凋亡相关基因，或者 (ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达的工序；(3)与被检物质不存在的条件下进行比较，选择有意地使PPARY基因的表达，和 (i)细胞凋亡相关基因，或者 (ii)脂肪细胞分化相关基因的表达或脂质的表达改变的被检物质的工序。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其中，骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎。
7.一种骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗方法，包括向对象给予有效量的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物。
8.根据权利要求7所述的预防或治疗方法，其中，非留体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛芬。
9.根据权利要求7所述的预防或治疗方法，其中，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮。
10.根据权利要求7?9中任I项所述的预防或治疗方法，其中，骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎。
11.一种用于骨.软组织中产生的巨细胞性肿瘤或软骨肉瘤的预防或治疗的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物。
12.根据权利要求11所述的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物，其中，非留体抗炎剂选自扎托洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、奥沙普秦、对乙酰氨基酚以及酮洛芬。
13.根据权利要求11所述的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物，其中，噻唑烷衍生物选自曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮。
14.根据权利要求11?13中任I项所述的非留体抗炎剂或噻唑烷衍生物，其中，骨?软组织中产生的巨细胞性肿瘤选自骨巨细胞瘤、腱鞘巨细胞瘤和色素性绒毛结节性滑膜炎。
【文档编号】G01N33/52GK104302322SQ201380016296
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2012年3月26日
【发明者】武内章彦, 土屋弘行 申请人:日本化学药品株式会社