基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，以淡水绿藻中的蛋白核小球藻为受试生物，以96孔透明微板为载体，在传统化合物浓度-效应关系中引入时间因素，通过测定部分环境污染物对蛋白核小球藻的时间依赖性毒性，发现所有测定的污染物均具有明显的时间依赖特征，再利用最小二乘样条函数逼近法构建浓度-时间-效应曲面，了解污染物随浓度和时间变化的动态毒性效应。本发明克服传统毒性分析方法中只分析污染物对暴露生物在某一暴露时间终点的累积效应的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
【专利说明】基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境污染物毒性检测【技术领域】，尤其涉及一种基于蛋白核小球藻的环 境污染物时间毒性微板分析方法。
【背景技术】
[0002] 目前，人类的生产和生活不间断地排放着大量的种类繁多的污染物进入环境，对 生态环境和生物体产生着持续的毒害作用。因而，污染物毒性的检测除考虑浓度因素外，更 应该着眼于污染物对暴露生物随着时间而变化的动态效应，即同时观察浓度和时间两个因 素在污染物对生物体毒性变化过程中起的重要作用。
[0003] 环境中的污染物对水生生物的毒性效应是一个动态变化的过程，同时因其在环境 中代谢转化等因素的也会影响污染物对生物的毒性效应，而基于污染物对暴露生物在某一 特殊时间终点的毒性效应如短期效应和长期效应只是某一时间段的累积效应，不易观测到 污染物对生物体在整个暴露期间毒性效应发生的变化，更不易观测到污染物对暴露生物的 真实的毒性作用规律和作用机制。因此，检测环境污染物对暴露生物随时间而变化的动态 效应规律与作用机制，不仅有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污 染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
【发明内容】
[0004] 本发明提出了一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，相对 于传统毒性分析方法，强调了时间因素，克服传统毒性分析方法中只分析污染物对暴露生 物在某一暴露时间终点的累积效应的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能 更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信 肩、。
[0005] 本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，包括 如下步骤：
[0006] Sl、培养得到OD69tl = 0· 25-0. 35的蛋白核小球藻液；
[0007] S2、取m个8行X 12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微 孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200 μ L蒸馏水，在外围之内选取12个 微孔并定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100 μ L蒸馏水和100 μ L由Sl得到 的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分 别标记为j = 1、2、…、12,向第j组的4个第三微孔中分别加入100 μ L浓度为Cj的受试 样品溶液和100 μ L由Sl得到的蛋白核小球藻液；
[0008] 其中，Cj = f^1 .Cq,式中j为各组相应的标号，j = 1、2、…、12，CQ为受试样品的 储备液浓度，f为受试样品的稀释因子，而f可由公式f = (cycH)1/(Iri)推导得到，式中(^为 受试样品的最低效应浓度，C h为受试样品的最高效应浓度，η为受试样品溶液浓度梯度的数 目，即η = 12 ;
[0009] S3、将m个微板置于光照培养箱中进行培养，在培养Tx时，测定每个微板上第三微 孔的j组在Tx时的OD 69tl平均值并记为ODjla, x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的OD69tl 平均值并记为〇〇3!自,!￡，其中1'!￡ = 011、丨11、2丨11、牡11、6也、?、961^为正整数；
[0010] S4、根据公式μτ = (ODj组,x-〇Dj组,d) /ODj组,x计算得到浓度为Cj的受试样品处 理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ p，根据公式Uckt= (0D 空白，x_〇D空白，η) /OD空白，χ 计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ μ，式中X > 2 ;
[0011] 以受试样品对蛋白核小球藻的生长速率μ P的抑制率Ey为毒性效应，通过公式 Ej,T = (1-μ ρ/μ μ) X 100%计算在培养时间为Tx时浓度为&的受试样品的毒性，得到受 试样品的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效 应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同受试样品溶液浓度下的效应值。
[0012] S2中，m -般取3,以保证实验的重复再现性和成本、效率达到平衡。
[0013] S2中，在36个第一微孔中分别加入200μ L蒸馏水，可有效的克服实验中的边缘效 应，大幅降低误差。
[0014] S2中的Ch为通过预实验确定暴露96小时后最高受试样品溶液浓度，即对微板上 蛋白核小球藻的生长抑制率（即最高抑制率）达到50?100%的受试样品溶液浓度。
[0015] S2中的Q为通过预实验确定暴露96小时后最低受试样品溶液浓度，即对微板上 蛋白核小球藻的生长抑制率（即低抑制率）为-5%?+5%的受试样品溶液浓度。
[0016] 优选地，Sl中，所述培养得到OD69tl = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液具体如下：在 新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD69tl = 0. 15±0. 01， 置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25± I °C，光照培养箱的光照度为 50001ux，得到OD69tl = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液。
[0017] 培养过程中可能会因为环境等因素使得培养箱内部温度会稍高于或低于25°C，如 果稍高于或低于25度，培养箱会自动降温或升温至25°C，但幅度不会超过1°C。
[0018] 优选地，S2中，在任一个微板中，第二微孔为第6列和第7列所在列与第2行、第3 行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔，使得第二微孔位于每块微板的中央， 可大大降低本发明的误差。
[0019] 优选地，S2中，在任一个微板中，第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、 第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交 的微孔，使第三微孔中的第j组均分布在第二微孔的两侧，大大降低了本发明的实验误差， 而且大幅提高本发明的实验结果的再现性。
[0020] 优选地，S3中，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25 ±1°C，光照培 养箱的光照度为50001UX。
[0021] 经过预实验可知蛋白核小球藻的紫外-可吸收光谱图如图2所示，蛋白核小球藻 在波长为690nm光照环境下的OD值达到峰值，便于检测。
[0022] 根据预实验中对蛋白核小球藻进行培养得到的生长速率和时间的数据在直角坐 标系中进行曲线拟合，如图3所示，可以得出蛋白核小球藻在培养72h时达到最高值，即蛋 白核小球藻在〇_72h时一直处于对数增长期；继续培养，蛋白核小球藻的生长速率下降，当 培养至96h时，蛋白核小球藻的生长速率与蛋白核小球藻的初始生长速率相同，即蛋白核 小球藻在72-96h时处于静止期，如继续培养，则蛋白核小球藻进入衰落期，从而确定本发 明在S3中对蛋白核小球藻检测时间为0-96h。
[0023] 本发明可以测定部分抗生素、离子液体、重金属及其混合物的时间毒性。本发明与 常规96小时的微板毒性分析法测定数据对比，发现这些化合物及其混合物的浓度-效应曲 线（CRC)随着时间的延长，毒性在逐渐增加，但增加的速率不同。混合物的毒性相互作用规 律也随着混合物的组分和暴露时间发生很大的变化，有的混合物随着暴露时间的延长，协 同或拮抗作用逐渐增强，而有的混合物毒性相互作用随着时间甚至发生了作用类型的变化 如从协同逐渐转变为拮抗或从拮抗逐渐转变为协同。本发明可以更为合理的评价污染物的 毒性和揭示环境污染物毒性作用规律与机制。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方 法中96孔透明微板分组示意图，其中1为第一微孔，2为第二微孔，j = 1、2、"·、12为第三 微孔。
[0025] 图2为蛋白核小球藻的紫外-可见吸收光谱图。
[0026] 图3为蛋白核小球藻在微孔板上的同步生长速率图。
【具体实施方式】
[0027] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0028] 实施例1
[0029] 采用本发明测定抗生素硫酸链霉素的时间毒性，包括以下步骤：
[0030] S1、在新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD69tl =0. 14,置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25±1°C，光照培养箱的光照度 为50001UX，得到OD69tl = 0· 35的蛋白核小球藻液；
[0031] S2、参照图1，图1为本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性 微板分析方法中96孔透明微板分组示意图，取3个8行X 12列的96孔透明微板；在任一 个微板中，选取最外围的36个微孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200 μ L 蒸馏水，选取第6列和第7列所在列与第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在 列相交形成的12个微孔定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100 μ L蒸馏水和 100 μ L由Sl得到的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔 均分为12组并分别标记为j = 1、2、…、12,向第j组的4个第三微孔中分别加入100 μ L 浓度为G的硫酸链霉素溶液和100μ L由SI得到的蛋白核小球藻液，其中第三微孔中第j 组的四个微孔为任一行与第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4 列、第5列、第10列和第11列相交的微孔；
[0032] 其中，Cj =户+ 1 ·(；，式中j为各组相应的标号，j = 1、2、…、12，CQ为硫酸链霉素 的储备液浓度，f为硫酸链霉素的稀释因子，而f可由公式f = (Q/CH)1/(Iri)推导得到，式中 Q为硫酸链霉素的最低效应浓度，Ch为硫酸链霉素的最高效应浓度，η为硫酸链霉素溶液浓 度梯度的数目，即η = 12,通过暴露96小时的预实验，得到硫酸链霉素溶液的储备液浓度Ctl 为7. 02 X ΙθΛιοΙ/L，稀释因子f为0. 6,从而确定硫酸链霉素溶液的12个浓度梯度；
[0033] S3、将3个微板置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的培养条件为：光照培养 箱的温度为25土 1°C，光照培养箱的光照度为50001ux，在培养Tx时，测定每个微板上第三 微孔的j组在Tx时的OD69tl平均值并记为ODjla,x，并测定每个微板上第二微孔在T x时的OD69tl 平均值并记为OD空自,x，其中Tx = 0h、12h、24h、48h、72h、96h，X为正整数；
[0034] S4、根据公式μ j, T = (ODj组,x-〇Dj组,d) /ODj组,x计算得到浓度为Cj的硫酸链霉素 处理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ」, τ，根据公式μ。,T= (0D空白,X-0D空白,^1VOD空 θ,χ计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ M，式中X > 2 ;
[0035] 以硫酸链霉素对蛋白核小球藻的生长速率μ」,τ的抑制率Ej, τ为毒性效应，通过公 式Ep = (1-μρ/μ &τ) X 100%计算在培养时间为Tx时浓度为&的硫酸链霉素的毒性，得 到硫酸链霉素的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓 度-效应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同硫酸链霉素溶液浓度下的 效应值即效应浓度，如半数效应浓度（EC 5tl)，参照函数拟合的确定系数，以拟合值与实验值 相关性最大，即拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
[0036] 硫酸链霉素溶液各浓度在不同时间点时对蛋白核小球藻生长抑制率E的原始数 据如表1所示。
[0037] 表1硫酸链霉素的时间-毒性数据
[0038]
【权利要求】
1. 一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，包括如 下步骤： 51、 培养得到〇D69Q = 0? 25-0. 35的蛋白核小球藻液； 52、 取m个8行X 12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微孔并 定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200 ii L蒸馏水，在外围之内选取12个微孔 并定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100 y L蒸馏水和100 ii L由S1得到的蛋 白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分别标 记为j = 1、2、…、12,向第j组的4个第三微孔中分别加入100ii L浓度为Cj的受试样品 溶液和100 ii L由S1得到的蛋白核小球藻液； 其中，Cj = f^1 ?〇!，式中j为各组相应的标号，j = 1、2、…、12，CQ为受试样品的储备 液浓度，f为受试样品的稀释因子，而f?可由公式f = (cycH)1/(Iri)推导得到，式中Q为受试 样品的最低效应浓度，CHS受试样品的最高效应浓度，n为受试样品溶液浓度梯度的数目， 即 n = 12 ; 53、 将m个微板置于光照培养箱中进行培养，在培养Tx时，测定每个微板上第三微孔的 j组在Tx时的0D_平均值并记为0DjS, x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的0D_平均 值并记为0D空白,x，其中Tx = 0h、t h、2t h、4t h、6t h、…、96h，x为正整数； 54、 根据公式yT = (〇Dj x-〇Dj h) A?」x计算得到浓度为Cj的受试样品处理蛋 白核小球藻在T时的平均生长速率，根据公式y u = (0D 空白，x_〇D空白，x-j /0D空白，x 计算 得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率y ^，式中x > 2 ; 以受试样品对蛋白核小球藻的生长速率T的抑制率& T为毒性效应，通过公式Ej, T=(1-h,T/ii u) X 100%计算在培养时间为Tx时浓度为q的受试样品的毒性，得到受试样 品的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效应函 数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同受试样品溶液浓度下的效应值。
2. 根据权利要求1所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特 征在于，S1中，所述培养得到0D_ = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液具体如下：在新鲜的培 养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的〇D_ = 0. 15±0. 01，置于光照 培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25 土 1°C，光照培养箱的光照度为50001UX，得到 0D69Q = 0? 25-0. 35的蛋白核小球藻液。
3. 根据权利要求1或2所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法， 其特征在于，S2中，在任一个微板中，第二微孔为第6列和第7列所在列与第2行、第3行、 第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔。
4. 根据权利要求1或2或3所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方 法，其特征在于，S2中，在任一个微板中，第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、 第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交 的微孔。
5. 根据权利要求1-4任一项所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析 方法，其特征在于，S3中，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25± 1 °C，光照培 养箱的光照度为50001UX。
【文档编号】G01N21/31GK104390920SQ201410704971
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】张瑾, 陈琼, 朱曙光, 凌琪, 刘磊 申请人:安徽建筑大学