钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于纳米技术与检测领域，具体涉及一种钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯的合成方法与应用。该材料以石墨烯为基底，具有大比表面积；具有超顺磁性，利于后续分离分析；同时将钛、锡两种金属进行掺杂形成双金属氧化物，掺杂比例为1：1，使得对磷酸化肽段具有优异的富集效果。同时该合成方法简单、成本低，具有巨大的推广应用潜力。
【专利说明】钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料与检测领域，具体涉及一种用于选择性富集磷酸化肽段的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，蛋白质组学已成为发展最快的生物研究领域之一，成为生命科学研究不可或缺的一部分。在众多的翻译后修饰中，蛋白质磷酸化及糖基化在体内分布最广、影响最多，与生命活动最为密切相关。蛋白质磷酸化调节着生物体内许多重要的生理活动和细胞活动如信号传递、细胞分裂、增殖、分化以及新陈代谢。生物质谱技术作为后基因组学研究的核心技术之一，已经被广泛的应用于蛋白质翻译后修饰的研究，然而对于纷繁复杂的生物体系而言，以质谱为主要研究手段的蛋白质磷酸化研究，仍然面临着诸多问题，如:修饰肽段化学计量水平低、存在强的背景干扰，同时质谱检测前样本处理过程复杂且损失严重。因此特异的富集技术与快速灵敏的检测手段成为蛋白质磷酸化的关键。
[0003]二氧化钛和二氧化锡都是磷酸化肽段富集的金属氧化物亲和探针，但将钛-锡掺杂形成的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物具有飞跃的富集效果。磁性四氧化三铁微球有着成熟简便的合成工艺，成本低廉，具有良好的磁性。在外加磁场的作用下可以简便的将材料与溶液体系分离，大大简化了由于离心等其他分离手段带来的实验操作步骤。石墨烯具有大的比表面积，与四氧化三铁结合可形成优良的载体。
[0004]因此，可以提出一种用于选择性富集磷酸化肽段的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰修饰的磁性石墨烯材料的合成及其应用。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰修饰的磁性石墨烯材料的合成方法及其应用。
[0006]本发明提出的一种钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法，具体步骤如下:
[0007](I)将石墨烯溶解于浓硫酸中，搅拌6-12个小时，其中，石墨烯与浓硫酸的比例为0.40-0.50g:50_100mL ；
[0008](2)将步骤(I)所得的产物进行离心，用去离子水清洗直至清洗液呈中性；
[0009](3)将步骤(2)所得的产物在50°C条件下干燥，得到酸化石墨烯；
[0010](4)将步骤(3)所得的产物，加入至乙二醇中，步骤(3)所得产物与乙二醇比例为0.30-0.40g:40_50mL ；
[0011](5)在搅拌情况下，将FeCl3.6H20、柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇加入至步骤
(4)所得产物中，其中FeCl3.6H20、柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇的比例为0.18-0.20mg:
0.15-0.20g:2.5-2.6g:1.8-2.0g ；[0012](6)将步骤(5)所得产物加入高压反应釜，在200°C条件下反应9.5-10.5小时；
[0013](7)将步骤(6)中高压反应釜冷却至室温，利用磁性分离技术分离和洗涤所得产物，得到磁性石墨烯；
[0014](8)将步骤(7)所得产物修饰上钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰，即得
所需产品。
[0015]本发明中，步骤(8)中钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球的合成步骤具体如下:
[0016](8.1)将钛酸丁酯、SnCl4AH2O分散至乙醇中，超声0.5-1小时，得到均相溶液，其中钛酸丁酯、SnCl4.5H20 与乙醇的配比为 0.5-lmL:0.3-0.6g:50-100mL ；
[0017](8.2)将磁性石墨烯分散至步骤(8.1)所得溶液中，超声0.5-1.0小时，两者的比例为 0.015-0.03g:50-100mL ；
[0018](8.3)将50mL水和IOmL乙醇混合，搅拌均勻；
[0019](8.4)将步骤(8.3)所得的溶液在机械搅拌条件下，于0.5小时内逐滴加入至步骤
(2)所得溶液中；
[0020](8.5)将步骤(8.4)所得的溶液于室温下继续搅拌8小时，使反应充分进行；
[0021](8.6)利用磁铁对步骤(8.5)所得的产物进行收集，用乙醇和水反复清洗3次以除去产物表面的杂质；
[0022](8.7)将步骤(8.6)所得的产物在50°C条件下干燥；
[0023](8.8)将步骤(8.7)所得产物于400°C条件下煅烧2小时，即得所需材料。
[0024]本发明中，将得到的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料作为磷酸化肽段富集的应用，具体为:将肽段与钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料充分混合，分散均匀，在37°C _38°C下振荡酶解25-30分钟，利用磁铁将钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料与溶液分离，洗涤材料3次后，再进行洗脱，得到纯化的磷酸化肽段。
[0025]将原本得不到磷酸化肽段信号的蛋白酶解液，利用该种材料进行富集后质谱检测，可以得到条数众多、信噪比高的磷酸化肽段信号，此项富集已实践于酪蛋白酶解液、酪蛋白与牛血清白蛋白混合溶液酶解液与小鼠鼠脑酶解液等多项试验中获得成功。
[0026]本发明的有益效果在于:磁性四氧化三铁微球的引入可以简便的将材料与溶液体系分离，大大简化了实验操作。将钛-锡双金属在原子水平杂化，使得其对磷酸化肽段的富集效果大大超出了简单的钛、锡氧化物小球的加和，显示出了对于磷酸化肽段的高效的特异性和选择性富集。其合成方法简单、成本低，富集效果优异，可以为磷酸化组学的研究提供一种新型、快捷的研究手段。
[0027]【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯扫描电子显微镜图；
[0029]图2为(a)石墨烯上的磁球、(b)石墨烯上的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球与磁球对比与(C)石墨烯上的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球的透射电子显微镜照片，(d)为钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球高分辨率透射电子显微镜，比例尺分别为 200nm、0.2 μ m、IOOnm 和 5nm ；[0030]图3为钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的元素分析谱图；
[0031]图4为实施例2中IOng/ μ L的磷酸化肽段(a)富集前和(b)利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集后质谱图；
[0032]图5为实施例3中1.0pg/ μ L的磷酸化肽段(a)富集前和(b)利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集后质谱图；
[0033]图6为实施例4中质量比1:10的酪蛋白与牛血清白蛋白混合蛋白酶解液(a)富集前和(b)利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集后质谱图；
[0034]图7为实施例4中质量比1:1000的酪蛋白与牛血清白蛋白混合蛋白酶解液(a)富集前和(b)利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集后质谱图；
[0035]其中，*为磷酸化肽段峰，O为脱磷酸肽段碎片峰。
【具体实施方式】
[0036]下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0037]实施例1
[0038]磁性石墨烯材料的合成步骤如下:
[0039](I)将0.40g石墨烯溶解于50mL浓硫酸中，搅拌6个小时；
[0040](2)将步骤(I)所得的产物进行离心，用去离子水清洗直至清洗液呈中性；
[0041](3)将步骤(2)所得的产物在50°C条件下干燥，得到酸化石墨烯；
[0042](4)将0.30g步骤(3)所得的产物，加入至40mL乙二醇中；
[0043](5)在搅拌情况下，将0.18g FeCl3.6Η20、0.15g柠檬酸三钠、2.5g醋酸钠和1.8g聚乙二醇加入至步骤(4)所得产物中；
[0044](6)将步骤(5)所得产物加入高压反应釜，在200°C条件下反应10小时；
[0045](7)将步骤(6)中高压反应釜冷却至室温，利用磁性分离技术分离和洗涤所得产物，得到磁性石墨烯；
[0046](8)将0.5mL钛酸丁酯以及0.3g SnCl4.5Η20分散至50mL乙醇中，超声0.5小时，得到均相溶液；
[0047](9)将0.015g步骤(7)所得产物磁性石墨烯分散至步骤(8)所得溶液中，超声0.5小时；
[0048](10)将50mL水和IOmL乙醇混合，搅拌均勻；
[0049](11)将步骤(9)所得的溶液在机械搅拌条件下，于0.5小时内逐滴加入至步骤(10)所得溶液中；
[0050](12)将步骤(11)所得的溶液于室温下继续搅拌8小时，使反应充分进行；
[0051](13)利用磁铁对步骤(12)所得的产物进行收集，用乙醇和水反复清洗3次以除去产物表面的杂质；
[0052](14)将步骤(13)所得的产物在50°C条件下干燥；
[0053](15)将步骤(14)所得产物于400°C条件下煅烧2小时，即得所需材料。[0054]如图1-3，所得的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的扫描电子显微镜照片(20KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图1所示，透射电子显微镜照片(200KV，日本株式会社2011显微镜，日本)如图2所示，元素分析谱图(20KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图3所示。
[0055]实施例2:
[0056]钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的用于酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集，具体步骤如下:
[0057](I)将2mg钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料分散于lmL50%乙腈溶液中，超声至分散均匀；
[0058](2)取200 μ L步骤(I)所得溶液，用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，最后分散至200 μ L该溶液中；
[0059](3)加入酪蛋白酶解液(肽段溶液)，使得肽段浓度达到目标浓度；
[0060](4)在37 °C条件下富集30分钟；
[0061 ] (5)用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，再加入5 μ L0.4Μ的氨水溶液；
[0062](6)在37 °C条件下洗脱15分钟；
[0063](7)用磁铁分离材料，得到洗脱液；
[0064](8)将洗脱液点在质谱靶板上，送入质谱仪进行质谱鉴定。
[0065]如图4可以看出:从图4a与图4b的对比中可以看出，在富集前，酪蛋白酶解液中难以鉴定到磷酸化肽段，经过钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集之后，酪蛋白酶解磷酸化肽段峰信号得到了显著增强。
[0066]实施例3:
[0067]钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的用于混合肽段中磷酸化肽段的富集，具体步骤如下:
[0068](I)将2mg钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料分散于lmL50%乙腈溶液中，超声至分散均匀；
[0069](2)取200 μ L步骤(I)所得溶液，用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，最后分散至200 μ L该溶液中；
[0070](3)加入酪蛋白与牛血清白蛋白混合酶解液(肽段溶液)，使得肽段浓度达到目标浓度；
[0071](4)在37°C条件下富集30分钟；
[0072](5)用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，再加入5 μ L0.4Μ的氨水溶液；
[0073](6)在37 °C条件下洗脱15分钟；
[0074](7)用磁铁分离材料，得到洗脱液；
[0075](8)将洗脱液点在质谱靶板上，送入质谱仪进行质谱鉴定。
[0076]如图5可以看出:从图5a与图5b的对比中可以看出，在富集前，酪蛋白与牛血清白蛋白混合酶解液中难以鉴定到磷酸化肽段，经过钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集之后，酪蛋白酶解磷酸化肽段峰信号得到了显著增强。
[0077]实施例4:
[0078]钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的用于混合肽段中磷酸化肽段的富集，具体步骤如下:
[0079](I)将2mg钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料分散于lmL50%乙腈溶液中，超声至分散均匀；
[0080](2)取200 μ L步骤(I)所得溶液，用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，最后分散至200 μ L该溶液中；
[0081 ] (3)加入酪蛋白与牛血清白蛋白混合酶解液(肽段溶液)，使得肽段浓度达到目标浓度；
[0082](4)在37 °C条件下富集30分钟；
[0083](5)用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，再加入5 μ L0.4Μ的氨水溶液；
[0084](6)在37 °C条件下洗脱15分钟；
[0085](7)用磁铁分离材料，得到洗脱液；
[0086](8)将洗脱液点在质谱靶板上，送入质谱仪进行质谱鉴定。
[0087]如图6-7，可以看出:从图6a与图6b的对比，以及图7a、7b的对比中可以看出，在富集前，酪蛋白与牛血清白蛋白混合酶解液中难以鉴定到磷酸化肽段，经过钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料富集之后，酪蛋白酶解磷酸化肽段峰信号得到了显著增强。
[0088]实施例5:
[0089]钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的用于小鼠大脑酶解液中磷酸化肽段的富集，具体步骤如下:
[0090](I)将2mg钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料分散于lmL50%乙腈溶液中，超声至分散均匀；
[0091 ] (2)用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，最后分散至ImL该溶液中；
[0092](3)加入ImL小鼠鼠脑酶解液(肽段溶液)；
[0093](4)在37 °C条件下富集60分钟；
[0094](5)用含0.1%TFA的50%乙腈溶液对材料进行清洗，再加入40 μ L0.4Μ的氨水溶液；
[0095](6)在37 °C条件下洗脱30分钟；
[0096](7)用磁铁分离材料，得到洗脱液；
[0097](8)将材料固定酶酶解混合蛋白样品的酶解液以及传统溶液过夜酶解的酶解液进行LC-MS/MS分析并搜库比较。
[0098]LC-MS/MS分析步骤如下:
[0099](I)将酶解后的肽段完全冻干。干粉使用色谱流动相A相溶解(0.5%乙酸水溶液)后，15000rpm转速以上离心5分钟，吸取上清；
[0100](2)取20 μ L进样，设置线性分离的色谱流动相B (0.5%乙酸+80%乙腈水溶液)从5%到35%，再以75nl/min的流速，以90%的B相进行洗脱。梯度的时长为140min ；
[0101](3) LC系统直接与LTQ线性离子阱质谱相连，源工作电压为2.1kV,离子传输管在200摄氏度下工作。质谱设定为数据相关模式进行分析。
[0102]由表I可以看出，通过利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料对小鼠鼠脑酶解液进行富集，鉴别得到349个磷酸化位点，其中277个为丝氨酸(占79.37%)、60个为苏氨酸(占17.19%)、12个为酪氨酸(占3.44%)，囊括了 170种不同的磷酸化肽段。
[0103]实施例6
[0104]磁性石墨烯材料的合成步骤如下:
[0105](I)将0.50g石墨烯溶解于IOOmL浓硫酸中，搅拌12个小时；
[0106](2)将步骤(1)所得的产物进行离心，用去离子水清洗直至清洗液呈中性；
[0107](3)将步骤(2)所得的产物在50°C条件下干燥，得到酸化石墨烯；
[0108](4)将0.40g步骤(3)所得的产物，加入至40mL乙二醇中；
[0109](5)在搅拌情况下，将0.20g FeCl3.6Η20、0.20g柠檬酸三钠、2.6g醋酸钠和2.1g聚乙二醇加入至步骤(4)所得产物中；
[0110](6)将步骤(5)所得产物加入高压反应釜，在200°C条件下反应10小时；
[0111](7)将步骤(6)中高压反应釜冷却至室温，利用磁性分离技术分离和洗涤所得产物，得到磁性石墨烯；
[0112](8)将0.5mL钛酸丁酯以及0.3g SnCl4.5Η20分散至50mL乙醇中，超声0.5小时，得到均相溶液；
[0113](9)将0.03g步骤(7)所得产物磁性石墨烯分散至步骤(8)所得溶液中，超声I小时；
[0114](10)将50mL水和IOmL乙醇混合，搅拌均匀；
[0115](11)将步骤(9)所得的溶液在机械搅拌条件下，于0.5小时内逐滴加入至步骤
(10)所得溶液中；
[0116](12)将步骤(11)所得的溶液于室温下继续搅拌8小时，使反应充分进行；
[0117](13)利用磁铁对步骤(12)所得的产物进行收集，用乙醇和水反复清洗3次以除去产物表面的杂质；
[0118](14)将步骤(13)所得的产物在50°C条件下干燥；
[0119](15)将步骤(14)所得产物于400°C条件下煅烧2小时，即得所需材料。
[0120]表1.利用钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的用于小鼠大脑酶解液中磷酸化肽段的富集结果
[0121]
【权利要求】
1.一种钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下: (1)将石墨烯溶解于浓硫酸中，搅拌6-12个小时，其中，石墨烯与浓硫酸的比例为0.40-0.50g:50_100mL ； (2)将步骤(I)所得的产物进行离心，用去离子水清洗直至清洗液呈中性； (3)将步骤(2)所得的产物在50°C条件下干燥，得到酸化石墨烯； (4)将步骤(3)所得的产物，加入至乙二醇中，步骤(3)所得产物与乙二醇比例为0.30-0.40g:40_50mL ； (5)在搅拌情况下，将FeCl3.6H20、柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇加入至步骤(4)所得产物中，其中FeCl3.6H20、柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇的比例为0.18-0.20mg:0.15-0.20g:2.5-2.6g: 1.8-2.0g ； (6)将步骤(5)所得产物加入高压反应釜，在200°C条件下反应9.5-10.5小时； (7)将步骤(6)中高压反应釜冷却至室温，利用磁性分离技术分离和洗涤所得产物，得到磁性石墨烯； (8)将步骤(7)所得产物修饰上钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰，即得所需女口广叩ο
2.根据权利要求1所述的一种钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰的磁性石墨烯材料的合成方法，其特征在于步骤(8)中钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球的合成步骤具体如下: (8.1)将钛酸丁酯、SnCl4.5Η20分散至乙醇中，超声0.5-1小时，得到均相溶液，其中钛酸丁酯、SnCl4.5Η20 与乙醇的配比为 0.5-lmL:0.3-0.6g:50-100mL ； (8.2)将磁性石墨烯分散至步骤(8.1)所得溶液中，超声0.5-1.0小时，两者的比例为0.015—0.03g:50-100 mL ； (8.3)将50mL水和IOmL乙醇混合，搅拌均匀； (8.4)将步骤(8.3)所得的溶液在机械搅拌条件下，于0.5小时内逐滴加入至步骤(2)所得溶液中； (8.5)将步骤(8.4)所得的溶液于室温下继续搅拌8小时，使反应充分进行； (8.6)利用磁铁对步骤(8.5)所得的产物进行收集，用乙醇和水反复清洗3次以除去产物表面的杂质； (8.7)将步骤(8.6)所得的产物在50°C条件下干燥； (8.8)将步骤(8.7)所得产物于400°C条件下煅烧2小时，即得所需材料。
3.—种如权利要求1所述合成方法得到的钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰材料作为磷酸化肽段富集的应用，其特征在于将混合肽段与钛-锡双金属原子水平杂化氧化物小球修饰修饰的磁性石墨烯材料充分混合，分散均匀，在37°C _38°C下振荡酶解25-30分钟，利用磁铁将材料与溶液分离。
【文档编号】G01N1/40GK103920476SQ201410097173
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】邓春晖, 王梦依 申请人:复旦大学