一种金黄色葡萄球菌肠毒素d的免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，以及该免疫胶体金试纸条的制备方法，属于免疫检测【技术领域】。该试纸条由样品垫、涂覆金标标记抗SED抗体5F2（CGMCCNo.7212）的金标垫，在检测线、质控线分别包被有抗SED抗体10F1（CGMCCNo.7213）和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜构成，依次按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘附在PVC底板上。该试纸条操作简便、快速、准确，检测全过程只需5分钟，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，最低检测限为0.25ng/mL。本发明适用于海关、企业、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测。
【专利说明】一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，以及该免疫胶体金试纸条的制备方法，可以实现金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测诊断，适用于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测与应急处理，属于免疫检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌,虽然近年来不断有新型的金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin, SE)被发现,但肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。从生牛乳、生肉及乳酪中分离的金黄色葡萄球菌以产生D型肠毒素为主。
[0003]在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100°c 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。
[0004]近年来，ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，但胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，因此对于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉。
[0006]本发明另一个目的在于提供一种免疫胶体金试纸条的制备方法，包括抗SED特异性抗体的制备，SED双抗体检测抗体的筛选，SED免疫胶体金检测试纸条的制备。该试纸条操作简便、快速、准确，检测全过程只需5分钟，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度闻，最低检测限为0.25ng/mL0本发明适用于海关、企业、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测。
[0007]本发明的技术方案，一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；
PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有金标垫；所述金标垫一端与样品垫相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上；
所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。
[0008]所述金标垫包被有金标标记的抗SED抗体5F2 (CGMCC N0.7212)。[0009]所述检测线上包被有抗SED抗体IOFl (CGMCC N0.7213)。
[0010]所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
[0011]所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，步骤如下:
(I)抗SED特异性单克隆抗体的制备:
以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个单克隆抗体细胞株；
免疫程序如下:第一周进行首免，IOyg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，8 μ g/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，6 μ g/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的小鼠;第八周进行冲刺免疫，4 μ g/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合。筛选采用间接ELISA进行，共筛选到10个细胞株。
[0012](2)特异性SED双抗体检测抗体的筛选:
将步骤(1)纯化后的10株单克隆抗体细胞株分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，直接法鉴定标记成功后进行双抗体夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需抗SED抗体；其中5F2为金标抗体，IOFl为包被抗体；
(3)金黄色葡萄球菌肠毒素D免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
a、空白胶体金的制备:
采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL质量浓度为1%的氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL质量浓度为1%的柠檬酸钠，继续加热15~20分钟，至呈亮红色，然后室温中冷却，4°C冷藏保存；
b、胶体金标记抗体的制备:
空白胶体金溶液用0.1M的K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每毫升空白胶体金溶液加入30 μ g抗体5F2 (CGMCC N0.7212)，继续搅拌30分钟，离心，吸取上清液，用金标抗体保存液重旋；
C、金标垫的制备:
调试三维平面点膜喷金仪仪器，将标记好胶体金的抗SED抗体5F2 (CGMCC N0.7212)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6μL/cm，37°C:烘干过夜，封袋备用；d、包被膜的制备:
调试三维平面点膜喷金仪仪器，将稀释好的抗SED抗体IOFl (CGMCC N0.7213)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.6μ L /cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用；
将PVC底板、硝酸纤维素膜检测层、样品垫、金标垫、检测线、质控线和吸水垫组合，SP得产品金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条。
[0013]其适用于海关、企业、医院、检验检疫单位，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测,最低检测限为0.25ng/mL。
[0014]本发明试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用SED特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有SED。当待检样品中含有SED时，抗原先和胶体金标记的抗SED抗体(5F2)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的抗SED抗体(IOFl)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0015]本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、检测速度快，全过程只需要5分钟即可，可以试验大批量样品的快速检测；
2、灵敏度高，最低检测限为0.25ng/mL ；
3、操作简便，无需经过专业培训，易于推广；
4、不需要仪器，适合现场检测；
5、过程简单，直接上样检测，样本量少。
[0016]生物材料样品保藏:
1、一株单克隆细胞株，细胞株12号，株号为5F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC N0.7212，保藏曰期为2013年I月23日。
[0017]2、一株单克隆细胞株，细胞株13号，株号为10F1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC N0.7213，保藏曰期为2013年I月23日。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明试纸条结构主视图。
[0019]图2是本发明试纸条结构俯视图。
[0020]附图标记说明:1、PVC底板；2、硝酸纤维素膜检测层；3、样品垫；4、金标垫；5、检测线(T线)；6、质控线(C线)；7、吸水垫。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
如图1-2所示，一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板1，在PVC底板I两端分别设有样品垫3和吸水垫7 ；
PVC底板I中部设置有硝酸纤维素膜检测层2，在硝酸纤维素膜检测层2与样品垫3之间设置有金标垫4 ;所述金标垫4 一端与样品垫3相连接叠放,另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层2上；
所述硝酸纤维素膜检测层2上依次设置有检测线(T线)5和质控线(C线)6。
[0022]所述金标垫4包被有金标标记的抗SED抗体5F2。所述检测线(T线)5上包被有抗SED抗体IOFl。所述质控线(C线)6上包被有羊抗鼠IgG。
[0023]实施例2
所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法,金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其步骤是:
(I)抗SED特异性单克隆抗体的制备:
以重组表达的SED (北京军事医学科学院)为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免，IOyg /只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，8yg /只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，6yg /只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的小鼠；第八周进行冲刺免疫，4yg /只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合。筛选采用间接ELISA进行，共筛选到10个细胞株。
[0024](2 )特异性SED双抗体检测抗体的筛选
将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，直接法鉴定标记成功后进行双抗体夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要抗SED抗体。其中5F2为金标抗体，IOFl为包被抗体。
[0025](3)金黄色葡萄球菌肠毒素D免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
a、空白胶体金的制备:
采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%柠檬酸钠，继续加热15?20分钟，至呈亮红色，然后室温中冷却，4 °C冷藏保存；
b、胶体金标记抗体的制备:
空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节PH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度抗体，每毫升胶体金加入30 μ g抗体5F2，继续搅拌30分钟，离心，吸取上清，用金标抗体保存液重旋；
C、金标垫的制备:
调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将标记好胶体金的抗SED抗体5F2均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6 μ L /cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用；d、包被膜的制备:
调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将稀释好的抗SED抗体IOFl均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.6 μ L/cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用。
[0026]将PVC底板1、硝酸纤维素膜检测层2、样品垫3、金标垫4、检测线5、质控线6和吸水垫7组合，即得产品金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条。
[0027]本发明试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用SED特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有SED。当待检样品中含有SED时，抗原先和胶体金标记的抗SED抗体(5F2)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的抗SED抗体(IOFl)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0028]检测时如样品为阴性，则试纸条只有质控线C线显色；如果样品为阳性，肠毒素含量值大于0.25ng/mL，则试纸条质控线C线、检测线T线均显色。如果试纸条C线不显色，则说明试纸条质量出现问题。
【权利要求】
1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:包括PVC底板(I)，在PVC底板(I)两端分别设有样品垫(3 )和吸水垫(7 ); PVC底板(I)中部设置有硝酸纤维素膜检测层(2)，在硝酸纤维素膜检测层(2)与样品垫(3)之间设置有金标垫(4);所述金标垫(4) 一端与样品垫(3)相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层(2)上； 所述硝酸纤维素膜检测层(2)上依次设置有检测线(5)和质控线(6)。
2.根据权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:所述金标垫(4)包被有金标标记的抗SED抗体5F2。
3.根据权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:所述检测线(5)上包被有抗SED抗体IOFl。
4.根据权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:所述质控线(6)上包被有羊抗鼠IgG。
5.权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其特征在于步骤如下: (1)抗SED特异性单克隆抗体的制备: 以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个单克隆抗体细胞株； (2)特异性SED双抗体检测抗体的筛选: 将步骤(1)纯化后的10株单克隆抗体细胞株分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行双抗体夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需抗SED抗体；其中5F2为金标抗体，IOFl为包被抗体； (3)金黄色葡萄球菌肠毒素D免疫胶体金快速检测试纸条的制备: a、空白胶体金的制备: 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL质量浓度为1%的氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL质量浓度为1%的柠檬酸钠，继续加热15~20分钟，至呈亮红色，然后室温中冷却，4°C冷藏保存； b、胶体金标记抗体的制备: 空白胶体金溶液用0.1M的K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每毫升空白胶体金溶液加入30 μ g抗体5F2，继续搅拌30分钟，离心，吸取上清液，用金标抗体保存液重旋； C、金标垫的制备: 调试三维平面点膜喷金仪仪器，将标记好胶体金的抗SED抗体5F2均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6 μ L/cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用； d、包被膜的制备: 调试三维平面点膜喷金仪仪器，将稀释好的抗SED抗体IOFl均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.6yL /cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用； 将PVC底板(I)、硝酸纤维素膜检测层(2)、样品垫(3)、金标垫(4)、检测线(5)、质控线(6)和吸水垫(7)组合，即得产品金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条。
6.权利要求1所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条的应用，其特征在于:其适用于海关、企业、医院、检验检疫单位，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测,最低检测限为0.25ng/mL。`
【文档编号】G01N33/577GK103760354SQ201410051501
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】徐丽广, 胥传来, 孔德昭, 匡华, 马伟, 宋珊珊, 刘丽强 申请人:江南大学