采用maldi质谱技术分析小菌落微生物的方法

采用maldi质谱技术分析小菌落微生物的方法
【专利摘要】本发明涉及微生物质谱分析方法，特别是需从琼脂板上鉴定的微生物转移至质谱样品支撑盘的方法以及通过基质辅助激光解吸(MALDI)电离的制备。本发明旨在显著缩短具有重要诊断意义微生物的质谱鉴定方法时间。为此，在仅培养6至8小时后将琼脂板上生长的小菌落中的微生物，通过直接接触以高转移产量的形式转移至合适大小的接触面上，并在其上进行细胞破碎；释放的蛋白可在接触表面上使用基质材料制成MALDI样品。还可在接触表面上通过基质辅助激光解吸进行电离化。使用在MALDI过程中获得高离子产量的制备，对于大多数临床相关微生物，待分析样品自送达至微生物鉴定的关键期可从18至24小时缩短至今8小时。
【专利说明】采用MALDI质谱技术分析小菌落微生物的方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及使用质谱分析培养基表面菌落中微生物的方法，特别是一种借助基质辅助激光解吸电离化(MALD1:1onizat1n by matrix-assisted laser desorpt1n)的质谱仪。

【背景技术】
[0002]日常快速无误的微生物分析在临床和临床外感染诊断、医院或游泳河流或湖泊卫生监测、食品分析、生物技术工艺监测和控制以及微生物研究中发挥重要作用。这里的“微生物种”可简称为微生物，通常是用显微镜看见的小生物体，例如单细胞真菌(例如酵母)、显微藻类、原生动物(例如引起疟疾的疟原虫)，尽管鉴定工作通常主要关注细菌。
[0003]微生物鉴定指的是，原则上，确定其亚种从而将微生物分入分类体系:域(细菌、古细菌和真核生物)、界、门、纲、目、科、属和种。除了分类学鉴定之外，微生物分析还包括其他特性的定性，例如一种微生物种的病原性(导致疾病的能力)或一种微生物种对抗生素的耐药性。在本文件中，鉴定特别指的是种水平的鉴定。
[0004]对于质谱鉴定方法，通常会在皮氏培养皿中的培养基上培养采样分析的微生物至菌落状态。递交样品至分析实验室与种鉴定之间的时间基本取决于培养所需时间，因为实际的质谱测定仅需数分钟。目前，这种培养通常需要18至24小时。对于许多应用来说这一时间太长了，特别是医学诊断领域的应用。因此迫切需要大大缩短质谱鉴定所需时间，特别是缩短至I个工作日。
[0005]使用目前的方法，培养用培养基通常是皮氏培养皿(琼脂平板)中的琼脂；这样能够从分开的菌落中获得纯的微生物培养物(隔离物)。琼脂是一种90%以上由水组成的凝胶状半乳糖聚合物。琼脂本身是不可消化的，很难被微生物侵蚀。由于目前微生物主要是手工采样，菌落直径应至少为半毫米，最好至少为I毫米，从而能够可靠的采集微生物样本。将菌落培养至这一尺寸需要花费数小时，有时甚至数天，取决于微生物的活力。对于具有临床重要意义的物种，琼脂板上的样品通常要培养大约18至24小时。如果菌落重叠或混合，则需要第二次培养来获得独立的菌落。
[0006]在MALDI样品手工制备期间，将少量的所选菌落从培养基转移至样品支撑盘上；实际操作中通常使用木制牙签来完成，用后可丢弃。然后用基质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸[HCCA]或2，5-二羟基苯甲酸[DHB])的强酸溶液喷洒所转移的微生物，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)将其电离。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，这意味着基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够通过渗透压渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。通常弹性细胞壁破碎成为“细胞破碎”，细胞破碎会将可溶性蛋白质从细胞中释放出来。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，同时会引起溶解的基质结晶。释放出来的微生物可溶性蛋白以及细胞内的一些其它少量物质会在结晶过程中掺入基质结晶中。这一过程会在样品支撑盘上进行样品制备，下文称为“MALDI样品”。
[0007]在质谱仪中使用聚焦的紫外脉冲轰击嵌入分析物分子的MALDI样品数纳秒，生成蒸汽等离子体形式的分析物分子的离子。在质谱仪中再根据这些离子的质量将其分离，并在质谱仪内进行测量。目前无反射器的飞行时间质谱仪可用于微生物的质谱鉴定，从而获得最闻的灵敏度。
[0008]获得的质谱图是来自微生物的分析物离子的质量值分布曲线。这些离子绝大部分是蛋白离子，用于鉴定的含有最佳信息的离子质量大约在3，000道尔顿到15，000道尔顿之间。在本方法中，蛋白离子绝大部分是单电荷(电荷数z = I)，因此这里只需要提及离子的质量m，而不需总是使用“质量电荷比”m/z，而在使用其他类型的质谱仪时这是必须且约定俗成的)。鉴定可通过在微生物(例如用于分析的样品中的微生物细胞)获得的质谱图与参比图库中的参比图谱进行类似度分析来完成；可查看文件DE 10 2010 006 450 Al (M.Kostrzewa)，其还包含该质谱方法的详细说明。对于医学应用，目前市售有合适的带有数千种系微生物的参比质谱图的参比图库，根据许多国家的法规经过验证。
[0009]用于鉴定的质谱方法非常稳定；培养条件或制备方法改变很少会影响鉴定结果，因为实际上，每一种只分析遗传学确定的具有遗传学确定丰度的蛋白。约60%至85%的蛋白质来源于核糖体，取决于微生物品种，其由固定数量的40至60种不同的蛋白分子组成。每一细菌细胞包含由数万个的相同核糖体；真核细胞包含数十万个。因此，所测量蛋白的丰度并不取决于菌落的营养条件或成熟度，因为例如脂蛋白或脂肪酸作为能量储备；而所有蛋白的核糖体蛋白分子的丰度则基本相同，基本与核糖体数量相等。本方法的稳健性使得可以使用非常年轻，或成熟或甚至老化的菌落中的微生物进行鉴定，而且基本可以获得相同的鉴定结果。
[0010]到目前为止，经验来说，在样品盘上制备一份MALDI样品需要至少15个微生物以确保能够可靠地使用质谱鉴定微生物。这一数量很难裸眼分辨。15至17之间的数量尤其合适。对于有数十万个核糖体的真核细胞来说，已有成功的从单个细胞获得样本使用质谱方法鉴定其品种。但对于细菌来说，其坚硬的细胞壁需要特别的细胞破碎处理，而仅有个别案例能够从13个细菌或更多的细菌获得足以进行鉴定的质谱图。
[0011]本质谱鉴定法已被证明非常成功。一旦完成培养后就能很快完成，准确鉴定的可靠性远高于目前所用的微生物鉴定法，这已被许多研究证实。
[0012]质谱方法可实现从纯种微生物培养物，即所谓的“分离物”，进行微生物鉴定。一种纯种微生物培养物的质谱不会包含其他微生物类型信号重叠。不过目前已发现，也可评估两种微生物混合物的质谱图，如需要，这样可鉴定两种微生物种属(例如,参见DE 10 2009007 266 Al, M.Kostrzewa et al.)。鉴定可靠性仅受到轻微影响。
[0013]对自动化的追求已经产生了使用小型接种杆的机器转移替代手动转移的装置。德国弗劳恩霍夫厂房操作和自动化研究院(马格德堡/德国)已开发了一种名为“MiRob”的机器人，其可执行这一任务(cf.:0.Lange et el.(2008) 〃MIR0B:automatic rapididentificat1n of micro-organisms in high through-put^, Industrial Robot:AnInternat1nal Journal, Vol.35Iss:4, pp.311 - 315 或专利 DElO 2004 020 885 B2)。这款机器人 MiRob 300i 由 Mess-, Priif-und Handling-Systeme GmbH, Reutlingen/Germany公司生产。与手动转移类似，通过一种工具，在这一案例中使用的是接种杆，将微生物间接转移至质谱仪的样品支撑盘上。同时，菌落的直径最小为0.5毫米。到目前为止，使用的转移工具(牙签、接种杆)均为一次性的。在文件EP O 456 995 BI (D.Naumann andH.Labischinski, 1989,对应于美国5，660，998)中得知一种直接转移微生物至一种分析用样品支撑盘上的方法，其通过红外显微镜获取微生物的红外谱。


【发明内容】

[0014]本发明旨在确定微生物的质谱分析方法，与当前的方法相比，从待研究的样品(分析样品)送达至鉴定完成的时间显著缩短，最好缩短至I个工作日，即约8小时。此方法还应该是一种可靠的自动化方法，只需要少量耗材。
[0015]本发明提供一种使用质谱仪对培养基表面微生物进行质谱分析的方法，包括以下步骤:(a)通过一个样品支撑盘直接接触培养基表面的方法转移微生物，(b)在样品支撑盘表面破碎所转移的微生物，并在样品支撑盘表面上制备微生物的分子成分用于质谱采集，(C)表面有制备好的样品的样品支撑盘被转移至质谱仪中进行分析，以通过与参比质谱图比对获取其鉴定的分子组成的质谱图。
[0016]本发明提供一种使用质谱仪对培养基表面微生物进行质谱分析的方法，包括以下步骤:(a)通过直接接触将微生物转移至一个样品支撑盘的接触表面上，(b)在样品支撑盘接触表面上将所转移的微生物进行细胞破碎，以及(C)将带有破碎微生物分子成分的样品支撑盘放入质谱仪进行分析。
[0017]本发明提供一种使用基质辅助激光解吸质谱仪对培养基表面微生物进行质谱分析的方法，包括以下步骤:(a)通过直接接触将微生物转移至一个样品支撑盘的接触表面上，(b)在样品支撑盘接触表面上将所转移的微生物进行细胞破碎，破碎微生物的分子成分按MALDI样品进行制备，以及(c)带有MALDI样品的样品支撑盘被转移至质谱仪进行分析。最好通过MALDI样品制备来破碎微生物，例如通过添加一种合适强度的基质溶液(基质物质置于一种强酸性有机溶剂中)。
[0018]也可以使用将待电离的物质放置在一个样品支撑盘上的其它类型的电离方式来替代MALDI电离，例如根据EP I 200 984 BI的团簇电离，根据W02005/094389 A2的解吸电喷雾电离(DESI)或根据DE 10 2004 002 729 Al的基质辅助激光解吸电离(MALDESI)。这里，制备一种质谱样品可包括在样品支撑盘上破碎微生物细胞。不过，下文的描述主要基于MALDI电离化过程。
[0019]根据本发明的方法适合于鉴定大多数临床相关微生物，培养周期最长约为8小时，因此在一个工作日或短短的一夜即可完成。在这一较短的视觉内，通常会在培养基表面形成一个直径约为50至200微米的小菌落。即使是对于生长缓慢的微生物，就目前技术而言仍需要培养许多天的微生物，也可将时间缩短一半或甚至更短。
[0020]对于许多诊断相关的微生物，仅培养6至8小时后即已形成的小菌落，将其直接转移至样品支撑盘上，可通过将样品支撑盘的表面直接接触来获得高转移产量，即使如果微生物仅以小菌落的形式存在。微生物在这些接触表面上被破碎，而释放出的蛋白可在样品支撑盘接触表面上使用基质材料制备，制成MALDI样品。还可在样品支撑盘接触表面上通过基质辅助激光解吸进行电离化。奇怪的是，可以从仅由1000个微生物组成的小菌落中获得足够好的质谱图。目前尚不清楚这一高灵敏度的原因:可能是由于，与手动转移至样品支撑盘不同，直接接触仅转移干净的微生物，而没有吸附任何琼脂，只带有少量的培养基溶液。此外，由于微生物材料吸附在转移工具上并留在那里而不是被转移至一个样品支撑盘上，因此不会损失。根据本发明的方法，使用样品支撑盘可获得微生物的高粘附性；对于转移工具而言则不合适，因为其可能需要再次释放微生物材料。对于大多数临床相关微生物，从传送待分析的微生物至微生物鉴定的关键期可以从约18至24小时缩短至仅8小时。
[0021]因此，本发明基本包含转移位于培养基表面(通常是琼脂板)的一个菌落中的微生物，特别是小菌落，通过直接接触而不适宜特殊的转移工具(例如上述牙签)，转移至一个合适的样品支撑盘上的合适形状的接触面上。与使用工具相比，采用这种直接接触转移可将更高百分率的微生物从一个小菌落中转移至一个样品支撑盘上。然后，在接触面上直接破碎微生物细胞，制成MALDI样品；然后将带有接触表面的样品支撑盘放入质谱仪的离子源中，如需要，首先插入至一个合适的转接件板。因此MALDI电离可直接在样品支撑盘的接触表面上进行。
[0022]可直接转移微生物至一个针状样品支撑盘(样品支持针)上，其末端表面可与微生物接触。针状样品支撑盘的接触表面太小，仅有单个菌落的微生物会被转移至针状样品支撑盘上。当微生物已被转移后，最好将针状样品支撑盘插入至一个转接件板上，使针状样品支撑盘的末端表面基本与转接件板平齐。这里的“基本平齐”指的是在MALDI飞行时间质谱仪中使用轴向离子发射进行质谱分析可能获得足够的质量分辨率。不同菌落来源的微生物可被转移至独立的针状样品支撑盘上，其可共同被插入至一个转接件板上，放在转接件板上被放入质谱仪内。也可以从一个菌落转移微生物至数个针状样品支撑盘上。
[0023]根据本发明使用针状样品支撑盘的方法包括以下步骤:采集培养基表面的图像，确定图像中菌落位置，对确定位置的微生物进行接触转移至针状样品支撑盘上，插入针状样品支撑盘上至转接板上，从针状样品支撑盘上制备MALDI样品，将转接板放入质谱仪内，在转接板上的针状样品支撑盘位置处使用基质辅助激光解吸电离获取质谱图。
[0024]还可以将微生物直接转移至一个板状样品支撑盘(样品载板)，其接触表面较大，数个菌落的微生物可同时被转移至板状样品支撑盘上。在转移后，一个或多个板状样品支撑盘可放在一块转接板上，并通过例如机械力或磁力固定。板状样品支撑盘的直径最好为I至8厘米。
[0025]在转移微生物后，可使用一台数码照相机拍摄板状样品支撑盘的接触表面，从而从所拍摄图像确定板状样品支撑盘上所转移微生物的位置。最好在转接板上已配置板状样品支撑盘，包括记录转接板标记，从确定相对于转接板的样品支撑盘位置或所转移微生物的位置。这样可以在MALDI源电离区内直接定位所转移的微生物。同样的，可以拍摄培养基表面图像，确定板状样品支撑盘相对培养基的位置，从而确定板状样品支撑盘上所转移微生物的位置。然后最好将基质溶液放在板状样品支撑盘的整个接触面上，但仅在预定位置进行质谱分析。另一方面，仅在预定位置制备MALDI样品，并仅在那里进行质谱分析。板状样品支撑盘的接触面以及培养基表面最好使用光学测量程序进行成像，最好使用可见光谱范围内的反射光显微镜。光学照明测量程序还可使用散射光、拉曼散射或荧光进行空间解析测量。最好在微生物细胞破碎铅进行板状样品支撑盘接触面成像，但也可在微生物细胞破碎后进行。
[0026]通常研究的样品会接种至培养基(稀释溶液形式)表面，其最初会生长空间上独立的小菌落。当使用板状样品支撑盘时，小菌落中的微生物被转移至样品支撑盘上的独立区域，这意味着可使用质谱鉴定，而不会相互影响(混合)，当待研究的样品(混合样品)中存在不同种类的微生物时，特别具有优势。还可将待分析样品以轨道的形式放在培养基表面，这就限制了微生物的生长，从而限制了小菌落相对轨道的位置。当待分析样品放在培养基(接种过程)表面上时，已记录了轨道位置。在已培养微生物后，将板状样品支撑盘于培养基表面接触，确定板状样品支撑盘接触面的轨道后，确定板状样品支撑盘相对于培养基表面的位置。然后将基质溶液放在板状样品支撑盘的整个接触面上，但仅沿预定轨道进行质谱分析。最初未拍摄培养基表面或接触表面图像时跟踪轨道可以鉴定小菌落中的微生物，这样在相应图像中不可辨别，而无需使用质谱分析整个样品支撑盘。还可以仅沿预定轨道制备MALDI样品。
[0027]例如，样品支撑盘的接触面可以是一个任何外形的平坦的样品载板，直径约为I至8厘米。这种样品支撑盘当与表面平齐时，通过轻轻按压或放置在培养基表面，可同时采集多个菌落的微生物。不过，接触面也可以使样品支撑针的末端表面，其测量直径为2毫米，用于仅从一个所选菌落中取出微生物，特别是小菌落。
[0028]可以包被样品支撑盘的接触面，这样可尽可能多地转移微生物。例如，可简单湿润或使用蛋白吸附或粘附区，其对微生物具有高亲和力，从而能够固定在上面。例如，使用一种α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)的薄层制品可获得微晶体表面，其可牢固吸附多肽或蛋白质，从而也可吸附细菌的包被蛋白。一个润湿的二硝基纤维素或三硝基纤维素层薄层还可吸附蛋白，并同时对MALDI过程产生正性作用。
[0029]可在取下微生物之前在培养基表面拍摄一张数字图像，从而确定小菌落位置上的信息。这一信息可用于控制从培养基上取下微生物，特别是从薄层样品支撑针上取下。板状样品支撑盘上转移微生物的数字图像给出接触面上的微生物位置；这一信息可用于控制获取质谱图过程中激光束扫描较大样品载板。
[0030]此外，还需要确保通过特殊措施获得接触面上的微生物制品的最大离子产量，例如去除矿物质和在基质薄层中均一包埋微生物蛋白质。
[0031]根据本发明的方法较现有技术具有优势，其所需耗材较少，因为无需转移工具，这样可以降低费用，节省微生物培养时间，从而较快鉴定。与从不同的待分析样品中手动转移微生物至一个质谱样品支撑盘上相比，通过直接接触转移可以避免样品指派的错误，可通过自动转移每一待分析样品的识别标签纸所使用的每一质谱样品支撑盘来实现。识别标签存储在培养基支撑盘上。

【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1示一个简单的样品支撑针(3)的示例，其末端表面作为接触表面，中心区包被有一个蛋白吸附层，其具有一个疏水边界(2)。在该示例中，样品支撑针(3)直径约为2毫米，长度约8晕米。
[0033]图2示一个带有接触表面(4)的样品载板(5)。在该示例中，样品载板(5)为圆形，但也可具有任何其他外形，其直径可在I至8厘米直径。样品载板区最好与培养基区相对应，即与皮式培养皿的形状和面积相似。
[0034]图3示样品支撑针(3)是插入至一块转接板的方式，其末端表面与转接板(10)表面平齐。
[0035]图4示一个带有样品载板(5)的转接板(12)，其插入也应平齐。样品载板(5)在后方具有手柄￠)，可使用一个机器人系统来抓取并按压至培养基板上。
[0036]图5示一种微生物接触转移的布局，带有基座(20)和支柱(21)。使用小夹子(23)将皮氏培养皿(22)被固定在基座(20)上。安装在支柱(21)上的相机(24)可拍摄皮式培养皿(22)中培养基表面的图像。带有可控接合处的机械手(25)可以高度位置准确度按压样品支撑针(3)以及样品载板(5)至皮式培养皿(22)的培养基中。
[0037]图6以俯视图示皮式培养皿(30)，带有一个手动施加待分析样品(分析物溶液)的轨道(31)。可拍摄接种过程的数码照片，然后直接转移取下微生物菌落，该图像(或录制的视频)可用于控制质谱分析过程中样品载板接触面上的激光扫描。
[0038]图7代表一种与图5所示装置略有不同的微生物转移装置。刚性臂替代了机械手，其只能通过接合处(26)在2个固定夹角位置之间旋转。刚性臂具有一个夹持样品支撑针并将其降低至皮式培养皿的培养基表面的装置(27)。由皮式培养皿(22)的移动装置(28)生产一个正确接触位置，其可在水平的两个方向上操作。在装置(27)绕接合处(26)旋转后，其可从储存容器(19)中取出样品支撑针，并通过移动装置(29)移动至正确位置。
[0039]图8示比较了不同样品转移技术的MALD1-T0F质谱仪的质谱图，使用了 2种测试微生物(E.coli RKI A139和S.aureus DSM 20231)。使用24小时培养的当前技术制备的样品记录朝上的质谱图("宏观")。对于朝下的质谱图("微观")，使用小菌落的接触转移。虽然微观和宏观质谱图之间可观察到显著差异，B1Typer?数据库比对微观质谱图和存储的24小时培养的参比质谱图，可获得正确种属鉴定的较好的(金黄色葡萄球菌)或非常好(大肠杆菌)的评分值。

【具体实施方式】
[0040]微生物生长有4个阶段。在最初的短期调整期(“滞后期”)内，微生物通过例如产生不同的消化酶调节其代谢以适应培养基。之后是一个微生物呈指数生长的无阻碍的生长阶段(“对数期”)，直至养分短缺或产生毒素停止了指数增长的角度，并无症状地进入“平台期”。最后，微生物由于缺乏养分或中毒而死亡(“死亡期”)。在不受阻碍的生长期内，细菌细胞在每一特征期(“增代时间”)后发生分裂。增代时间取决于微生物种类以及外部条件；对于最优条件(温度、培养基)，每一案例中的一代时间在15分钟至24小时之间。大多数临床重要的病原微生物在15至45分钟的焦段时间内分裂；但也有临床重要的病原微生物生长缓慢。
[0041]不过这些生长阶段指的是液体培养基内的生长。由于不受阻碍的指数生长至能在表面上的一个菌落中较短时间内发生，因此在琼脂板上的生长会不太一样。步骤阻碍的生长仅在菌落边缘处发生。在菌落区内，微生物在分裂为第2、3和4层后就被向前推，而这会降低养分供给。一些微生物被锁定在这些顶层，但有一些会从最低的微生物层向边缘移动，这样它们就能再次接触到培养基。对于致命微生物，8小时后，小菌落可包含约13至15个细胞，对于缓慢生长的微生物，小菌落所含细胞可能更少。
[0042]在下述实施例中，微生物，特别是来自待分析样品的细菌，以常规放置接种在含有培养基的平板(例如琼脂板)上，然后最佳稳定下(通常为37摄氏度)在培养箱内培养6至8小时。然后上述小菌落会在培养基表面生长。培养基最好置于皮氏培养皿中。培养基表面的状态应该是，可以轻松将微生物取出，即微生物不应该穿透培养基表面。
[0043]图5所示的一种仪器，其可用于通过直接转移将小菌落中的微生物取出。使用小夹子(23)将皮氏培养皿(22)被固定在装置的基座(20)上。在取出微生物之前，可以便利地使用相机(24)拍摄一张培养基表面的数字图像，从而确定小菌落的位置。相机最好为数码相机，并能够胜任这一任务；在大多数情况下，肉眼可见的光学装置适合拍摄单张照片，但有时表面需要使用显微镜的透镜系统进行精确扫描。在图像识别方法的辅助下，可确定小菌落的位置数据。还可以通过在显示该图像的屏幕上点击其位置来从从视觉上确定小菌落，从而选择转移的菌落。仅1000个细菌组成的小菌落的直径约为0.05毫米；如果照明合适的话，还是可以通过照片来识别的。对于有利的情况，在培养8小时后，具有诊断重要意义的细菌的小菌落中包含数千至数万的细菌。
[0044]如果采用自动图像识别来确定小菌落的位置，则还可以通过设定小菌落特征参数(例如菌落形状)来自动挑选小菌落用于鉴定。这些参数特别与小菌落的尺寸、形状、反射强度和颜色相关。
[0045]在第一个实施例中，使用如图1中所示的小型样品支撑针(3)末端表面按压所选小菌落的中心区域，针尖的表面积最大为9，最好小于4平方毫米，从而通过接触将小菌落中的微生物转移至样品支撑针的末端表面(3)。图1示样品支撑针(3)的直径为2毫米。样品支撑针(3)应包含导电材料，例如金属或可导电的塑料。可手动按压在小菌落上，不过最好使用图5中装置的机械手(25)，其通过培养基表面光学图像的位置数据进行控制。图7所示装置更具优势，其可取回样品支撑针并放回储存容器(19)内。然后可以将样品支撑针(3)精确插入至合适的转接板(10)上的相应小孔内，其适合于被放入质谱仪。当使用储存容器(19)时，可以很容易将所有样品支撑针一起转移至转接板上，只需简单地将带有插孔的转接板朝下放在归档的储存容器上，反转容器，然后再次取下容器。样品支撑针(3)的末端表面可以是粗糙的，也可以是光滑的；末端表面还可以用特殊方式制备，如图1所示，这样其可尽可能多地存放微生物。样品支撑针(3)通常为一次性用品，这对于诊断方法而言具有优势。MALDI过程制备以及激光解吸也可在这一末端表面上进行；请查看下文中关于这一点的描述。
[0046]样品支撑针(3)的特殊设计包括α -氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)的薄层包被。该层不溶于水。如果该层湿水，则会吸附蛋白质，这样微生物会因其包被蛋白而被牢固地粘在薄层上。当将潮湿的样品支撑针(3)压向培养基表面时，可以在不同位置轻轻地前后擦拭从而将小菌落中的微生物扩散至一个较大的表面，从而可以采集更多的微生物。稍后可以采用已知的方法将破碎微生物种的可溶性蛋白包埋进这一 HCCA薄层中。
[0047]在不同的设计中，样品支撑针(3)的末端表面包被有一个超薄的二硝基纤维素或三硝基纤维素(纤维素二硝基酯或纤维素二硝基酯)。这些硝酸纤维素可溶于乙醇、丙酮或其他有机溶剂，然后可作为溶剂，并被干燥。该层也不溶于水，在接触培养基表面前可以弄湿；然后其可利用强的粘附力吸附微生物的包被蛋白。硝酸纤维素不会妨碍分析物分子电离的MALDI过程。
[0048]也可以使用贴在皮肤上的橡皮膏中所使用的这类粘性涂层。最好将带有粘性涂层的样品支撑针轻触小菌落数次，而不打湿。粘性剂的配方必须不能阻碍电离的MALDI过程。
[0049]如图1所示的样品支撑针(3)特殊设计中，例如仅在直径为0.8毫米的末端表面中心区放置HCCA、硝酸纤维素或粘性剂薄层，而末端表面的边界区(2)则包被有一个疏水层。疏水边界(2)可简化MALDI的进一步制备以及操作样品支撑针。例如，其可允许将样品支撑针轻松插入储存容器(19)内，这样疏水表面仅会位于插孔的凹面上，这样样品支撑针的后会从储存各器内关出出来。
[0050]如果是在样品支撑针(3)已插入至转接板(10)后再开始制备则具有优势；可手动或使用移液机器人完成制备。首先使用0.5ml强酸制备微生物，通常是甲酸或三氟乙酸(TFA)，其目的是破坏细胞壁或者至少很大程度上削弱它。对于带有疏水边界(2)的样品支撑针(3)，小滴酸可仍限制在中心疏水区(I)内。在酸已干燥后，然后使用基质物质制备释放出的蛋白质:使用HCCA薄层，可滴加一滴乙腈(约0.5ml)将蛋白包埋入薄层中；对于硝酸纤维素层，现在则必须添加基质物质溶液。非接触沉淀工艺已证明是可成功沉淀少量液体，其中以可控访视将小液滴压出中心套管，则第二个同心套管内释放的短暂压力会使液滴掉落至靶标上。此处应当注意的是，还可以使用强酸性基质溶液一步完成细胞破碎和基质添加。
[0051]转移方法的第二个实施例涉及同时接触转移许多小菌落至样品载板(5)的接触面⑷上。圆形涉及的样品载板(5)如图2所示。但原则上，样品载板(5)可以是任何形状，其直径在I至8厘米之间，其可通过轻轻按压培养基表面来同时挑起许多小菌落的微生物。样品载板(5)的接触面(4)应当与培养基表面平齐。可手动按压样品载板(5)，但也可以使用例如图5中带有机械手(25)的装置，其中机械手可控制接触压力。可用类似方式制备样品载板(5)的接触面(4)，这样样品支撑针可以与尽可能多的微生物结合。例如，可简单打湿，或用粘性剂或强吸附层来包被。
[0052]样品载板(5)还可插入至特殊形状的转接板(12)内。转接板(12)具有将其放置质谱仪离子源所需的外形。如果现在相机可以拍摄样品载板上所转移的小菌落的数码图像，则更为方便。可从该图像确定所转移小菌落的位置。将样品载板插入至转接板后可拍摄图像，因为届时可以很容易确定相对于转接板的位置。稍后该位置数据可用于控制质谱米集。
[0053]单个小菌落的微生物可使用上述针对样品支撑针的方式制备；不过，更有利的是使用一种开发用于成像质谱的制备薄的组织切片的类似方法。这里通常使用喷雾从而在没有强烈的侧向蛋白涂抹的情况下获得均一的制品。文件DElO 2006 059 695 B3 (M.Schiirenberg, identical with GB 2 446 251 A and US2008/0142703 Al)描述了这种类型的制备方法。不过，应该注意到，接触面上的微生物必须已进行细胞破碎，从而破坏相对坚硬的细胞壁，薄的组织切片制备无需这一过程，因为一方面这里的细胞是已经切开的，另一方面，其被薄膜包围而不是坚硬的细胞壁。
[0054]从样品载板采集质谱图可以包括扫描整个接触面，虽然这通常会太耗时。因此，最好使用数码图像的位置数据，仅包括小菌落的已识别的位置以及质谱图采集中其周围情况。
[0055]样品载板上质谱图采集的一个特殊实施例可包括仅沿待分析样品的轨道(31)获取质谱图，其可被放置在皮氏培养皿(30)中的培养基表面上(图6)。完成后需要拍摄待分析样品在培养基表面(接种过程)涂板的图像，例如使用长时间曝光或一台摄像机。使用这种方法还可以分析不能通过照相识别的小菌落，而不用在整个接触面上进行质谱分析。
[0056]现在对这两种优选方法进行更为详细的描述:第一种方法采用HCCA包被的样品支持针(3)，第二种方法是用较大的样品载板(5)。
[0057]对于第一种方法,可在皮氏培养皿中含有培养基的表面上培养8小时将微生物培养成小菌落。含有培养基的表面可以是琼脂表面，也可以是含有营养液的微孔膜，这样可以较为容易地取下微生物，例如使用一种孔径小于100纳米的硅胶膜。然后将皮氏培养皿
(22)固定在图5和7中的一种装置的基座(20)上，然后使用一台相机(24)拍摄培养基表面，相机可永久性安装在装置上。对于图7中相机与皮氏培养皿之间的距离，可提供约20微米或甚至更好的高空间分辨率的相机。如上所述，可识别的小菌落直径应为50至200微米。如果需要较高的空间分辨率，则可通过移动皮氏培养皿可采集部分琼脂表面的数张照片。表面的图像显示在一台显示器上，用户现在可以通过点击来选择预订数量的小菌落。所选小菌落的数量取决于分析认为，尤其是是否期待所提供的待分析样本仅含一种微生物或数种不同的微生物。如果可以看见不同类型的菌落，则选择可包括每一种菌落。
[0058]该装置还包括一个可控机械手(25，26，27)，其可从储存容器中捡起样品支撑针
(3)(图5中未示，图7中的19)，将其以高位置准确度按压至皮氏培养皿(22)的培养基表面。样品支撑针(3)末端表面最好直径约为2毫米，如图1所示，在中心区(I)被包被，直径约为0.8毫米，具有α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)薄层；其周围边界(2)，宽度为0.6毫米，为疏水涂层。机械手(27)首先将样品支撑针(3)末端表面按压至一块潮湿的海绵上，从而将表面的疏水部分打湿。机械手非常轻柔地将末端表面按压至一个所选小菌落的中心，通过移动支架至正确位置来移动，可通过小菌落的位置数据进行控制。如果样品支撑针(3)由金属制成，则通常足以将样品支撑针释放在表面上方，从而在其自身重量下停留在该表面上。前后轻轻移动样品支撑针，在不同方向移动1/10毫米，或反复擦拭，帮助将微生物分布在一个比菌落直径略大的区域上。薄层包被的吸附力指的是小菌落中所有微生物中的大部分可被采集起来，特别是如果培养基使用的是一种可以特别容易地采集微生物的材料。如果0.8毫米的吸附区(I)用平均尺寸(约1X2微米)的细菌密集地包被，其可包括约25万个细菌，因此足以从小菌落中收集微生物。最初的经验已经显示，如果小菌落仅含约1000个微生物，则其中大部分可被转移至接触表面上。
[0059]例如，然后可用第二个机械手(图5中未示)抓起样品支撑针(3)从而旋转插入转接板(10)中一个尺寸非常温和的小孔中。但是，样品支撑针还可以首先放回传送板(19)的自由位置处。在所有样品支撑针已经用小菌落中的细菌包被后，转移支撑针至转接板(10)。转接板(10)的形状使之可以与所有针状样品支撑盘一样插入至所用质谱仪中。样品支撑针(3)的末端表面应与转接板(10)精确平齐从而提供一个平坦不中断的表面，用于形成飞行时间质谱仪中均一的离子加速场。转接板(10)具有一个微量滴定板的形状和尺寸，可容纳8X12 = 96样品支撑针(3)，例如；可以是一个有多达384个样品支撑针的较密包装，但不一定很必要。96个小菌落的接触转移所需时间主要取决于培养的皮式培养皿的数量，这需要进行拍照和评估；通常，这一工作可在约I刻钟。一旦转接板(10)已用足够数量的样品支撑针(3)，可开始制备样品。在一个移液机器人中可以很好地完成制备，其可在不接触的情况下释放液滴。
[0060]微生物制备首先必须通过削弱或破碎其坚硬的细胞壁进行细胞破碎。通常，可使用酸，例如甲酸或三氟乙酸。结束后，必须在样品支撑针(3)的疏水中心区(I)仅加入约0.5ml溶液。液滴可停留在那里，而不会流入周围的疏水边界区(2)。仅在数分钟后，细胞壁会充分弱化，而酸液可能已经干燥，例如将转接板(10)放入一台蒸发干燥器内。然后加入约0.5ml乙腈/水混合物，其可渗透入细胞内，使之破裂从而释放出内部的可溶性蛋白。同时，乙腈略溶于HCCA薄层最顶层部分。乙腈蒸发会发生重结晶，这样以吸附形式固定在晶体表面的大多数蛋白分子会整合入晶格内。
[0061]电离化MALDI过程还可通过去除盐离子来其灵敏度，例如Na+或K+，其已知可抑制电离。例如，可通过向基质溶液中添加柠檬酸铵或酒石酸铵，或通过使用耐盐的基质物质(例如3，4-二氨基二苯甲酮)来实现。简单冲洗同样有效；添加0.5ml去离子水，并再次吸走，可消除大多数的盐分和其他可能阻碍电离化MALDI过程的物质。
[0062]最优选所有液体在不接触小液滴的情况下沉淀，因为这样就无需每次使用新的枪头。无接触沉淀已被证明可以成功沉淀Iml以下的少量液体，其以可控访视将小液滴从微型钝针中压出。从中心微型钝针通过从第二个同心钝针的短暂的气流压力释放液滴，其垂直掉落在目标上。要同时去除所有样品支撑针的洗涤水，可以在转接板上放置一片吸水纸，从而立即再次去除。
[0063]可在不到10分钟内完成96个样品的制备。然后可以将带有完整制备的MALDI样品的转接板(10)通过一个真空锁放入质谱仪的离子源内。采集质谱图，每一次包括上百张单张质谱图，在现代质谱仪中每个样品仅需要I秒钟。如果鉴定程序运行足够快，则96个MALDI样品的鉴定结果可在放入转接板后5分钟内即可获得。在完成培养后的工作所需总时间，即接触转移、样品制备、采集质谱图，共需要约半小时的时间。
[0064]这里需要解释的第二个例子涉及使用一个较大的样品载板(5)同时取出数个小菌落中的微生物，以及接触面上微生物制备类型。
[0065]在皮式培养皿内培养微生物后，拍摄一张皮式培养皿上小菌落的图像，通过一种如图5所示的装置将样品载板(5)按压在培养基表面。本示例中样品载板(5)为圆形，直径为2.5厘米，可包被硝酸纤维素薄层，从而使之可以强吸附微生物蛋白。该装置可以用可调节的接触压力将样品载板(5)压在用户提前所选的培养基表面区上。这里可前后移动样品载板(5) 1/10毫米，将微生物分布在一个较大的区域上。
[0066]在从培养基表面上取下后，样品载板(5)可沿样品载板(5)插入转接板(12)的表面从而与之平齐。转接板(12)的形状使之可以插入至所用质谱仪中。使用合适的照明条件，拍摄一张带有已插入样品载板(5)的转接板(12)的高分辨率数码照片。该图像可指示所转移的小菌落，并用于确定其相对于转接板位置记号的位置。如果样品载板的接触面高度抛光，且该表面的照明较为模糊，则可通过黑暗背景中的散射光高灵敏度地识别微生物。现在可以通过基质辅助激光解吸电离制备转接板。可使用简单的喷雾枪来完成，获得细雾，或最好是在专用的喷雾设备(〃ImagePrep〃, Bruker Daltonik GmbH, Bremen/Germany)中完成。喷雾设备可以将液体转化为雾，其微小液滴会在表面均一沉落。可以控制沉落的液滴密度从而很大程度避免任何侧向运行.以可控方式交替喷雾和干燥周期，这在薄层组织切片制备中是已知的。
[0067]首先必须通过喷洒甲酸或三氟乙酸来弱化微生物坚硬的细胞壁。然后喷洒基质物质溶液，从而完全破碎细胞壁，释放细胞内部的可溶性蛋白。交替喷雾和干燥周期可导致微晶生长，会增加微生物细胞可溶性蛋白的包埋。当微晶层已到达约2至3微米厚时，可终止这一程序。如果基质物质不溶于水，则可简单用纯水清洗微晶表面，去除所有盐分和其他有害但水溶性物质。为了获得较大的连续微晶层，可在喷洒基质溶液前通过喷雾和干燥添加极细固体晶核悬液。例如晶核可以由极细的石英砂组成；晶核可确保整个表面的基质材料结晶。
[0068]将转接板(12)放入质谱仪内。质谱仪离子源包含装置，其中接板可在两个方向以数毫米的位置准确度移动。通过与数码图像中小菌落的位置数据连接，可以单独选择和分析样品载板上这些菌落的微生物位置。可分析所有可识别的小菌落，或者仅自动选择的小菌落，或者用户已提前选择的菌落。然后质谱图的微生物鉴定可再次分配给数码图像上的小菌落:电极显示器上的小菌落，然后会显示种类名称。特别是当分析样品是诊断样品时，还可以用表格形式输出结果，将其传输给取样和送样至质谱实验室进行分析的医生。
[0069]使用这种方法无法排除一些小菌落在数码图像上无法鉴定的可能性，因为它们可能太小或者其与样品支撑盘表面无颜色对比，即使是在已调整的照明条件下。如果存在这一危险，则可使用一种特殊的方法，其中使用MALDI方法的激光束扫描分析在培养基表面添加的样品轨道(31)。这需要记录待分析样品的接种情况，例如通过长时间曝光的固定相机或摄像机。通常，待分析的样品可以前后移动数次的Z线接种，如图6中的轨道(31)所示。一旦已记录这一轨道后，可移动质谱仪内的转接板，接可在一系列的质谱采集中分析接种轨迹。可能会包含任何看不见的小菌落，虽然其已形成了足够数量的微生物。
[0070]可用许多不同方式修改或扩展上述转移和制备的2种方法。特别的，可以继续培养皮式培养皿内剩余的微生物，使用样品支撑针或样品载板取下微生物后，从而发现和鉴定生长较为缓慢的微生物，即使是培养较长时间后。可以很方便地破碎快速生长的小菌落或机械取下。这里，在短暂培养期后拍摄数码照片有助于发现较长时间培养后的菌落。然后可以使用样品支撑针或样品载板取下进行鉴定分析，类似于在第一次采样后已鉴定的原始的小菌落。
[0071]如果怀疑存在生长特别缓慢但危险的微生物，可按方法中的一个特殊实施例在合适的间隔反复检查带有培养基的皮式培养皿，例如每8小时，查看小菌落的生长情况。如果快速生长的微生物并不是感兴趣的微生物，而且会导致干扰，则在这些分析循环中可破坏这些微生物的小菌落，或完全去除，需要时使用样品支撑针接触去除。这可能会降低快速生长的微生物的生长将盖过缓慢生长的微生物。可使用特定特征来鉴定缓慢生长的微生物，例如其缓慢生长，以及其他特征，例如菌落的形状和颜色，然后微生物可通过接触转移从培养基表面取下至样品支撑针上，用于分析。
[0072]图5中所示其他装置也可用于接触转移。例如，可以降低样品载板或样品支撑针至培养基表面，只使用一种仅可垂直移动的装置，例如压电控制的线性马达或小风箱，而不用一个复杂的机械手。可以用一个小泵来控制风箱的长度和接触压力。图7示一种用于降低样品支撑针的一种小型线性马达(27)装置。为到达培养基表面的每一个位置，可将培养基皿置于一个移动装置(28)上，其可在水平的两个方向上移动。这种装置支持自动化。
[0073]样品载板或样品支撑针的垂直移动装置(27)最好在支柱接合处(26)的2个尖角位置处，一方面确保相机视线不被阻挡，另一方面可以从储存容器(19)中取出样品载板或样品支撑针。储存容器(19)还可置于可水平移动的工作台(29)上。图7示例一个带有4X6 = 24样品支撑针的储存容器(19)。可在微生物包被后将样品支撑针返回储存容器。在储存容器中，仅其末端表面的疏水边界(2)位于插入孔的凹陷处。由于该边界未包被有微生物，因此不会损失微生物。
[0074]如上所述，对于放置在一个样品支撑盘的一层上的物质，也可以使用其它类型的电离方式来替代MALDI电离，例如根据EP I 200 984 BI的团簇轰击电离，根据WO2005/094389 A2的解吸电喷雾电离(DESI)或根据DE 10 2004002 729 B2的基质辅助激光解吸电离(MALDESI)。除MALDESI之外，制备一种质谱样品可主要包括在样品支撑盘上破碎微生物细胞。
【权利要求】
1.一种使用基质辅助激光解吸质谱仪对培养基表面微生物进行质谱分析的方法，包括以下步骤: (a)通过直接接触一个样品支撑盘的接触面来转移微生物， (b)所转移的微生物在样品支撑盘的接触面上被破碎细胞，微生物的分子成分被制作成MALDI样品，然后 (c)带有MALDI样品的样品支撑盘被转移至质谱仪中进行分析。
2.根据权利要求1的方法，其中针状样品支撑盘的末端表面直接接触微生物，针状样品支撑盘的接触表面的面积很小，故仅有单菌落的微生物被转移至针状样品支撑盘。
3.根据权利要求2的方法，当微生物已被转移后，将针状样品支撑盘插入至一个转接件板上，使针状样品支撑盘的末端表面基本与转接件板平齐。
4.根据权利要求3的方法，其步骤如下: -采集培养基表面的一张图像， -根据该图像确定菌落位置， -将预定位置的微生物直接转移至每个病例的针状样品支撑盘上， -将针状样品支撑盘插入至一个转接板， -从针状样品支撑盘上的微生物制备MALDI样品， -将转接板放入一台质谱仪， -在转接板上的针状样品支撑盘位置处通过基质辅助激光解吸电离获取质谱图。
5.根据权利要求2至4中任一项权利要求的方法，其中针状样品支撑盘末端表面积小于9平方毫米。
6.根据权利要求1的方法，其中板状样品支撑盘的末端表面直接接触微生物，板状样品支撑盘的接触表面的面积如此之大，使来自数个菌落的微生物可同时被转移至板状样品支撑盘。
7.根据权利要求6的方法，其中在微生物已被转移至板状样品支撑盘后，获取接触表面的一张图像，并根据图像确定板状样品支撑盘上所转移的微生物的位置。
8.根据权利要求7的方法，其中在成像后，仅在预定位置制备MALDI样品，而仅在已制备的MALDI样品上进行质谱分析。
9.根据权利要求7的方法，其中在成像后，对药品支撑盘的整个接触区域应用基质溶液，并仅在预定位置进行质谱分析。
10.根据权利要求6的方法，其中在接种待分析样品至培养基表面时，记录接种轨道，并仅沿所记录的轨道进行质谱分析。
11.根据权利要求1至10中任一项权利要求的方法，其中通过加入一种适度较强的基质溶液来破碎样品支撑盘上的微生物细胞。
12.根据权利要求1至11中任一项权利要求的方法，其中在将微生物转移至样品支撑盘之前，在培养基表面上培养微生物短于8小时。
13.根据权利要求1至12中一项权利要求的方法，其中在培养过程中反复检查培养基表面以查看微生物菌落生长情况，并在检测到菌落后进行接触转移。
14.根据权利要求1至13中任一项权利要求的方法，其中样品支撑盘的接触表面有蛋白吸附或粘附区。
15.一种使用质谱仪对培养基表面微生物进行质谱分析的方法，包括以下步骤: (a)通过直接接触将微生物转移至一个样品支撑盘的接触表面上， (b)在样品支撑盘的接触表面上对所转移的微生物进行细胞破碎，以及 (C)将带有所破碎微生物分子成分的样品支撑盘放入质谱仪中进行分析。
16.一种通过将其分子组成质谱图与参比质谱图进行比对，鉴定培养基表面生长的微生物的方法，包括以下步骤: (a)通过样品支撑盘表面直接接触培养基上的一个或多个菌落， (b)破碎所转移微生物的细胞，制备其分子成分样品用于获取样品支撑盘接触表面的质谱图，并 (C)将带有所制备样品的样品支撑盘放入质谱仪内， (d)采集微生物分子组成的质谱仪用于鉴定。
【文档编号】G01N33/569GK104380109SQ201380030065
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月6日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】彼得·拉什, 迪特尔·瑙曼, 马伦·斯坦勒, 托马斯·迈尔, 延斯·波斯迈尔 申请人:布鲁克道尔顿公司