用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒的制作方法

用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒，包括：(1)3-plex包被微球：含有分别包被了IL-1β捕获抗体、IL-6捕获抗体和Osteocalcin捕获抗体的不同颜色编码微球；(2)3-plex生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的IL-1β、IL-6和Osteocalcin的检测抗体；(3)链亲和素藻红蛋白。本发明还提供了所述试剂盒的制备方法。本发明提供的用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒具有高通量，多指标并行检测，检测快速、准确、费用低等优点。实验表明，采用本发明的试剂盒对固定义齿修复后牙周围组织不良反应及炎症风险发生率的预测准确率可达90%以上。
【专利说明】用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物类，具体地说，涉及一种用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]牙列完整是人类健康长寿和保证生活质量的重要体现。对于缺失牙齿的患者采用固定义齿修复，是由基牙承担缺失牙的咀嚼力来修复牙列缺损。固定义齿在口内戴用异物感轻，具有舒适、美观、咀嚼功能好等特点，但几千至几万元的价格相对局部义齿修复费用较高。同时固定义齿粘固在患者口内，义齿功能的发挥与基牙健康密切相关，但是患者经常在义齿出现松动、修复牙位咬合疼痛等情况下才会觉察基牙出现问题，而此时固定义齿修复失败的结果往往已不可逆转，基牙也可能因牙槽骨吸收、牙根折裂等原因导致拔除，增加患者口腔内牙齿缺失的数目，患者需面对再次修复治疗。因此，探索能在早期评估固定义齿基牙支持力改变及牙周炎症风险的技术模式及标准，对于监测固定义齿修复后基牙状况，进行早期预警和干预举措，对于降低固定修复失败风险，延长修复体的戴用寿命，避免基牙缺失十分重要。根据第3次全国口腔健康流行病学调查结果显示，全国35?44岁年龄段人群(检查32颗牙)中平均存留牙数为29.40颗，有牙齿缺失的为37.0%。全国65?74岁老年人平均存留牙数为20.97颗，有牙齿缺失的为86.1%。牙齿缺失后的及时修复对于维持患者口腔功能及提高生活质量有重要意义，而义齿修复后具有良好的功能和长期使用寿命对于牙齿缺失的患者尤为重要。
[0003]口腔銀沟液(gingival crevicalar fluid, GCF)是从銀沟渗出的液体,是人体唯一的，直接从体液渗出的液体，其成份与血清相近，含有多种细胞因子、抗体等成份。目前公认的GCF的产生模式是:微血管系统内的液体，经过内皮细胞间隙渗入到细胞间形成细胞间液，最后经过淋巴管回流吸收，当渗出大于回流时，液体就会经结合上皮细胞间隙外渗到龈沟内形成龈沟液。早期的研究证明GCF是沟内上皮和结合上皮下血管的炎性渗出；后来证实无论在炎症状态或是正常状态，由于各种因素引起渗透压的改变都可导致GCF。GCF成分主要来源于血清，其他成分来源于牙周和细菌。鉴于龈沟液的来源及性质，通过测定龈沟液某些成份的改变从而诊断或评价口腔局部及全身性疾病。
[0004]龈沟液的量可反映出牙齿周围组织的健康情况，作为评价牙齿周围组织健康状态的指标；口腔感染及应力作于牙齿都可以影响牙周组织的健康和龈沟液分泌成分的改变，例如，龈沟液中的天冬氨酸转氨酶可作为诊断牙周炎各阶段的指标；龈沟液的pH值与牙周袋深度、龈下菌斑、厌氧菌总数呈显著正相关；成人正畸加力24小时后龈沟液量增加，说明成人正畸加力24小时后炎症反应可能较重；龈沟液葡萄糖水平与血糖的变化水平相关；部分人类病毒(如HIV)感染后患者体内抗体的变化也会在龈沟液中表现，国外已开发出唾液快速检测HIV抗体的方法。但是，目前对于龈沟液的研究大多数仅限于牙周炎症情况下龈沟液中各分泌成分的改变或口腔正畸、修复临床治疗过程中施加的应力对龈沟液各分泌成分的影响，以及基牙使用的不同修复材料对龈沟液分泌的影响等方面。[0005]鉴于龈沟液产生及分泌的特点，在应力作用及牙周炎症、感染情况下龈沟液的分泌成分(如促炎症细胞因子、生物活性物质)的改变可呈现早期改变、快速上升的趋势，并且这种变化具有早于临床症状及表征出现的特点，可利用龈沟液中各生物活性物质的改变预测基牙周围组织不良反应及炎症风险的发生，从而可以进行早期预警和干预，并指导口腔临床治疗合理应用力学。
[0006]口腔内每天龈沟液的生成量仅约0.5-2.4ml，如何对少量龈沟液进行收集、并对其中各种生物活性物质进行快速的检测及评价是限制利用龈沟液进行早期诊断预测的瓶颈。国内外临床上虽然目前开展了龈沟液中炎症因子的放免分析、酶免分析等检测。但是，这些方法均是单指标的检测。而通过龈沟液的分泌成分单指标检测反映牙周微环境的状况，存在着特异性不强、灵敏度低等不足，特别是对早期炎症及骨吸收状况的检出率不高，因此不能很好的指导患者治疗。并且进行单指标的检测所需龈沟液样本量较大，费用昂贵。鉴于这种情况，发展能够同时、快速、准确检测多种龈沟液内炎症标志物的综合技术迫在眉睫。液相蛋白芯片技术正是符合这种检测需求的能够高通量、高灵敏度和低样本消耗量的检测炎症标志物的蛋白技术平台。
[0007]液相芯片，也称为微球体悬浮芯片(suspension array, liquid chip),是基于xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
[0008]龈沟液内炎症标志物简介:
[0009]I) IL-1 β (又称淋巴细胞刺激因子)，主要由活化的单核一巨噬细胞产生。
[0010]存在形式IL-1 α和IL-1 β。主要生物学功能包括在局部低浓度时发挥免疫调节:协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体。当大量产生时可诱导肝脏急性期蛋白合成；引起炎症反应、发热和恶病质。压应力会引发前体炎性递质高表达，如白细胞介素(interleukin, IL)-1 β被证实是压应力作用下产生的主要细胞因子之一。IL-1 β既可刺激地诺前列酮合成、一氧化氮(NO)产生和蛋白酶分泌，还可诱导基质金属蛋白酶(matrix metallopro-teinase,MMP)合成、增强ECM分解、抑制组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metallopro-tease, TIMP)-1I分泌。当低强度的循环性轴向张应力(形变率1.5?5%)作用于HPDLF时，ECM合成增加，表现为I型胶原、纤维素和生长因子合成增加；当高强度的循环性轴向应力(形变率6-12.5%)作用于HPDLF时，ECM分解代谢增强，由IL-1 β介导的地诺前列酮、NO、MMP等炎性因子合成增加。MMP是一类与HPDLF外基质降解十分密切的蛋白水解酶，在牙周组织更新过程中发挥着关键性的调节作用。对于IL-1 β与MMP-1之间关系的研究，Μ.Shibata等发现IL-1 β能刺激HPDLF分泌MMP-1，相较于单独应用，IL-1 β与IL-6联合应用时，这种刺激分泌的作用更为显著，而单独应用IL-6并不能使HPDLF分泌MMP-1增加。该结果提示，IL-1 β对HPDLF分泌MMP-1具有促进作用，IL-1 β与IL-6联合应用能进一步加强HPDLF对MMP-1的促进作用。有关HPDLF在张应力下MMP的分泌机制，Garlet等提出了假设:牙周膜成纤维受到张应力作用后合成细胞因子，如IL-1、IL-6，IL-1和IL-6通过HPDLF的自分泌和旁分泌机制激活MMP和--ΜΡ。激活的成纤维细胞产生血管内皮生长因子，启动血管再生，通过MMP降解ECM，促进细胞扩散和毛细血管的生长。
[0011]2) IL-6主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。主要功能包括:刺激活化B细胞增殖，分泌抗体；刺激T细胞增殖及CTL活化；刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；促进血细胞发育。IL-6是来源广泛的多功能细胞因子，在体内具有广泛的生物学效应，其多项功能可能与牙周炎的发生发展有关[36]，如IL-6可以促进牙槽骨的吸收，抑制成骨形成；降低成纤维细胞的附着力，影响牙周膜的修复和代谢功能；参与牙周炎的炎性反应等。Johnson等的研究表明，牙周炎患者炎症部位的IL-6水平明显增高，并且炎症程度与IL-6在组织中的表达成正比。近年来研究已说明在牙周炎的发展过程中，IL-6可导致牙龈炎症、牙周袋形成，是参与牙槽骨吸收破坏的重要细胞因子之一。HPDLF在生理状态下可以组成性地分泌少量IL-6，而当受到外界刺激，如炎症因子、机械力等，可分泌包括IL-6在内的若干种可溶性炎症因子。
[0012]3) Osteocalcin也称骨钙蛋白，是由成骨合成和分泌的维生素K依赖性钙结合蛋白，是一种非胶原酸性糖蛋白。因为分子中含有依赖维生素K的羧基谷氨酸残基，故又名羧基谷氨酸蛋白。 骨钙蛋白分子中的骨钙素是骨钙蛋白与钙离子结合的重要功能基团。机体骨钙蛋白有2种存在形式即羧化不全骨钙蛋白和羧化骨钙蛋白。比较血清及龈沟液中骨钙素在牙周炎患者和牙周健康者之间的差异，发现牙周炎组血清及龈沟液中骨钙素的含量明显低于牙周健康组，血清及龈沟液中骨钙素与牙周炎之间可能存在联系。

【发明内容】

[0013]本发明的目的是提供一种用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒。所述试剂盒可实现对于IL-1 β、IL-6和Osteocalcin三个指标的联合检测。
[0014]本发明的另一目的是提供上述用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒的制备方法。
[0015]为了实现本发明目的，本发明的一种用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒，所述试剂盒中包括:
[0016](1) 3-plex包被微球:含有分别包被了 IL-1 β捕获抗体、IL_6捕获抗体和Osteocalcin捕获抗体的不同颜色编码微球；
[0017](2) 3-plex生物素标记检测抗体:分别用生物素标记的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的检测抗体；以及
[0018](3)链亲和素藻红蛋白。
[0019]本发明还提供所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
[0020]( I)相应捕获抗体包被相应微球
[0021]a.取羧基微球用漩涡振荡器振荡微球悬液20s，使微球混合均匀；
[0022]b.取羧基微球IX IO6个，转移到离心管中，≥8000g离心2min，沉淀微球；
[0023]c.移走上清，加入dH20 100 μ 1，用漩涡振荡器振荡20s重悬微球，≥8000g离心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入IOOmmoI/L, pH值6.2的磷酸二氢钠盐溶液80 μ 1，用漩涡振荡器振荡20s，重悬洗涤的羧基微球；
[0024]d.加入 50mg/ml 的 N 羟基硫代玻拍酸亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodiumsaltSulfo-NHS)(用dH20稀释)10 μ I，用漩涡振荡器轻轻地振荡；
[0025]e.力卩A 50mg/ml的1-乙基_3[3_( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺[l-thyl-3-(3-Dimethylaminop ropyl)carbodiimide Hydrochloride, EDC](用 dH20 稀释)10 μ I，用漩涡振荡器轻轻振荡；
[0026]f.室温孵育20min,每隔IOmin用镟润振荡器轻振，≤8000g离心2min,沉淀活化
的羧基微球；
[0027]g.移走上清，力卩入50mmol/L, pH值5.0的2_(N_吗啡啉)乙磺酸[2-(N-Moropholino) ethanesulfonicacid, MES],镟润振荡器振荡 20s,重悬活化的羧基微球，≤8000g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗涤2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩涡振荡器振荡20s，在混匀的微球中分别加入 50 μ g IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 捕获抗体，用 50mmol/L, pH 值 5.0 的 MES 定容至500 μ I，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育2h，≤SOOOg离心2min，沉淀偶联好的微球；
[0028]h.移走上清，加入PBS-TBN 300 μ 1，漩涡振荡器振荡30s ;于室温置于摇床上孵育30min,≤8000g离心2min,沉淀偶联好的微球；
[0029]1.移走上清,加入PBS-TBN Iml,镟润振荡器振荡30s,≤8000g离心2min,沉淀偶联好的微球；重复该步骤I次，用PBS-TBN洗涤2次；
[0030]j.加入PBS-TBN Iml，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕获抗体分别与微球的偶联体；
[0031]k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2.5X105个/ml ;将偶联好的微球置于
4°C避光保存；
[0032](2) IL-1 β、IL-6和Osteocalcin检测抗体的生物素化
[0033]1.将 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 检测抗体分别用 0.lmol/L, pH 值 8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到lmg/ml，终体积为Iml ；
[0034]m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析；
[0035]η.用Iml 二甲基亚砜(DMSO)溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素(N-hydroxysuccinimide biotin, NHSB) Img ；
[0036]ο.向Iml的IL-1 β、IL_6和Osteocalcin检测抗体溶液中分别加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室温下持续搅拌，保温2-4h ；
[0037]p.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室温下搅拌lOmin，在4°C下对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上Iml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集Iml/管，蛋白质在l_3ml之间洗脱；样品加入终浓度为0.5g/L的叠氮钠及1.0g/L BSA ;将结合产物置于4 °C避光保存。
[0038]本发明中涉及的捕获抗体分别为:IL_li3捕获抗体，克隆号为P2H3 (MerckMillipore) ;IL_6 捕获抗体，克隆号为 B_E8 (Merck Millipore) ;0steocalcin 捕获抗体，克隆号为 1-22 (Merck Millipore)。[0039]本发明中涉及的检测抗体分别为:IL_10检测多克隆抗体，克隆号为EP408Y(Merck Millipore) ;IL_6 检测多克隆抗体，克隆号为 E457 (Merck Millipore)；Osteocalcin 检测多克隆抗体，克隆号为 aa 59-74 (Merck Millipore)。
[0040]本发明基于液相芯片技术，通过大量实验开发出可以对龈沟液内IL-1 β、IL-6和Osteocalcin三种炎症标志物联合快速检测的液相芯片试剂盒。研究表明，对龈沟液内三个指标的联合检测，可实现对固定义齿修复后牙周围组织不良反应及炎症风险发生率的准确预测，预测准确率达90%以上。本发明所述的用于龈沟液内早期炎性反应的液相芯片试剂盒具有无副作用、高通量、多指标并行检测、敏感度高、检测快速、重复性好等优点。该液相芯片试剂盒的制备方法简单可靠、稳定性好。
【专利附图】

【附图说明】
[0041]图1为检测IL-1 β标准曲线示意图。
[0042]图2为检测IL-6标准曲线示意图。
[0043]图3为检测Osteocalcin标准曲线示意图。
[0044]图4为固定义齿修复不同时间龈沟液内IL-1 β、IL_6、0steocalcin三种标志物动态变化示意图。
【具体实施方式】
[0045]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0046]实施例1用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒的制备
[0047]I试剂盒组成
[0048](I) 3-plex包被微球:含有分别包被了 IL-1 β捕获抗体、IL_6捕获抗体和Osteocalcin捕获抗体的不同颜色编码微球；
[0049](2) 3-plex生物素标记检测抗体:分别用生物素标记的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的检测抗体；
[0050](3)链亲和素藻红蛋白。
[0051]其中，所述的捕获抗体分别为:IL_li3捕获抗体，克隆号为P2H3 ;IL_6捕获抗体，克隆号为B-E8 ;0steocalcin捕获抗体，克隆号为1-22。
[0052]所述的检测抗体分别为:IL-1 β检测抗体，克隆号为ΕΡ408Υ ;IL_6检测抗体，克隆号为E457 ；0steocalcin检测抗体，克隆号为aa59_74。
[0053]2试剂盒的制备方法
[0054]包括以下步骤:
[0055]( I)相应捕获抗体包被相应微球
[0056]a.取羧基微球用镟润振荡器振荡微球悬液20s,使微球混合均匀；
[0057]b.取羧基微球IX IO6个，转移到离心管中，≥8000g离心2min，沉淀微球；
[0058]c.移走上清，加入dH20 100 μ 1，用漩涡振荡器振荡20s重悬微球，≥8000g离心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入IOOmmoI/L, pH值6.2的磷酸二氢钠盐溶液80μ 1，用漩涡振荡器振荡20s，重悬洗涤的羧基微球；[0059]d.加入50mg/ml的N羟基硫代琥珀酰亚胺10 μ I，用漩涡振荡器轻轻地振荡；
[0060]e.加入50mg/ml的1-乙基-3 [3-( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺10 μ I,用镟润振荡器轻轻振荡；
[0061]f.室温孵育20min,每隔IOmin用镟润振荡器轻振，≤8000g离心2min,沉淀活化
的羧基微球；
[0062]g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-0_吗啡啉)乙磺酸，漩涡振荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球，^ 8000g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗涤2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩涡振荡器振荡20s,在混匀的微球中分别加入50 μ g IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕获抗体,用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500 μ I，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育2h，≤8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；
[0063]h.移走上清，加入PBS-TBN 300 μ 1，漩涡振荡器振荡30s ;于室温置于摇床上孵育30min,≤8000g离心2min,沉淀偶联好的微球；
[0064]1.移走上清,加入PBS-TBN Iml,镟润振荡器振荡30s,≤8000g离心2min,沉淀偶联好的微球；重复该步骤I次，用PBS-TBN洗涤2次；
[0065]j.加入PBS-TBN Iml，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕获抗体分别与微球的偶联体；
[0066]k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2.5X105个/ml ;将偶联好的微球置于
4°C避光保存；
[0067](2) IL-1 β、IL-6和Osteocalcin检测抗体的生物素化
[0068]1.将 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 检测抗体分别用 0.lmol/L, pH 值 8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到lmg/ml，终体积为Iml ；
[0069]m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析；
[0070]η.用Iml 二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素Img ；
[0071]ο.向Iml的IL-1 β、IL_6和Osteocalcin检测抗体溶液中分别加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室温下持续搅拌，保温2-4h ；
[0072]ρ.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室温下搅拌lOmin，在4°C下对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上Iml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集Iml/管，蛋白质在l_3ml之间洗脱；样品加入终浓度为0.5g/L的叠氮钠及1.0g/L BSA ;将结合产物置于4 °C避光保存。
[0073]实施例2用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒的应用
[0074]I实验目的
[0075]对固定义齿修复不同时间患者龈沟液内IL-1 β、IL-6、Osteocalcin三种标志物联合检测。
[0076]2实验对象
[0077]I)在知情同意及满足纳入条件的前提下，选择入组病例，记录个人基本信息。2)记录患者固定义齿修复基本信息:包括治疗前的缺失牙位、基牙数目、基牙牙周状况、基牙松动度、咬合状况、基牙同名牙状况等。3)测定修复前(对照组)、修复后基牙GCF分泌量变化和所含因子的变化；使用滤纸条法采取患者治疗前固定义齿基牙、基牙对侧同名牙的龈沟液，每牙取6个位点:近颊、颊侧正中、远颊、远舌、舌侧正中、近舌；同时记录牙周探诊深度(PD)，牙龈指数(BI)，菌斑及软垢指数；标本至于-80°C冰箱中保存。
[0078]3试剂准备
[0079]采用实施例1中制备的试剂盒。
[0080](I)Beads:将所需Beads (微球)超声30秒，涡旋lmin，然后各取出60 μ I加入Mixing Bottle,剩余体积用Bead Diluent补足3ml,充分混勻，2-8 存一个月。
[0081](2) Quality Control:用250 μ I蒸懼水分别溶解对照I和2,颠倒多次使其充分混匀，静止5-10min，然后分别移入两个试管中，-20°C贮存一个月。
[0082](3) Standard:用250 μ I蒸懼水溶解Standard,颠倒多次使其充分混勻，静止5-10min,然后移入试管中，标记为S6。然后另取5个试管,分别标记为S5、S4、S3、S2、SI,每个管中加200 μ I Assay缓冲液，最后从S6中取出50 μ I进行梯度稀释，_20°C贮存一个月。
[0083](4) Wash Buffer:将10XWB放置室温，使其中盐分充分溶解，30mlffB+270ml蒸馏水将其配成IX (I倍)，4°c保存一个月。
[0084](5) Serum Matrix:向SM中加入Iml蒸懼水使其充分溶解,静止IOmin,然后移入试管里，_20°C贮存一个月。
[0085]实验流程:
[0086]1、向96孔板中每孔加入200μ I Wash Buffer，室温摇十分钟润洗，然后直接倒掉，
充分擦干。
[0087]2、分别加入25 μ I
[0088]OSerum Matrix 到 Background、Standard 和 Control ；
[0089]OAssay Buffer 到样品孔；
[0090]OAssay Buffer 到 Background ；
[0091]OStandard 和 Control 到各自位置；
[0092]@样品到对应样品孔；
[0093]OBeads到每个孔,4°C避光过夜振荡孵育。
[0094]3、洗板机洗2遍。
[0095]4、每孔加25 μ I检测抗体,室温避光摇lh。
[0096]5、每孔加25 μ I SAPE，室温避光摇30min。
[0097]6、洗板机洗2遍,最后每孔加150 μ I鞘液上机(Luminex系统)检测。
[0098]图1-图3分别为检测炎症标志物IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的标准曲线示意图。图4为固定义齿修复不同时间龈沟液内IL-1 β ,IL-6和Osteocalcin三种标志物动态变化示意图。
[0099]实验结果表明，对龈沟液内三个指标的联合检测，可实现对固定义齿修复后牙周围组织不良反应及炎症风险发生率的准确预测，预测准确率达90%以上。
[0100]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0101]参考文献:
【权利要求】
1.用于龈沟液内炎症标志物检测的液相芯片试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括:(I) 3-plex包被微球:含有分别包被了 IL-1 β捕获抗体、IL-6捕获抗体和Osteocalcin捕获抗体的不同颜色编码微球； (2)3-plex生物素标记检测抗体:分别用生物素标记的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin的检测抗体；以及 (3)链亲和素藻红蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体分别为:IL-li3捕获抗体，克隆号为P2H3 ;IL-6捕获抗体，克隆号为B-E8 ;Osteocalcin捕获抗体，克隆号为1_22。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体分别为:IL-li3检测多克隆抗体，克隆号为EP408Y ；IL-6检测多克隆抗体，克隆号为E457 ；Osteocalcin检测多克隆抗体，克隆号为aa 59-74。
4.制备权利要求1-3任一项所述试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)相应捕获抗体包被相应微球 a.取羧基微球用漩涡振荡器振荡微球悬液20s，使微球混合均匀； b.取羧基微球1X1O6个，转移到离心管中，≥8000g离心2min，沉淀微球； c.移走上清，加入dH20100 μ 1，用漩涡振荡器振荡20s重悬微球，≥8000g离心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入100mmol/L，pH值6.2的磷酸二氢钠盐溶液80 μ 1，用漩涡振荡器振荡20s，重悬洗涤的羧基微球； d.加入50mg/ml的N羟基硫代琥珀酰亚胺10μ 1，用漩涡振荡器轻轻地振荡； e.加入50mg/ml的1-乙基_3[3-( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺10 μ 1，用漩涡振荡器轻轻振荡； f.室温孵育20min,每隔IOmin用镟润振荡器轻振，≥8000g离心2min,沉淀活化的羧基微球； g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-0-吗啡啉)乙磺酸，漩涡振荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球，≥ 8OOOg离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2次，用.50mmol/L, pH值5.0的MES洗涤2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩涡振荡器振荡.20s,在混匀的微球中分别加入50 μ g IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕获抗体，用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500 μ I，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育2h，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球； h.移走上清，加入PBS-TBN300 μ 1，漩涡振荡器振荡30s ;于室温置于摇床上孵育.30min,≥8000g离心2min,沉淀偶联好的微球； .1.移走上清，加入PBS-TBN1ml，漩涡振荡器振荡30s，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；重复该步骤I次，用I3BS-TBN洗涤2次； j.加入PBS-TBN 1ml，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得IL-1 β、IL-6和Osteocalcin捕获抗体分别与微球的偶联体； k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2.5X IO5个/ml ;将偶联好的微球置于4°C避光保存； (2)IL-1 β、IL-6和Osteocalcin检测抗体的生物素化 .1.将 Img 的 IL-1 β、IL-6 和 Osteocalcin 检测抗体分别用 0.lmol/L, pH 值 8.0 的碳酸氢钠缓冲液稀释到lmg/ml，终体积为Iml ； m.交互用0.lmol/L, pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析； η.用Iml 二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素Img ； ο.向Iml的IL-1 β、IL-6和Osteocalcin检测抗体溶液中分别加入lg/L的NHSB溶液120 μ I ;在室温下持续搅拌，保温2-4h ； P.加入lmol/L NH4Cl溶液9.6 μ 1，在室温下搅拌lOmin，在4°C下对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上Iml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集Iml/管，蛋白质在l-3ml之间洗脱；样品加入终浓度为0.5g/L的叠氮钠及1.0g/L BSA ;将结合产物置于4°C避光保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的捕获抗体分别为:IL-li3捕获抗体，克隆号为P2H3 ;IL-6捕获抗体，克隆号为B-E8 ;Osteocalcin捕获抗体，克隆号为1_22。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的检测抗体分别为:IL-li3检测多克隆抗体，克隆号为EP408Y ；IL-6检测多克隆抗体，克隆号为E457 ；Osteocalcin检测多克隆抗体，克隆号为aa 59-74。`
【文档编号】G01N33/531GK103823054SQ201410049211
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】李茵, 张振庭 申请人:首都医科大学附属北京口腔医院