桑叶复方制剂的预处理方法及1-脱氧野尻霉素的检测方法
【专利摘要】本发明公开了桑叶复方制剂的预处理方法及1-脱氧野尻霉素的检测方法。预处理方法的步骤：将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀，再与甘氨酸混合均匀，过滤，即可；其中，所述的桑叶复方制剂的溶液中的溶剂为体积百分比80%的甲醇溶液和/或体积百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的缓冲溶液为硼酸盐缓冲液。所述的检测方法包括如上所述的桑叶复方制剂的预处理方法。该预处理方法快速方便，分离度好，能精确得到目标物，且稳定性高，灵敏度高，误差小，该检测方法检测结果精确方法，可以客观的评价复方制剂的产品质量。
【专利说明】桑叶复方制剂的预处理方法及1-脱氧野尻霉素的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及桑叶复方制剂的预处理方法及1-脱氧野尻霉素的检测方法。
【背景技术】
[0002]1_脱氧野尻霉素，中文别名:(2R, 3R, 4R, 5S) _2_轻甲基喊唳_3，4，5_ 二醇、1-去氧野究霉素、多轻基生物碱或1-脱氧氮杂-D-葡萄糖；英文名称:1-Deoxynojirimycin,简称 1-DNJ 或 DNJ ;分子式=C6H13NO4 ;分子量:163.17 ；CAS 号:19130-96-2。
[0003]1-脱氧野尻霉素为白色粉末,可以从桑科植物桑叶(Mulberry Leaf)的枝、叶和根中提取得到，是一种α -葡萄干酶抑制剂，对降低人体血糖值有显著的作用。
[0004]现有技术中，关于1-脱氧野尻霉素的研究主要集中在1-脱氧野尻霉素的化学成分上。而对于1-脱氧野尻霉素的定性或定量的检测方法的研究相对较少，因为制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理过程较为复杂，使得检测方法操作复杂并且误差较大。
[0005]杨海霞用衍生化-分光光度计来测定桑叶单方制剂中1-脱氧野尻霉素的含量(桑叶中DNJ分离纯化及含量测定的研究，中国药科，2003:1)。该方法的预处理过程造成1-脱氧野尻霉素的损失，检测结果不准确；得到的桑叶提取物及纯化物均为有色溶液，对吸光度的测定影响较大，测定结果准确度低。
[0006]现有技术中，1-脱氧野尻霉素的预处理，也仅仅局限于单方制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理的研究。对于复方制剂的研究则较少。复方制剂与单方制剂相比，成分及其含量更为复杂，各成分之间的相互作用使得复方制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理更为复杂，直接影响了对复方制剂中1-脱氧野尻霉素的检测。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中尚没有针对复方制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理方法及其检测方法的研究的缺陷，提供一种桑叶复方制剂的预处理方法及桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的检测方法，该预处理方法快速方便，分离度好，能精确得到目标物，且稳定性高，灵敏度高，误差小，该检测方法检测结果精确方法，可以客观的评价复方制剂的产品质量。
[0008]本发明的发明人，为了精密检测复方制剂中的1-脱氧野尻霉素，对于桑叶复方制剂的预处理方法进行了大量而深入的研究，在研究过程中，发明人发现:复方制剂与单方制剂相比，成分及其含量更为复杂，仅仅套用单方制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理方法，并不能准确有效地提取且检测复方制剂中的1-脱氧野尻霉素。例如，以盐酸提取1-脱氧野尻霉素，衍生化后，HPLC分析，样品分离度不好，峰形出现拖尾或肩峰，含量测定不准确，且测量结果不稳定。
[0009]在经过了长久的研究后，发明人发现:将复方制剂溶解于特定的溶剂中，以特定的衍生化试剂，在特定的缓冲液中进行衍生化反应，可生成具有紫外吸收的络合物，再进行分离处理，得到的物质能够通过高效液相色谱-紫外检测得到，且检测的准确度、精密度、重复性等效果优异。
[0010]本发明的目的之一在于，提供一种桑叶复方制剂的预处理方法，所述的预处理方法包括以下步骤:
[0011]将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀，再与甘氨酸混合均匀，过滤，即可；其中，所述的桑叶复方制剂的溶液中的溶剂为体积百分比80%的甲醇溶液和/或体积百分比80%_100%的乙醇溶液；所述的缓冲溶液为硼酸盐缓冲液。
[0012]以下，针对上述预处理方法的进一步优选的条件，做如下说明:
[0013]本领域技术人员均理解:复方制剂是指两种或两种以上的药物混合制剂。本发明的预处理方法适用于本领域常规的桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的预处理。所述的桑叶复方制剂较佳地包括40%-50%的桑叶提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%_17%的黄芪提取物和5%-9%的麦冬提取物，所述百分比为质量百分比。所述的桑叶复方制剂更佳地为希尔牌复方桑叶胶囊。
[0014]本发明中，所述的桑叶复方制剂的溶液的制备方法较佳地为:将所述的桑叶复方制剂溶解于所述的溶剂中，摇匀和/或超声处理。所述的超声处理较佳地为在功率100W和频率40kHz条件下处理20min。
[0015]所述的桑叶复方制剂的溶液中，所述的溶剂的添加量较佳地为每0.2-0.6g桑叶复方制剂添加25mL的溶剂，更佳地为每0.3g桑叶复方制剂添加25mL的溶剂。
[0016]所述的硼酸盐缓冲液较佳地为硼酸-氯化钾缓冲液。所述的硼酸-氯化钾缓冲液的浓度较佳地为0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化钾缓冲液的pH值较佳地为pH8.5 ;所述的硼酸-氯化钾缓冲液的添加量较佳地为每克桑叶复方制剂加入1.67mL的硼酸-氯化钾缓冲液。
[0017]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯计，较佳地为每1-3克待测样品中较佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，更佳地为每1.5克桑叶复方制剂中较佳地添加IOmmol的荷甲氧羰酰氯。
[0018]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的浓度为20mmol/L。
[0019]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶剂较佳地为乙腈。
[0020]所述的桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的体积比较佳地为1:1:4。
[0021]所述的将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀的方法和条件为本领域常规的试剂混合的方法和条件。所述的将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀较佳地为摇匀后进行超声处理。所述的超声处理较佳地为在功率100W和频率40kHz条件下处理20min。
[0022]所述的甘氨酸的添加量较佳地为每克桑叶复方制剂添加0.05-0.1mol的甘氨酸，更佳地为每克桑叶复方制剂添加0.08mol的甘氨酸。
[0023]所述的过滤较佳地为过0.45 μ m的有机系微孔滤膜。
[0024]本发明的目的之二在于，提供一种桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤:(I)将桑叶复方制剂进行如上所述的桑叶复方制剂的预处理方法处理，得待测样品溶液；(2)将所述的待测样品溶液进行检测，即可。[0025]步骤(2)中，所述的检测较佳地为高效液相色谱-紫外检测。
[0026]所述的高效液相色谱的检测的色谱柱较佳地为C18色谱柱，更佳地为Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的 Agilent20RBAX SB-C18 的规格较佳地为 4.6*150mm*5 μ m或 4.6*250mm*5 μ m。
[0027]所述的高效液相色谱的检测的流动相较佳地包括:流动相A:乙腈；流动相B:
0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流动相A和流动相B的体积比较佳地为(28-32 ):(72-68)，更佳地为32:68 ;所述百分比为质量百分比。所述的醋酸的水溶液的浓度较佳地为0.2%，所述百分比为质量百分比。
[0028]所述的高效液相色谱的检测的柱温较佳地为30°C。
[0029]所述的高效液相色谱的检测的流速较佳地为1.0mL/min。
[0030]所述的高效液相色谱的检测的波长较佳地为265nm。
[0031]所述的高效液相色谱-紫外检测的进样量较佳地为10-20 μ L0
[0032]所述的检测后较佳地按照本领域常规的标准曲线法计算得到桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的含量。所述的标准曲线法的操作步骤较佳地为:用标准样品配制成标准样品，在与待测样品相同的色谱条件下，等体积进样；测量各标准样品溶液的各峰的峰面积，用峰面对样品浓度绘制标准曲线。再根据测得的待测样品的峰面积，计算待测样品的浓度。
[0033]其中，所述的标准样品的预处理方法与上述步骤(I)中的桑叶复方制剂的预处理方法相同。
[0034]在进行定量检测时，待测样品溶液按照本领域常规，先定容后再过滤。所述的定容较佳地为用醋酸定容。所述的醋酸的浓度较佳地为0.1%-0.2%，更佳地为0.1%，所述百分比为质量百分比。
[0035]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0036]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0037]本发明的积极进步效果在于:本发明的预处理方法快速方便，分离度好，能精确得到目标物，且稳定性高，灵敏度高，误差小，该检测方法检测结果精确方法，可以客观的评价复方制剂的产品质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为实施例1制得的标准曲线。
[0039]图2为专属性实验结果图；其中，A:阴性样品(去除了桑叶成分的希尔牌复方桑叶胶囊)溶液的色谱图；Β:待测样品(希尔牌复方桑叶胶囊)溶液的色谱图；C:1-脱氧野尻霉素标准样品溶液的色谱图。
【具体实施方式】
[0040]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0041]以下实施例中，使用的仪器、材料和试剂如下所示:
[0042]液相色谱仪:美国安捷伦公司生产，型号:1260，该液相色谱仪包括二元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站；
[0043]KQ-250DB数控超声波清洗仪:昆山市超声仪器有限公司；
[0044]pH调节计:上海仪电科学仪器有限公司，型号:PHS_3C ；
[0045]天平:METTLER200型电子天平、BP21ID电子分析天平(SartoriusC0.)。
[0046]标准样品:1-脱氧野尻霉素，上海融禾医药科技有限公司；
[0047]待测样品:希尔牌复方桑叶胶囊，湖南希尔天然药业。
[0048]除乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。
[0049]实施例1
[0050]桑叶复方制剂的预处理方法，包括以下步骤:
[0051]取希尔牌复方桑叶胶囊0.2907g置于25mL的量瓶中，加入体积百分比100%乙醇2mL，超声处理lOmin，乙醇定容至刻度，即为储备液；取ImL储备液置于25mL的量瓶中，力口Λ 0.2mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH8.5) ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,摇勻,超声处理(功率IOOw,频率40kHz) 20min,再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL,摇匀；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，摇匀，过0.45 μ m滤膜，即可。
[0052]实施例2
[0053]桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的检测方法
[0054]( I)标准曲线的制备
[0055]取1-脱氧野尻霉素标准品置于25mL的量瓶中，加80 %的甲醇溶液溶解，配成
0.2mg/mL的1-脱氧野尻霉素的溶液,为储备液；
[0056]将ImL储备液置于25mL的量瓶中，加入0.2mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH8.5)ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,摇勻，超声处理(功率IOOw,频率40kHz) 20min，再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL，摇匀；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，摇匀，即得标准样品溶液；
[0057]将标准样品溶液按照体积4μ L、8y L、10y L、12y L、14y L、18y L、20y L分别进样，进行高效液相色谱-紫外检测；
[0058]所述的高效液相色谱-紫外检测的检测条件为:
[0059]色谱柱:20RBAXSB-C18 (Agilent)(规格 4.6*150mm*5 μ m)
[0060]流动相:流动相A:乙腈；流动相B:质量百分比0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；流动相A和流动相B的体积比为32:68 ；
[0061]柱温:30°C;
[0062]流速:1.0mL/min ；
[0063]波长:265nm；
[0064]峰面积的测定结果如表I所示；
[0065]表1:1_脱氧野尻霉素标准曲线数据
[0066]
【权利要求】
1.桑叶复方制剂的预处理方法，其特征在于:所述的预处理方法包括以下步骤: 将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀，再与甘氨酸混合均匀，过滤，即可；其中，所述的桑叶复方制剂的溶液中的溶剂为体积百分比80%的甲醇溶液和/或体积百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的缓冲溶液为硼酸盐缓冲液。
2.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于:所述的硼酸盐缓冲液为硼酸-氯化钾缓冲液；所述的硼酸-氯化钾缓冲液的浓度较佳地为0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化钾缓冲液的PH值较佳地为pH8.5 ;所述的硼酸-氯化钾缓冲液的添加量较佳地为每克桑叶复方制剂加入1.67mL的硼酸-氯化钾缓冲液； 所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶剂为乙腈。
3.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于:所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯计为每1-3克待测样品中添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，较佳地为每1.5克桑叶复方制剂中较佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯；所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的浓度较佳地为20mmol/L。
4.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于:所述的桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的体积比为1:1:4。
5.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于:所述的桑叶复方制剂包括40%-50%的桑叶提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%-17%的黄芪提取物和5%_9%的麦冬提取物，所述百分比为质量百分比；所述的桑叶复方制剂较佳地为希尔牌复方桑叶胶囊； 所述的桑叶复方制剂的溶液的制备方法较佳地为:将所述的桑叶复方制剂溶解于所述的溶剂中，摇匀和/或超声处`理；所述的超声处理较佳地为在功率IOOW和频率40kHz条件下处理20min ； 所述的桑叶复方制剂的溶液中，所述的溶剂的添加量较佳地为每0.2-0.6g桑叶复方制剂添加25mL的溶剂，更佳地为每0.3g桑叶复方制剂添加25mL的溶剂； 所述的将桑叶复方制剂的溶液、缓冲溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均匀的方法为摇匀后进行超声处理；所述的超声处理较佳地为在功率IOOW和频率40kHz条件下处理20mino
6.如权利要求1-5中任一项所述的预处理方法，其特征在于:所述的甘氨酸的添加量为每克桑叶复方制剂添加0.05-0.1mol的甘氨酸，较佳地为每克桑叶复方制剂添加0.08mol的甘氨酸； 所述的过滤较佳地为过0.45 μ m的有机系微孔滤膜。
7.一种桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的检测方法，其特征在于:所述的检测方法包括以下步骤:(1)将桑叶复方制剂进行如权利要求1-6中任一项所述的桑叶复方制剂的预处理方法处理，得待测样品溶液；(2)将所述的待测样品溶液进行检测，即可。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的检测为高效液相色谱_紫外检测。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于:所述的高效液相色谱的检测的色谱柱为C18色谱柱，较佳地为Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的Agilent20RBAX SB-C18的规格较佳地为 4.6*150mm*5 μ m 或 4.6*250mm*5 μ m ； 所述的高效液相色谱的检测的流动相包括:流动相A:乙腈；流动相B:0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流动相A和流动相B的体积比较佳地为(28-32): (72-68)，更佳地为32:68 ;所述百分比为质量百分比；所述的醋酸的水溶液的浓度较佳地为0.2%，所述百分比为质量百分比； 所述的高效液相色谱的检测的柱温为30°C ;所述的高效液相色谱的检测的流速为.1.0mL/min ;所述的高效液相色谱的检测的波长为265nm ;所述的高效液相色谱-紫外检测的进样量为10-20 μ L。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于:所述的检测后按标准曲线法计算得到桑叶复方制剂中1-脱氧野尻霉素的含量；所述的标准曲线法中标准样品的预处理方法与所述的步骤(1)中的桑叶复方制剂的预处理方法相同。
【文档编号】G01N30/02GK103869026SQ201410108293
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】刘湘荣, 易跃能, 邓义德, 朱亚文, 蒋灵娇 申请人:湖南希尔天然药业有限公司