一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法
【专利摘要】本发明涉及一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，属于实验样品处理【技术领域】。本发明通过麻醉，解剖，戊二醛－甲醛磷酸盐缓冲液固定，清洗和乙醇梯度脱水样品，从而得到扫描电镜上镜前样品。本发明解决了在昆虫触角及附肢扫描电镜前期处理中，触角及附肢鳞片去除不完全，样品表面清洗不彻底，固定液浸透困难，样品变脆易折断等问题，本发明处理后的样品表面结构完好，没有变形和污染，且组织表面充分暴露，有良好导电性能，有效的反映出样品表面的真实状态。
【专利说明】—种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，属于实验样品处理【技术领域】。
【背景技术】
[0002]触角和附肢是昆虫的重要感觉器官，它们上面着生有许多不同种类的感受器，而昆虫感受器是特化的表皮部分，为昆虫感受器官的最基本结构单元和昆虫机体感知外部环境，进行化学通讯的信息接收装置。通过昆虫感受器，昆虫能够感受寄主植物中的挥发性化合物，并将此作为交配、觅食和寻找生殖场所的信息，根据这一特性可以用来监测和诱杀昆虫。利用昆虫信息素调控害虫行为是一种无公害的害虫控制技术，昆虫在求偶、觅食、聚集等活动中常常借助化学气味物质传递信息，而感受这些信息的主要器官是分布在触角及附肢上的化学感受器。在昆虫的种间和种内化学通讯、声音通讯及触觉通讯中，昆虫感器起着重要的作用，通过触角及附肢表面不同类型的感受器，昆虫机体可感知外界环境、进行求偶和取食。在植物与昆虫间的化学通讯中，昆虫感器也起着决定性的作用，它调控着昆虫的多种行为，诸如引诱昆虫趋向寄主植物，刺激昆虫取食，引导昆虫选择产卵场所，进行传粉和防御昆虫等。因此，明确昆虫的感器种类，特征及分布，以期深入了解其化学感受系统，为研究其化学通讯系统提供组织学和形态学依据，并为进一步研制昆虫引诱剂或行为干扰剂奠定基础，从而达到防治害虫的目的奠定理论基础。
[0003]扫描电子显微镜，是自上世纪60年代作为商用电镜面世以来迅速发展起来的一种新型的电子光学仪器，是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。它能产生样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维，扫描电子显微镜能被用来鉴定样品的表面结构。在扫描电镜实验中，多数昆虫成虫活泼，幼虫多数形体较小，而触角和附肢等器官难以获得完整样品，而该类样品表面覆盖鳞片，体壁骨化程度高，组织致密，且多数昆虫体表背覆蜡质层，造成电镜处理中样品前处理困难。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，解决了昆虫触角及附肢扫描电镜前期处理中，触角及附肢鳞片去除不完全，样品表面清洗不彻底，无法去除昆虫触角及附肢蜡质层，固定液浸透困难，样品变脆易折断等问题。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，包括以下步骤:
(I)样品固定液、清洗液、麻醉液的准备
a.样品固定液:按重量百分比，戊二醛一甲醛磷酸盐缓冲液组成为戊二醛1_4%，甲醛30-45%，余量为磷酸盐缓冲液；
b.样品清洗液:
清洗液1:配制0.05mol/L的碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积2.5-5%的蛋清，即得清洗液I ;
清洗液I1:其成分组成为氯化钠6.0-7.2g，次氯酸钠0.12-0.16g，氯化钙0.12-0.14g，氯化钾0.11-0.15g和蒸馏水IL ；
c.样品麻醉液:
配制50%的酒精水溶液，加入乙醚，使乙醚最终体积浓度达到1.2-3.5% ；
(2)麻醉昆虫:用指形管扣住成虫，用镊子夹住棉球蘸麻醉液，棉球堵住平放的管口完全麻醉昆虫；
(3)解剖昆虫:在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪剪取步骤(2)处理后的昆虫的完整触角及附肢；
(4)固定样品:将解剖后的样品迅速投入装有固定液的离心管中离心，直到样品完全到达固定液液面以下；接着摇床振荡，使得固定液与样品混匀，置于室温下固定2-8h ；
(5)清洗样品:经步骤(4)固定后的样品，轻移到步骤(I)新制的清洗液I中，边浸泡边在摇床上振荡，第一次振荡20-40min ;第二次及以后清洗换取清洗液II，每次振荡10-15min，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中看不到表层蜡质层漂浮；最后用双蒸水洗2-4次，每次5-10min ；
(6)样品脱水:乙醇梯度脱水，然后置于100%乙醇保存；
(7)粘样观察:用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱中挥发完毕酒精，接着昆虫解剖显微镜初步观察，微调使得样品暴露部分各尽可能在同一平面上，然后上扫描电镜观察。
[0006]所述的步骤(I)样品固定液的配制中所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L-0.05mol/L, pH为7.0-7.4，缓冲液具体制备方法为:在500-800mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾KH2PO4 1.4-7.0g、二水合磷酸氢二钠 Na2HPO4.2H20 1.8-9.0g、氯化钠 0.58-2.9g 和氯化钾
0.7-3.5g，然后加入I mol/L盐酸调pH至7.0-7.4，高温高压灭菌后置于4°C冰箱保存。
[0007]所述的步骤(I)中样品固定液的配制方法为:在磷酸盐缓冲溶液中添加质量浓度25%的戊二醛溶液和质量浓度38%的甲醛溶液，使戊二醛质量百分浓度为1_4%，甲醛质量百分浓度为30-45%。
[0008]所述的步骤(I)的清洗液II的制备方法为:依次将氯化钠6.0-7.2g，次氯酸钠0.12-0.16g和氯化钾0.11-0.15g溶解在60-100mL蒸馏水中，然后用蒸馏水稀释到940-990mL ;最后取0.12-0.14g氯化钙溶解在10_60mL蒸馏水中，得到氯化钙溶液，然后把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴，边搅拌，直到完全溶解。
[0009]所述步骤(2)麻醉时间3_5s。
[0010]所述步骤(4)离心条件为:8000-12000r/min离心20-45s ;振荡条件为:在37度摇床80-100r/min振荡25_40min ;步骤(4)处理后的样品需要过夜，则需要置于4°C冰箱中保存。
[0011]所述步骤(6)乙醇梯度脱水依次用50%乙醇脱水8-15min、60%乙醇脱水10-15min、70% 乙醇脱水 14_20min、80% 乙醇脱水 15_20min、90% 乙醇脱水 15_25min，100% 乙醇脱水2-3次,每次15-25min。
[0012]所述的步骤(7)的通风橱风速为:0.4-0.6m/s。
[0013]本发明的积极有益效果: 1.本发明原料及试剂易得，价格低廉，操作简单；
2.本发明的固定液为戊二醛一甲醛磷酸缓冲液，克服了单独用戊二醛或甲醛单独固定造成的固定不彻底，样品变脆易折等问题，更易浸透样品表面鳞片及蜡质层，而加入磷酸缓冲液更平衡了解剖后昆虫体液渗透压不稳，克服了样品固定中的变形影响，且固定能力强，固定过程中不用更换固定液，步骤简便；
3.本发明清洗液？？中蛋清的加入，不仅可以去除昆虫触角及附肢的表皮污物，更利于样品表面鳞片及蜡质层的去除，再经过样品清洗液II多次漂洗，能完全去除样品表面的被覆的鳞片及蜡质层，使得感器彻底暴露；
4.本发明经过乙醇梯度脱水后，通风橱中挥发酒精，样品直接上镜观察，省去了干燥、喷金步骤，且样品伸展性，稳定性和导电性良好，各感器彻底暴漏，扫描电镜下清楚可见。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为传统方法制作的二点委夜蛾雌成虫触角电子扫描电镜照片；
图2为本发明实施例1的制作的二点委夜蛾雌成虫触角电子扫描电镜照片；
图3为本发明实施例2的制作的二点委夜蛾雌成虫触角电子扫描电镜照片；
图4为本发明实施例3的制作的二点委夜蛾雌成虫触角电子扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0015]下面结合一些具体实施例对本发明进一步说明。
[0016]样品来源:田间探照灯诱虫器诱集二点委夜蛾，羽化3天成虫。
[0017]实施例1
二点委夜蛾成虫触角扫描电镜样品制备步骤如下:
(1)样品固定液、清洗液、麻醉液的准备
配制磷酸盐缓冲液:在800mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾KH2PO4 1.4g、二水合磷酸氢二钠Na2HPO4.2Η20 1.8g、氯化钠0.58g和氯化钾0.7g，然后加入lmol/L盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4°C冰箱保存。
[0018]样品固定液的配制:用上述磷酸缓冲液与市售的质量浓度25%的戊二醛溶液和市售质量浓度38%的甲醛溶液配置成戊二醛-甲醛磷酸盐缓冲液，使戊二醛质量百分含量为1%，甲醒质量百分含量为30%。
[0019]样品清洗液的配制:样品清洗液I为:配制0.05mol/L碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积2.5%的蛋清，即得清洗液I ;
清洗液I1:其成分组成为氯化钠6.0g，次氯酸钠0.12g，氯化钙0.12g，氯化钾0.12g和蒸馏水IL ；
具体制备步骤为:依次将氯化钠，次氯酸钠和氯化钾分别溶解在IOOmL蒸馏水中，然后用蒸馏水稀释到950mL ;最后取氯化钙溶解在50mL蒸馏水中，得到氯化钙溶液，然后把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴、边搅拌，直到完全溶解；
昆虫麻醉液的配制:配制50%的酒精水溶液，再加入乙醚，直至乙醚最终浓度达到1.2% ；
(2)二点委夜蛾成虫麻醉:在黑暗条件下用直径为2-4cm，长度为5cm的灭菌玻璃指形管从虫笼中扣取二点委夜蛾成虫，用镊子夹住棉球蘸少许麻醉液，棉球堵住平放的管口3_4s，虫子完全被麻醉；
(3)二点委夜蛾成虫触角解剖:在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪将麻醉失去知觉的虫子完整的剪掉触角；
(4)固定样品:将解剖后的二点委夜蛾触角迅速投入装有固定液的离心管中，雌雄分开，待所需固定的样品全部收集完毕，12000 r/min离心45s，直到样品完全到达固定液液面以下，37度摇床100r/min振荡30min,使得固定液与样品混勻彻底,置于室温下固定4h ；
(5)清洗样品:经固定后的样品，轻移到新鲜特制的清洗液I中，边浸泡边在摇床上第一次振荡30min，第二次及以后清洗换取清洗液II，振荡时间为lOmin，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中表层蜡质层漂浮，最后用双蒸水洗3次,每次IOmin ；
(6)样品脱水:乙醇梯度脱水依次用50%乙醇脱水10min、60%乙醇脱水12min、70%乙醇脱水14min、80%乙醇脱水16min、90%乙醇脱水20min, 100%乙醇脱水2次,每次20min。脱水步骤后，重新置于100%乙醇保存；
(7)粘样观察:样品从100%乙醇用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱放置，通风橱风速为0.4m/s，待酒精完全挥发干净，昆虫解剖显微镜初步观察，微调使得样品暴露部分各尽可能在同一平面上，然后上扫描电镜观察，见图2。
[0020]实施例2
二点委夜蛾成虫触角扫描电镜样品制备步骤如下:
(1)样品固定液、清洗液、麻醉液的准备
配制磷酸盐缓冲液:在500mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾KH2PO4 4.2g、二水合磷酸氢二钠Na2HPO4.2H20 5.4g、氯化钠1.74g和氯化钾2.lg，然后加入I mol/L盐酸调pH至7.2，高温高压灭菌后置于4°C冰箱保存。
[0021]样品固定液的配制:用上述磷酸缓冲液与市售的质量浓度25%的戊二醛溶液和市售质量浓度38%的甲醛溶液配置成戊二醛-甲醛磷酸盐缓冲液，使戊二醛质量百分含量为3%,甲醛质量百分含量为40%。。
[0022]样品清洗液的配制:样品清洗液I为:配制0.05mol/L碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积4%的蛋清，即得清洗液I ;
清洗液I1:其成分组成为氯化钠6.6g，次氯酸钠0.14g，氯化钙0.14g，氯化钾0.1lg和蒸馏水IL ；
具体制备步骤为:依次将氯化钠，次氯酸钠和氯化钾溶解在60mL蒸馏水中，然后用蒸馏水稀释到940mL ;最后取氯化钙溶解在60mL蒸馏水中，，得到氯化钙溶液，然后把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴、边搅拌，直到完全溶解；
昆虫麻醉液的配制:配制50%的酒精水溶液，再加入乙醚，直至乙醚最终浓度达到
3.0% ；
(2)二点委夜蛾成虫麻醉:在黑暗条件下用直径为2-4cm，长度为5cm的灭菌玻璃指形管从虫笼中扣取二点委夜蛾成虫，用镊子夹住棉球蘸少许麻醉液，棉球堵住平放的管口3_3s，虫子完全被麻醉；
(3)二点委夜蛾成虫触角解剖:在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪将麻醉失去知觉的虫子完整的剪掉触角；
(4)固定样品:将解剖后的二点委夜蛾触角迅速投入装有固定液的离心管中，雌雄分开，待所需固定的样品全部收集完毕，8000r/min离心30s，直到样品完全到达固定液液面以下，37度摇床80r/min振荡40min,使得固定液与样品混勻彻底,置于室温下固定8h ；
(5)清洗样品:经固定后的样品，轻移到新鲜特制的清洗液I中，边浸泡边在摇床上第一次振荡20min，第二次及以后清洗换取清洗液II，振荡时间为12min，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中表层蜡质层漂浮，最后用双蒸水洗2次,每次5min ；
(6)样品脱水:乙醇梯度脱水依次用50%乙醇脱水8min、60%乙醇脱水10min、70%乙醇脱水20min、80%乙醇脱水15min、90%乙醇脱水15min, 100%乙醇脱水2次,每次16min。脱水步骤后，重新置于100%乙醇保存；
(7)粘样观察:样品从100%乙醇用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱放置，通风橱风速为0.6m/s，待酒精完全挥发干净，昆虫解剖显微镜初步观察，微调使得样品暴露部分各尽可能在同一平面上，然后上扫描电镜观察，见图3。
[0023]实施例3
二点委夜蛾成虫触角扫描电镜样品制备步骤如下:
(1)样品固定液、清洗液、麻醉液的准备
配制磷酸盐缓冲液:在700mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾KH2PO4 7.0g、二水合磷酸氢二钠Na2HPO4.2H20 9.0g、氯化钠2.9g和氯化钾3.5g，然后加入lmol/L盐酸调pH至7.0，高温高压灭菌后置于4°C冰箱保存。
[0024]样品固定液的配制:用上述磷酸缓冲液与市售的质量浓度25%的戊二醛溶液和市售质量浓度38%的甲醛溶液配置成戊二醛-甲醛磷酸盐缓冲液，使戊二醛质量百分含量为4%,甲醛质量百分含量为45%。
[0025]样品清洗液的配制:样品清洗液I为:配制0.05mol/L碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积5%的蛋清，即得清洗液I ;
清洗液I1:其成分组成为氯化钠7.2g，次氯酸钠0.16g，氯化钙0.13g，氯化钾0.15g和蒸馏水IL ；
具体制备步骤为:依次将氯化钠，次氯酸钠和氯化钾溶解在70mL蒸馏水中，然后用蒸馏水稀释到990mL ;最后取氯化钙溶解在IOmL蒸馏水中，，得到氯化钙溶液，然后把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴、边搅拌，直到完全溶解；
昆虫麻醉液的配制:配制50%的酒精水溶液，再加入乙醚，直至乙醚最终浓度达到
3.5% ；
(2)二点委夜蛾成虫麻醉:在黑暗条件下用直径为2-4cm，长度为5cm的灭菌玻璃指形管从虫笼中扣取二点委夜蛾成虫，用镊子夹住棉球蘸少许麻醉液，棉球堵住平放的管口 5s，虫子完全被麻醉；
(3)二点委夜蛾成虫触角解剖:在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪将麻醉失去知觉的虫子完整的剪掉触角；
(4)固定样品:将解剖后的二点委夜蛾触角迅速投入装有固定液的离心管中，雌雄分开，待所需固定的样品全部收集完毕，10000r/min离心20s，直到样品完全到达固定液液面以下，37度摇床90r/min振荡25min,使得固定液与样品混勻彻底,置于室温下固定2h ；
(5)清洗样品:经固定后的样品，轻移到新鲜特制的清洗液I中，边浸泡边在摇床上第一次振荡40min，第二次及以后清洗换取清洗液II，振荡时间为15min，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中表层蜡质层漂浮，最后用双蒸水洗4次，每次8min ；
(6)样品脱水:乙醇梯度脱水依次用50%乙醇脱水15min、60%乙醇脱水15min、70%乙醇脱水15min、80%乙醇脱水20min、90%乙醇脱水25min, 100%乙醇脱水3次,每次15min。脱水步骤后，重新置于100%乙醇保存；
(7)粘样观察:样品从100%乙醇用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱放置，通风橱风速为0.5m/s，待酒精完全挥发干净，昆虫解剖显微镜初步观察，微调使得样品暴露部分各尽可能在同一平面上，然后上扫描电镜观察，见图4。
[0026] 结果分析
参见图1-4，由图可知:利用本发明处理二点委夜蛾成虫后，鳞片完全去除，感器清楚可见，传统方法处理的扫描电镜样品，被覆鳞片不能完全去除，大部分感器未能暴露。
【权利要求】
1.一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)样品固定液、清洗液、麻醉液的准备 a.样品固定液:按重量百分比，戊二醛一甲醛磷酸盐缓冲液组成为戊二醛1_4%，甲醛30-45%，余量为磷酸盐缓冲液； b.样品清洗液: 清洗液1:配制0.05mol/L的碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积2.5-5%的蛋清，即得清洗液I ; 清洗液I1:其成分组成为氯化钠6.0-7.2g，次氯酸钠0.12-0.16g，氯化钙0.12-0.14g，氯化钾0.11-0.15g和蒸馏水IL ； c.样品麻醉液: 配制50%的酒精水溶液，加入乙醚，使乙醚最终体积浓度达到1.2-3.5% ； (2)麻醉昆虫:用指形管扣住成虫，用镊子夹住棉球蘸麻醉液，棉球堵住平放的管口完全麻醉昆虫； (3)解剖昆虫:在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪剪取步骤(2)处理后的昆虫的完整触角及附肢； (4)固定样品:将解剖后的样品迅速投入装有固定液的离心管中离心，直到样品完全到达固定液液面以下；接着摇床振荡，使得固定液与样品混匀，置于室温下固定2-8h ； (5)清洗样品:经步骤(4)固定后的样品，轻移到步骤(1)新制的清洗液I中，边浸泡边在摇床 上振荡，第一次振荡20-40min ;第二次及以后清洗换取清洗液II，每次振荡10-15min，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中看不到表层蜡质层漂浮；最后用双蒸水洗2-4次，每次5-10min ； (6)样品脱水:乙醇梯度脱水，然后置于100%乙醇保存； (7)粘样观察:用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱中挥发完毕酒精，接着昆虫解剖显微镜初步观察，然后上扫描电镜观察。
2.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(1)样品固定液的配制中所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L-0.05 mol/L,pH为7.0-7.4，缓冲液具体制备方法为:在500-800mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾KH2PO41.4-7.0g、二水合磷酸氢二钠 Na2HPO4.2H20 1.8-9.0g、氯化钠 0.58-2.9g 和氯化钾0.7-3.5g，然后加入I mol/L盐酸调pH至7.0-7.4，高温高压灭菌后置于4°C冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(1)中样品固定液的配制方法为:在磷酸盐缓冲溶液中添加质量浓度25%的戊二醛溶液和质量浓度38%的甲醛溶液，使戊二醛质量百分浓度为1_4%，甲醛质量百分浓度为30-45%ο
4.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(1)清洗液II的制备方法为:依次将氯化钠6.0-7.2g，次氯酸钠0.12-0.16g和氯化钾0.11-0.15g溶解在60-100mL蒸馏水中，然后用蒸馏水稀释到940-990mL;最后取0.12-0.14g氯化钙溶解在10-60mL蒸馏水中，得到氯化钙溶液，然后把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴边搅拌,直到完全溶解。
5.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(2)麻醉时间3-5s。
6.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(4)离心条件为:8000-12000r/min离心20_45s ;振荡条件为:在37度摇床80-100r/min振荡25-40min ;步骤(4)处理后的样品需要过夜，则需要置于4°C冰箱中保存。
7.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(6)乙醇梯度脱水依次用50%乙醇脱水8-15min、60%乙醇脱水10_15min、70%乙醇脱水14-20min、80%乙醇脱水15_20min、90%乙醇脱水15_25min，100%乙醇脱水2_3次，每次 15-25min。
8.根据权利要求1所述的一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，其特征在于，步骤(7)中通风橱 的风速为0.4-0.6m/s。
【文档编号】G01N1/28GK103868768SQ201410051505
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】田彩红, 封洪强, 王瑛, 胡永敏, 高丽娜, 邱峰, 李国平, 黄建荣 申请人:河南省农业科学院植物保护研究所