一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法及系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于激光外差干涉术的共聚焦显微成像系统，在现有激光共聚焦显微镜的显微镜光学系统、扫描部分的基础上，加入频移部分，结合光外差干涉技术实现精确测量。在充分利用了共聚焦扫描显微镜的超高横向分辨率的同时，又通过获取精确的相位信息取代强度信息，不仅提高了轴向分辨率，还避免了使用荧光染料带来的一系列问题；可以在无标记的情况下测量透明的相位物体。
【专利说明】-种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法及系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种共聚焦扫描显微成像方法，属于光学精密测量领域，特别涉及一 种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，本发明还涉及利用上述方法的系统。
【背景技术】
[0002] 激光扫描共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是对普 通光学显微镜的重大改进，主要由W下四个部分组成；显微镜光学系统；扫描装置，LSCM使 用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描；激光光源；检测系统。其基本思想由M.Minsky于 1957年提出，与一般的显微成像不同，它在光路中加入了与物点共辆的探测针孔，起到了空 间滤波作用，在使用英光染料的情况下，能够去除离焦英光的干扰，产生轴向层析能力，通 过逐点逐层的扫描方式，实现对观测样品区域的光学层切，实现H维成像。它是一种无损伤 的光学远场成像技术，能够同时提供较高的横向和轴向分辨率，该使得它有着极高的应用 价值。
[0003] 共聚焦扫描显微镜与传统照明显微镜相比有许多优点，包括：可W控制焦深、照明 强度、降低非焦平面光线噪声干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，既显微CT。最近共聚 焦显微镜在科研领域尤其是生物医学方面迅速发展，主要原因是其可W在不改变普通英光 显微镜的制片方法的前提下，可W观察到非常清晰的高质量图像，并且通过共聚焦显微镜 可W十分方便的观察活的细胞或组织。由于共聚焦显微镜的突出优势，它已经成为生物医 学研究中最重要的形态学研究工具之一。
[0004] 目前世界各大光学显微镜公司都在研发和生产共聚焦显微镜，主要体现在市面上 常见的德国悚卡、蔡司、和日本尼康、奧林己斯该几个品牌的产品中。
[0005] 由于共聚焦显微镜在观测时必要使用的英光染料分子所带来的一系列问题，在激 光的照射下，使用的许多英光染料会产生单态氧或自由基等细胞毒素，必须限制扫描时间、 激发光强度，W保持样品的活性，使得强度的对比度不高。同时，为了获得足够的信噪比必 须提高激光的强度；而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速權色，即光漂白效应。
[0006] 另外，激光共聚焦英光扫描显微技术得到图像的对比度来自于激光激发样本产生 的英光强度，因此，如果不使用英光染料，不能单独实现对透明样品进行非英光标记的结构 成像。对于该些透明样品，也就是相位样品，采用相位测量的方法可W得到高精度的结果， 同时，不需要英光染料标记，避免了染料带来的毒性及其他问题，并且相位信息的对比度比 强度的对比度更高。现有技术中，可W与激光共聚焦英光扫描显微技术结合的显微相位成 像方法主要有W下几种：
[0007] (1)激光斜射照明显微成像方法。在共聚焦显微系统的基础上，利用入射激光光轴 和探测光轴所成的角度获得斜入射的照明光，从而获得浮雕效果。
[0008] (2)微分干涉相差显微成像方法。利用两块沃拉斯顿棱镜（Wollaston Prism)，起 偏器（Polarzer)和检偏器（Analyzer)完成成像，成像结果可W呈现样品的浮雕状结构。
[0009] 上述的两种相位方法避免了使用英光染料，但是，激光斜射照明显微成像方法由 于需要调节探测光路和入射光路的角度，难W实现在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上 实现位相测量，会导致需要大幅度修改原有显微镜结构才可W使用该种技术。微分干涉相 差显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪 切角进行位相差分探测，其所采用沃拉斯顿棱镜价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品 进行探测，限制了使用范围。同时，该两种方法均不能获得精确到千分之一弧度的定量相位 信息。
[0010] 另外，上述各处理方法中共聚焦显微镜的聚焦点均存在微米量级的光腰，在该个 范围内，共聚焦显微镜是无法分辨的。
[0011] 激光外差干涉法是一种成熟的被广泛用于高精度测量领域的方法。在光外差探测 中，带有被探测目标信息的信号光波与一个本振光波进行混频，经过混频后的光信号被光 电探测所响应，并转化为电信号输出。混频信号一般包括本振光的频率分量、原始信号光的 频率分量W及信号光和本振光的和频分量及差频分量，前H个信号由于频率太高不能被探 测得到，所W经过光电探测器转换输出的只是信号光和本振光频率的差频分量。光外差法 的精度可W达到千分之一个探测波长。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，在共 聚焦扫描显微镜的基础上，结合光外差干涉术，能够获得无英光标记样品的高对比度的相 位信息图像。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供一种利用上述方法的共聚焦扫描显微成像系统，能 够获得无英光标记样品的高对比度的相位信息图像。
[0014] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案；一种基于光外差干涉术的共聚焦 扫描显微成像方法，包括：
[0015] (1)将激光光源发出的单波长激光分成两束光，其中一束进入一个具有固定频率 的声光频移器调制，其输出的一级光作为信号光；另一束进入一个具有可调频率的声光频 移器调制，其输出的一级光作为本振光；所述可调频率为所述固定频率前后0. 1-2MHZ范 围；
[0016] (2)将所述信号光再次分成第一、第二信号光束，所述本振光再次分成第一、第二 本振光束，其中将第二信号光束和第二本振光束进行合束并输入到第二光电探测器上，经 光电探测器对合束光采集后输出参考中频信号；
[0017] (3)将第一信号光束进入共聚焦扫描系统，第一信号光束照射到样品部分后，按原 路返回并与第一本振光束进行合束并输入到第一光电探测器上，经光电探测器对合束光采 集后输出待测中频信号；
[0018] (4)将采集到的参考中频信号和待测中频信号进行处理，得出聚焦点的相位信息； 共聚焦扫描系统中的扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并 合成样品的H维信息图像。
[0019] 对本发明方法的进一步改进，当在步骤（4)得到的某一聚焦点的相位信息时，聚 焦点在物体平面内不动，扫描部分做轴向的微位移，得到聚焦点的相位发生连续变化，即相 位随着时间变化，由于相位是包裹在（-K,n]中的，利用当前所得到的相位信息与前一时 刻得到的相位信息比较，若时间前后的相位信息之差的符号发生变化时，就计数器加一； 如此一来，当相位递增到波长/2的整数倍时，就实现整数计数，实现了聚焦点光腰内的相 对测量。
[0020] 本发明方法采用偏振分束器来进行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半 波片调制偏振方向。
[0021] 本发明方法步骤3中第一信号光束与共聚焦扫描系统之间经半波片、偏振分束器 和四分之一波片调制禪合，半波片、偏振分束器使第一信号光束全部进入共聚焦扫描系统 中，同时四分之一波片和偏振分束器使照射到样品部分后，按原路返回的第一信号光束由 偏振分束器全反射输出。
[0022] 本发明方法步骤2、3中的合束光输入到光电探测器前，先进入检偏器，使得信号 光和本振光的偏振方向保持一致，从而提高了拍频效率。
[0023] 为了可W避免空气的干扰，本发明采用光纤进行光束传输，该样参考光路中的信 号光和本振光收到的干扰就变成一样，那么采集到参考中频信号基本是理想的参考中频信 号，该样最终和待测中频信号进行对比时才能够得到最精确的相位信息。
[0024] 本发明的另一个目的，可通过W下技术方案实现：一种基于激光外差干涉术的共 聚焦显微成像系统，包括激光光源部分，频移部分，共聚焦扫描部分，光信号采集部分及信 号分析部分；
[0025] 激光光源包含输出一个单波长激光的激光器和将该激光分成两束激光的光源分 束器；
[0026] 频移部分包含本振光传输光路和信号光传输光路；所述本振光传输光路设有可调 频率的第一声光频移器、本振光分束器；
[0027] 信号光传输光路设有固定频率的第二声光频移器、信号光分束器、信号光合束 器；
[0028] 光信号采集部分包含用于采集待测光的第一光电探测器、用于采集参考光的第二 光电探测器；
[0029] 信号分析部分包含用于处理两个通道信号的计算机；
[0030] 光源分束器分出的其中一束进入信号光传输通道的第一声光频移器调制，其输出 的一级光作为信号光；另一束进入本振光传输通道的第二声光频移器调制，其输出的一级 光作为本振光；
[0031] 所述信号光经信号光分束器分成第一、第二信号光束，所述本振光经本振光分束 器分成第一、第二本振光束，其中第二信号光束传输到本振光分束器与第二本振光束进行 合束为参考光，并输入到第二光电探测器上，经第二光电探测器对参考光采集后输出参考 中频信号；
[0032] 第一信号光束进入共聚焦扫描部分，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返 回并输入到信号光合束器，第一本振光束也输入到信号光合束器进行合束为待测光，并输 入到第一光电探测器上，经第一光电探测器对待测光采集后输出待测中频信号；
[0033] 采集到的参考中频信号和待测中频信号输入到信号分析部分进行处理，得出聚焦 点的相位信息；共聚焦扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并 合成待测样品的H维信息图像。
[0034] 本发明系统在获得聚焦点相位信息时，扫描部分做轴向的微位移，得到聚焦点的 相位发生连续变化的信息。
[0035] 本发明系统所述分束器、合束器均采用偏振分束器，在各偏振分束器的输入端的 光路中均设有用于调制偏振方向的半波片。
[0036] 本发明系统第一信号光束进入共聚焦扫描部分输入端的光路中依次设有半波片、 偏振分束器和四分之一波片，使第一信号光束能全部进入共聚焦扫描部分；同时使共聚焦 扫描部分中返回输出的第一信号光束经偏振分束器全反射到光信号合束器上。
[0037] 本发明系统光电探测器的输入端光路中设有检偏器，使得信号光和本振光的偏振 方向保持一致，从而提高了拍频效率。
[0038] 本发明在现有激光共聚焦显微镜的显微镜光学系统、扫描部分的基础上，加入频 移部分，结合光外差干涉技术实现精确测量。在充分利用了共聚焦扫描显微镜的超高横向 分辨率的同时，又通过获取精确的相位信息取代强度信息，不仅提高了轴向分辨率，还避免 了使用英光染料带来的一系列问题。可W在无标记的情况下测量透明的相位物体。
[0039] 本发明采用的光外差干涉技术，获得的相位信息具有比英光光强信息更高的信噪 比和灵敏度。使得在不增大激光光强的同时，可W获得极弱反馈背景下目标的信息，增大了 激光共聚焦显微镜的可探测深度。
[0040] 本发明采用光外差干涉，随着共聚焦显微镜中的扫描装置做连续轴向微位移，得 到的相位发生连续变化，使用简单的相位计数方法，就可W获得了焦点光腰的内分辨，分辨 尺度可W达到纳米量级。克服了目前共聚焦显微镜在聚焦点存在微米量级的无法内分辨光 腰的问题。内分辨精度可W达到纳米量级，实现了光腰内的高分辨测量。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为本发明系统的原理框图。
【具体实施方式】
[0042] 如图1，本发明具体实施例包括激光光源部分，频移部分，共聚焦扫描部分，光信号 采集部分及信号分析部分；
[0043] 激光光源包含输出一个单波长激光的激光器1、半波片2a、将该激光分成两束激 光的偏振分束器3a;
[0044] 频移部分包含本振光传输光路和信号光传输光路，本振光传输光路设置可调频率 的第一声光频移器4b、用于调整本振光传输方向的发射镜10、半波片2d、本振光偏振分束 器3d、半波片2g;信号光传输光路设置固定频率的第二声光频移器4a、半波片化、用于信号 光分束的偏振分束器3b、半波片2e、半波片2c、偏振分束器3c、四分之一波片6、半波片2f、 用于信号光合束的偏振分束器3e;
[0045] 光信号采集部分包含用于采集待测光的第一光电探测器1la、用于采集参考光的 第二光电探测器12a;
[0046] 信号分析部分包含用于处理两个通道信号的计算机13 ;
[0047] 如图1所示，激光器1发出的激光经过半波片2a调整偏振角度后被偏振分束器3a 分成两束激光光源。
[0048] 较弱的一束激光光源进入声光频移器4b后输出一级光为本振光，其频移值可调， 例如可调范围为f±Af。经过声光频移器4b出射的一级光经过反射镜10的反射改变传输 方向后，被半波片2d调制了偏振方向，经过偏振分束器3d后分成第一、第二两束本振光，被 偏振分束器3d反射部分为第二本振光，信号光传输光路中被偏振分束器3b反射的第二信 号光又经过半波片2e调制传输到偏振分束器3d，与偏振分束器3d反射部分的第二本振光 合束为参考光，同时进入检偏器Ila后在光电探测器12a光敏面上拍频作为参考中频信号。
[0049] 其中较强的一束激光光源进入声光频移器4a，声光频移器4a输出一级光为信号 光，其频移值为固定值，例如f。声光频移器4a输出的一级光再次经过半波片化调整偏振 角度后被偏振分束器3b分成第一、第二两束信号光，较强一部分的第一信号光被偏振分束 器3b透射输出用于去照射待测样品；调节半波片2c，使得第一信号光束完全通过偏振分束 器3c进入共聚焦显微系统。进入扫描系统的第一信号光首先经过四分之一波片6的调制 后，入射到共聚焦显微系统的小孔7,后经过透镜5a变成平行光入射至现有共聚焦显微系 统的扫描振镜8,后经过透镜化聚焦到样品部分9,在焦点处被样品反射后可W原路返回， 再次经过小孔7,后被四分之一波片6调制；由于从偏振分束器3c出射的光经过两次四分 之一波片，使得光的偏振方向发生90度的偏转，那么再次经过偏振分束器3c的时候就可W 被完全反射。
[0050] 第一信号光照射样品后原路返回被偏振分束器3c反射又经过半波片2g调整偏振 方向传输到偏振分束器3e，而上述本振光传输光路中经过偏振分束器3d透射部分的第一 本振光经过半波片2g调整偏振方向后也传输到偏振分束器3e，上述两个光束在偏振分束 器3e处汇合为待测光，同时进入检偏器1化后在光电探测器1化光敏面上拍频作为参考中 频信号。检偏器的作用是使得两个通道中的信号光和本振光的偏振方向保持一直，从而提 高了拍频效率。两个通道的信号进入信号分析部分进行数据处理，通过计算机或其他计算 模块获得待测样品的信息。
[0051] 为了可W避免空气的干扰，最好使用光纤进行光束传播，该样参考光路中的信号 光和本振光收到的干扰就变成一样，那么经过拍频和光电转换后形成的参考中频信号基本 是理想的参考中频信号，该样最终和待测中频信号进行对比时才能够得到最精确的相位信 息。
[0052] W上述数据为例，待测光中的信号光强为
[0053] /,=与sin口兄(v'-/)t+闲+辉] (0. 1)
[0054] 其中Ei为其幅值，V为激光输出光束的固有频率，它高达GHz量级，5XIO7为声光 频移器4a的频移值50MHz，巧为激光输出光束的初始相位，界2为信号光经过扫描系统后所 附加的相位，即最终需要的相位值。
[00巧]待测光中的本振光光强为
[0056] /; =&sin[2兀(r-/ +A/'H+0] (0. 2)
[0057] 其中，Af为声光频移器4b和声光频移器4a的频率差值，Af的取值范围为 0.1-2MHZ。
[0058]若两束光在光敏面上偏振方向一致，又由于光电探测器仅能响应干涉光的中频 项，因此，光电探测器12a可探测的光强为
[0059] Si(t) =EiEgCos(Aft) (0.3)
[0060]相应的，光电探测器1化可探测的光强为
[0061] .S',(0 = ￡,￡,cos(A// + ) (0. 4)
[0062]待测中频电信号S2(t)与参考中频电信号Si(t)同时被采集并经双通道A/D数据 采集卡进行数字采样，然后转换为离散的数字信号。
[0063]两路数字信号输入到计算机或计算模块进行处理，使用UbVIEW或者其他数据处 理软件进行求解两路信号之间的相位差提取。相位差提取算法通常采用W下H种，即，傅立 叶变换法，正交解调法或最小二乘法。经过该些算法就可W获得待测样品当前探测点（即 聚焦点）的相位信息。共聚焦扫描部分不断工作，得到一个个不同位置点的相位信息，当扫 描部分将光束扫描过一个平面时，由计算机得到的是待测样品的扫描面的信息图像，随后， 扫描部分通过升降物品台或者物镜，使得光束扫描的面与之前的面在空间高度上有区别， 那么再得到另外一个物体断面的相位信息，当得到了许多断面之后，再通过计算机通过常 用的图像合成软件将该些断面拼接成一个H维图像，即可反应出物体的H维相位信息。
[0064] 在获得当前探测点（即聚焦点）的相位信息后，若保持该聚焦点在物体平面内不 动，扫描部分中的微位移装置（如压电陶瓷等）进行纵向连续移动，计算机就可W得到的当 前聚焦点的相位变化。由于相位是包裹在（-K,n]中的，利用当前所得到的相位信息与前 一时刻得到的相位信息比较，若时间前后的相位信息之差的符号发生变化时，就计数器加 一；如此一来，当相位递增到波长入/2的整数倍时，就实现整数计数，实现了光腰内的相对 测量。该个随时间变化的相位应该是一个正弦曲线抑0，具体令KO= 口片+ 1)-的0，那么当 Y(t)的符号发生变化是，使得设置在计算机中的计数器就加一；令口(0-例0)，结合 计数器中的数值n，O(t)+n-n反映的是当前聚焦点的内部相对相位分布。
[0065]本发明不局限与上述【具体实施方式】，根据上述内容，按照本领域的普通技术知识 和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可W做出其它多种形式 的等效修改、替换或变更，均落在本发明的保护范围之中。
【权利要求】
1. 一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，包括： (1) 将激光光源发出的单波长激光分成两束光，其中一束进入一个具有固定频率的声 光频移器调制，其输出的一级光作为信号光；另一束进入一个具有可调频率的声光频移器 调制，其输出的一级光作为本振光；所述可调频率为所述固定频率前后0. 1-2MHZ范围； (2) 将所述信号光再次分成第一、第二信号光束，所述本振光再次分成第一、第二本振 光束，其中将第二信号光束和第二本振光束进行合束并输入到第二光电探测器上，经光电 探测器对合束光采集后输出参考中频信号； (3) 将第一信号光束进入共聚焦扫描系统，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返 回并与第一本振光束进行合束并输入到第一光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后 输出待测中频信号； (4) 将采集到的参考中频信号和待测中频信号进行处理，最后得出聚焦点的相位信息； 共聚焦扫描系统中的扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并 合成样品的三维信息图像。
2. 根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于当在步骤（4)得到 的某一聚焦点的相位信息时，聚焦点在物体平面内不动，扫描部分做轴向的微位移，得到聚 焦点的相位发生连续变化信息，利用当前所得到的相位信息与前一时刻得到的相位信息比 较，若时间前后的相位信息之差的符号发生变化时，就计数器加一；当相位递增到波长/2 的整数倍时，就实现整数计数，既实现对聚焦点光腰内的相对测量。
3. 根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于采用偏振分束器来进 行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半波片调制偏振方向。
4. 根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于步骤3中第一信号光 束与共聚焦扫描系统之间经半波片、偏振分束器和四分之一波片调制耦合，半波片、偏振分 束器使第一信号光束全部进入共聚焦扫描系统中，同时四分之一波片和偏振分束器使照射 到样品部分后，按原路返回的第一信号光束由偏振分束器全反射输出。
5. 根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于步骤2、3中的合束光 输入到光电探测器前，先进入检偏器，使得信号光和本振光的偏振方向保持一致。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于采用光纤 进行光束传输。
7. -种基于激光外差干涉术的共聚焦显微成像系统，包括激光光源部分，频移部分，共 聚焦扫描部分，光信号采集部分及信号分析部分； 激光光源包含输出一个单波长激光的激光器和将该激光分成两束激光的光源分束 器； 其特征在于：频移部分包含本振光传输光路和信号光传输光路；所述本振光传输光路 设有可调频率的第一声光频移器、本振光分束器； 信号光传输光路设有固定频率的第二声光频移器、信号光分束器、信号光合束器； 光信号采集部分包含用于采集待测光的第一平衡式光电探测器、用于采集参考光的第 二平衡式光电探测器； 光源分束器分出的其中一束进入信号光传输通道的第一声光频移器调制，其输出的一 级光作为信号光；另一束进入本振光传输通道的第二声光频移器调制，其输出的一级光作 为本振光； 所述信号光经信号光分束器分成第一、第二信号光束，所述本振光经本振光分束器分 成第一、第二本振光束，其中第二信号光束传输到本振光分束器与第二本振光束进行合束 为参考光，并输入到第二光电探测器上，经第二光电探测器对参考光采集后输出参考中频 信号； 第一信号光束进入共聚焦扫描部分，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返回并 输入到信号光合束器，第一本振光束也输入到信号光合束器进行合束为待测光，并输入到 第一光电探测器上，经第一光电探测器对待测光采集后输出待测中频信号； 采集到的参考中频信号和待测中频信号输入到信号分析部分进行处理，得出当前聚焦 点的相位信息；共聚焦扫描部分不断工作，得到一个个不同位置点的相位信息，并合成待测 样品的三维信息图像。
8. 根据权利要求7所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于所述分束器、合束器 均采用偏振分束器，在各偏振分束器的输入端的光路中均设有用于调制偏振方向的半波 片。
9. 根据权利要求7所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于：在第一信号光束进 入共聚焦扫描部分输入端的光路中依次设有半波片、偏振分束器和四分之一波片。
10. 根据权利要求7所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于：在光电探测器的输 入端光路中设有检偏器。
【文档编号】G01N21/45GK104359862SQ201410624833
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】王翰林, 刘满林, 刘俊, 安昕, 张浠 申请人:佛山市南海区欧谱曼迪科技有限责任公司