单细胞粘附和分布的光电成像装置制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种单细胞粘附和分布的光电成像装置，包括电化学工作站、参比电极、对电极、细胞培养腔、绝缘层、半导体基底、工作电极、PCB底座、XY双轴精密电动载物台、载物台编程控制器、激光二极管和激光驱动器；电化学工作站与参比电极、对电极、工作电极相连；参比电极和对电极置于细胞培养腔内；细胞培养腔固定在绝缘层上；绝缘层置于半导体基底上；半导体基底固定在PCB底座上；PCB底座与XY双轴精密电动载物台固定；载物台编程控制器与XY双轴精密电动载物台连接；激光二极管位于XY双轴精密电动载物台下方，与激光驱动器相连。本发明得到以阻抗值作像素点内容的图像，利用该图像可以对单细胞的粘附和分布进行定性定量分析。
【专利说明】单细胞粘附和分布的光电成像装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程【技术领域】，具体涉及一种单细胞粘附和分布的光电成像装置。
【背景技术】
[0002]共同培养的一群细胞中的单个细胞即使处于相同的环境条件下常常也会表现出多样化的行为。涉及针对细胞-基底间和细胞-细胞间相互作用的单细胞分析能够避免群细胞分析的平均效应所导致的多样化行为信息的丢失。因此，可用的合适的单细胞操作和分析手段对细胞生物学家来说具有极大的吸引力和重要的意义。微流控技术和显微镜技术是当前最为流行的活细胞分析方法。微流控技术的工作流程是首先借助微结构捕获单个细胞到特定的位置，然后采用各种技术分析单细胞的DNA、mRNA、蛋白质等胞内胞外分子或者对细胞行为进行长时成像。显微镜技术当前主要包括荧光成像、扫描共聚焦成像、全内反射成像和拉曼散射成像等。当前显微镜的最高分辨率已经做到0.5nm单分子的水平。显微镜技术也已经被广泛地用于追踪细胞内物质的传输，如蛋白质表达和囊泡释放过程。
[0003]虽然微流控技术越来越受欢迎，显微镜技术是最直观的细胞观察手段，但是它们两者在分析单细胞时仍然存在一些不足和缺陷。如处在微流控结构中的单个细胞之间相互分隔，细胞与细胞之间缺少接触，导致单细胞有可能错误的表达自身的行为。而显微镜技术还不大可能同时定量地观察多种细胞行为。并且，微流控和显微镜技术中常用的荧光染剂、酶、氧化还原剂和放射性标记物等对细胞有潜在的毒性作用。因此，寻找一种能够克服上述问题的新技术方法显得十分有必要。
[0004]阻抗谱技术是分析电化学系统的复杂阻抗的实用方法。电化学阻抗谱技术的基本工作原理是在一电极上施加交流电压V，在另一电极上检测电流响应I。换算得到的阻抗Z(由Z = V / I测定)对电极表面事件，如分子结合和细胞增殖等敏感。由于具有无标记检测的特性和在仪器化方面取得的进展，阻抗谱技术已经越来越多地应用在生物分析中，从DNA和蛋白质检测到细胞分析。一个突出的例子是细胞-基底阻抗传感(ECIS)，它已被成功地用于分析许多细胞行为，包括细胞粘附和伸展、细胞迁移、细胞毒性和药理学反应等。
[0005]但是，与显微镜技术相比，阻抗谱技术由于缺乏空间分辨率而不够直观。而空间分辨率对单细胞分析来说又尤为重要。虽然基于阻抗谱技术可以通过构建一个微电极阵列，利用每个电极获取局部的阻抗信号来得到空间分布信息，但是为了实现高分辨率就需要很多微小电极，就需要相同数量的电极引线，这不仅加重了检测系统负担，而且不利于小型化。此外，为了确保得到满意的可重复性和可靠性，就需要对电极表面进行额外的修饰改性以将细胞引导到有效的检测区域。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种单细胞粘附和分布的光电成像装置，该成像装置无需借助精密光路器件，成本低、易于小型化，得到的成像结果是以阻抗值作为像素点内容的高分辨率数值图像，利用该图像可以对单细胞的粘附和分布进行定性和定量分析，从而得到单细胞的粘附和分布行为。
[0007]—种单细胞粘附和分布的光电成像装置，包括电化学工作站、参比电极、对电极、细胞培养腔、绝缘层、半导体基底、工作电极、PCB底座、XY双轴精密电动载物台、载物台编程控制器、激光二极管和激光驱动器；其中，电化学工作站与参比电极、对电极、工作电极相连；参比电极和对电极均置于细胞培养腔内；细胞培养腔固定在绝缘层上；绝缘层置于半导体基底的上表面；半导体基底固定在PCB底座上；PCB底座与XY双轴精密电动载物台固定；载物台编程控制器与XY双轴精密电动载物台连接，载物台编程控制器用于控制XY双轴精密电动载物台的步进移动；激光二极管位于XY双轴精密电动载物台下方，与激光驱动器相连；所述PCB底座中部有第一透光孔，正对半导体基底下表面；所述XY双轴精密电动载物台中部有第二透光孔，与PCB底座中部的第一透光孔相对应，正对半导体基底下表面。
[0008]在绝缘层上表面与半导体基底下表面之间施加一个稳定的偏置电压时，半导体基底内的电子和空穴发生分离，在半导体基底和绝缘层交界处将产生一定厚度的耗尽层。当细胞在绝缘层上表面粘附后，由于细胞膜的绝缘性，会使得参比电极上施加的电压在经过细胞粘附位置时发生压降，致使细胞粘附位置的绝缘层上表面的电势发生变化，进而改变该位置耗尽层的厚度。反之当细胞从表面脱附或迁移到其它位置时，原粘附位置的耗尽层的厚度将发生相反变化。由于绝缘层上表面不同位置细胞粘附的紧密程度不同或者没有粘附，会使耗尽层的厚度在不同位置呈现不均匀的分布。当耗尽层受到一定波长的光照射时，半导体会吸收光子，发生禁带到导带的跃迁，耗尽层内将产生新的电子空穴对，这些电子和空穴又在耗尽层电场的作用下分离，致使耗尽层的厚度减小。当激光照射在半导体基底的不同位置时，导致的耗尽层厚度的总体变化也将不同。由于耗尽层的厚度决定了对电极与工作电极之间的回路阻抗，因此通过测量该回路阻抗就能直接反映耗尽层厚度的上述总体变化。最后，通过测量所有激光照射位置的阻抗值，就能得到反映单个细胞的粘附和分布的二维空间图像。
[0009]作为上述发明的进一步改进，所述参比电极的材料为Ag/AgCl，对电极的材料为钼金。
[0010]作为上述发明的进一步改进，所述细胞培养腔采用聚苯乙烯或有机玻璃制作。
[0011]作为上述发明的进一步改进，所述绝缘层的材料为单层Si02、Si3N4或者双层SiO2/Si3N4复合物，厚度为10?lOOnm。
[0012]作为上述发明的进一步改进，所述半导体基底为掺杂半导体，厚度为100?500 μ m0
[0013]作为上述发明的进一步改进，所述XY双轴精密电动载物台的位移精度为lOOnm。
[0014]作为上述发明的进一步改进，所述激光二极管发射的激光波长为900?lOOOnm。
[0015]作为上述发明的进一步改进，所述激光驱动器驱动电流调节范围为OmA?200mA。
[0016]上述单细胞粘附和分布的光电成像装置的使用方法，包括如下步骤:
步骤I，在绝缘层上表面植入待测细胞；
步骤2，激光驱动器驱动激光二极管发射激光穿过PCB底座和XY双轴精密电动载物台中部的透光孔照射到半导体基底的下表面；
步骤3，通过载物台编程控制器控制XY双轴精密电动载物台的步进移动从而改变细胞培养腔与激光二极管的相对位置，根据电化学工作站检测该激光照射位置的电流值和对电极上施加的交流电压值，计算得到移动路径上所有位置的阻抗值；
步骤4，根据步骤3所得阻抗值绘制单个细胞粘附和分布的图像。
[0017]本发明得到的成像结果是以阻抗值作为像素点内容的高分辨率数值图像，利用该图像可以对单细胞的粘附和分布进行定性和定量分析，从而得到单细胞的粘附和分布行为。本发明无需借助精密光路器件，成本低、易于小型化，可以用于体外培养后具有粘附性活细胞的粘附和分布行为，如肾细胞、上皮细胞、癌细胞等，拥有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明的结构图，其中，I为电化学工作站，2为参比电极，3为对电极，4为细胞培养腔，5为绝缘层，6为半导体基底，7为工作电极，8为PCB底座，9为XY双轴精密电动载物台，10为载物台编程控制器，11为激光二极管，12为激光驱动器，101为第一透光孔，102为第二透光孔；
图2为实施例1的成像方法图；
图3为实施例1的成像结果图，其中，黑色表示细胞粘附的区域，白色表示绝缘层5的上表面。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
如图1所示，一种单细胞粘附和分布的光电成像装置，包括电化学工作站1、参比电极
2、对电极3、细胞培养腔4、绝缘层5、半导体基底6、工作电极7、PCB底座8、XY双轴精密电动载物台9、载物台编程控制器10、激光二极管11和激光驱动器12 ;其中，所述电化学工作站I工作在三电极模式，一方面给参比电极2施加直流电压，与工作电极7之间形成恒定电势差，另一方面给对电极3施加交流电压信号，与工作电极7之间形成电流检测回路；参比电极2和对电极3均置于细胞培养腔4内；细胞培养腔4由环氧树脂胶结剂固定在绝缘层5的上表面，用于承载电解液；绝缘层5通过热氧化生长沉积在半导体基底的上表面，使用时将细胞培养在绝缘层5的上表面；半导体基底6通过导电胶粘结于PCB底座8之上；工作电极7是位于PCB底座8上的焊盘，用于将半导体基底6中产生的电流信号通过导线引出到电化学工作站I进行测量；PCB底座8放置于XY双轴精密电动载物台9之上，通过其上的电路走线使工作电极7和半导体基底6之间形成导电连接；XY双轴精密电动载物台9 一方面通过其上的夹具固定PCB底座8的位置，另一方面带动固定在其上的物体沿X轴或Y轴移动；载物台编程控制器10用于控制XY双轴精密电动载物台9沿着程序设定好的路径移动；激光驱动器12用于驱动和调节激光二极管11以一定光强发光；激光二极管11位于XY双轴精密电动载物台9下方，用于发射激光照射半导体基底6。PCB底座8中部有一透光孔101，正对半导体基底6下表面；XY双轴精密电动载物台9中部有一透光孔102，与PCB底座8中部的透光孔101相对应，正对半导体基底6下表面。
[0020]其中，参比电极2的材料为Ag/AgCl，对电极3的材料为钼金；细胞培养腔4采用有机玻璃制作；绝缘层5的材料为单层SiO2,厚度为IOOnm ;半导体基底6为硼掺杂半导体，厚度为450 μ m ;XY双轴精密电动载物台9其位移精度为IOOnm ;激光二极管11发射的激光波长为950nm ;激光驱动器12驱动电流为27mA。
[0021]上述单细胞粘附和分布的光电成像装置的使用方法，包括如下步骤:
步骤1，在绝缘层5上表面植入乳鼠肾细胞，然后加入细胞培养液培养2天后进行成
像；
步骤2，打开激光驱动器12驱动激光二极管11发射激光穿过PCB底座8和XY双轴精密电动载物台9中部的透光孔照射到半导体基底6的下表面；
步骤3，通过载物台编程控制器10控制XY双轴精密电动载物台9的步进移动从而改变细胞培养腔4与激光二极管11的相对位置，其中XY双轴精密电动载物台9的步进距离设置为5 μ m、步进间隔时间为200ms、步进点数为1500 ;根据电化学工作站I检测该激光照射位置的电流值和对电极3上施加的交流电压值，计算得到移动路径上所有位置的阻抗值；步骤4，根据步骤3所得阻抗值将所有像素点中阻抗值最小的点以及比最小的点大1%以内的点置成白色，超过1%的点置成黑色，其中，黑色表示细胞粘附的区域，白色表示绝缘层的上表面，从而绘制得到单个细胞粘附和分布的图像。
【权利要求】
1.一种单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:包括电化学工作站(I)、参比电极(2)、对电极(3)、细胞培养腔(4)、绝缘层(5)、半导体基底(6)、工作电极(7)、PCB底座(8)、XY双轴精密电动载物台(9)、载物台编程控制器(10)、激光二极管(11)和激光驱动器(12);其中，电化学工作站(I)与参比电极(2)、对电极(3)、工作电极(7)相连；参比电极(2)和对电极(3)均置于细胞培养腔(4)内；细胞培养腔(4)固定在绝缘层(5)上；绝缘层(5)置于半导体基底(6)的上表面；半导体基底(6)固定在PCB底座(8)上；PCB底座(8)与XY双轴精密电动载物台(9)固定；载物台编程控制器(10)与XY双轴精密电动载物台(9)连接，载物台编程控制器(10)用于控制XY双轴精密电动载物台(9)的步进移动；激光二极管(11)位于XY双轴精密电动载物台(9 )下方，与激光驱动器(12 )相连；所述PCB底座(8 )中部有第一透光孔(101)，正对半导体基底(6 )下表面；所述XY双轴精密电动载物台(9 )中部有第二透光孔(102)，与PCB底座(8)中部的第一透光孔(101)相对应，正对半导体基底(6)下表面。
2.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述参比电极(2)的材料为Ag/AgCl，对电极(3)的材料为钼金。
3.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述细胞培养腔(4)采用聚苯乙烯或有机玻璃制作。
4.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述绝缘层(5)的材料为单层Si02、Si3N4或者双层Si02/Si3N4复合物，厚度为10?lOOnm。
5.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述半导体基底(6)为掺杂半导体，厚度为100?500 μ m。
6.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述XY双轴精密电动载物台(9)的位移精度为lOOnm。
7.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述激光二极管(11)发射的激光波长为900?lOOOnm。
8.根据权利要求1所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置，其特征在于:所述激光驱动器(12)驱动电流调节范围为OmA?200mA。
9.权利要求1至8任一项所述的单细胞粘附和分布的光电成像装置的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I，在绝缘层(5)上表面植入待测细胞； 步骤2，激光驱动器(12)驱动激光二极管(11)发射激光穿过PCB底座(8)和XY双轴精密电动载物台(9)中部的透光孔照射到半导体基底(6)的下表面； 步骤3，通过载物台编程控制器(10)控制XY双轴精密电动载物台(9)的步进移动从而改变细胞培养腔(4)与激光二极管(11)的相对位置，根据电化学工作站(I)检测该激光照射位置的电流值和对电极(3)上施加的交流电压值，计算得到移动路径上所有位置的阻抗值； 步骤4，根据步骤3所得阻抗值绘制单个细胞粘附和分布的图像。
【文档编号】G01N15/10GK103940725SQ201410108134
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】吴成熊, 王守岩 申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所