用于使用CARS显微术分析样本的方法与流程

本发明涉及根据权利要求1的前序部分的用于使用CARS显微术研究从生物源获得的样本的方法。

背景技术：

“非线性拉曼光谱术”被理解为指基于光在固体或气体处的非线性拉曼散射的光谱研究方法。本发明涉及基于相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的显微研究方法。

针对这种研究方法(也称为“CARS显微术”)，使用发射不同波长的光(vP和vS，泵浦和斯托克斯光束)的两个激光器来生成CARS光谱vCARS:vCARS＝2vP-vS,ICARS≈(IP)²-IS，其中，vS应当是可调谐的。

图2示意性地示出了CARS过渡的谱项图。如果频率差vP-vS匹配所研究样本中的两个分子振动状态|1>和|0>之间的频率差，则CARS信号被放大。其中这种不同的分子状态发生并且也相应地可探测到的样本的结构(通常为特征化学键)在以下被称为“谐振部位”。通常包含它们的一个或多个分子的相应结构也被称为“散射体”。

泵浦光束和斯托克斯光束同轴地组合用于显微术应用，并且被一起聚焦在相同的样本体积上。反斯托克斯辐射被发射的方向根据针对下面的如图3中示意性示出的四波混频过程的相位适应条件来确定。

用于CARS显微术的方法和设备例如从DE 10243449 A1(同时地US 7,092,086 B2)已知，其描述了一种CARS显微镜，其具有用于生成可经由显微镜光学系统同轴地指向样本的泵浦光束和斯托克斯光束的部件，并具有用于探测相应的探测光的探测器。

CARS显微术的进一步的物理原理可以从当前的参考工作收集(参见例如Xie,X.S.等在J.B.Pawley(ed.),Handbook of Biological Confocal Microscopy,3rd edition,New York,Springer,2006中的Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy)。

与传统的或共焦拉曼显微术相比，在CARS显微术中，可以特别地实现更高的探测光产量和对干扰的次生效应的更好抑制。探测光还可以更容易地与辐照光分离。

如所提到的，因为样本中的分子或者特定化学键的特征自然振动可以在CARS显微术中使用，所以其允许物种选择成像，其在原理上省掉进一步的标记和染色。利用CARS显微术，关于样本的分子结构信息可以以三维空间分辨率获得。

然而，CARS显微术总是依赖于样本中相应的谐振部位的存在。如果谐振部位不存在，或者如果针对感兴趣结构，它们的振动状态的频率差不足以与周围区分，则它们不能被探测到。另外，利用CARS显微术的已知方法，通常难以抑制非谐振背景。

皮秒激光脉冲可以例如用于操作和减少非谐振背景，但是它们需要使用相应复杂的激光器。用于减少非谐振背景的另外的可能性是所谓的“外延探测(epi-detection)”和偏振敏感探测。时间分辨方法也在该情况中使用。另一可能性是控制激励脉冲的相位。

然而，实践证明，上述方法是有点繁琐的。在特定情况下，也期望对样本中的已定义结构的选择性强调，但是这在用于CARS显微术的传统方法中是不可能的。

本发明在于在此提供一种补救，并且其目标是提供用于CARS显微术的相应地改进的方法。

技术实现要素：

该目标通过具有权利要求1的特征的用于使用CARS显微术来研究从生物源得到的样本的方法来实现。

优选的实施例分别是从属权利要求和以下说明书的主题。

本发明的优点

本发明从用于CARS显微术的已知方法出发。这种方法包括对从生物源得到的样本的研究，其中，通过利用激光辐射对样本中的谐振部位的激励而由相干反斯托克斯拉曼散射生成的信号以图像再现的方式被感测，以及其中，还可以可选地从信号中获得包含谐振部位的化学结构的结构特性。

当在本发明的上下文中提到“从生物源获得的样本”时，其可以涉及从生物系统直接移除的样本，例如，动物组织样本、植物结构、和/或从其得到的已制备标本。然而，本发明还可以在或多或少精加工的样本中(例如在食品化学中)使用。本发明特别地适用于例如纯度检查，诸如油的纯度检查。

本发明当然特别适用于例如神经组织的生物样本中的标记，其中，标记的信息可以与振动光谱术的特异性结合。由此可以例如同时地检查用于标记的脂类，并以图像再现的方式处理它们；这些之前仅可以单独地被感测。

包括谐振部位的化学结构的结构特性可以从由相干反斯托克斯拉曼散射生成的信号以已知的方式获得。例如当使用可调谐斯托克斯光束时还可以以光谱的形式获得的相应的信号包含例如相应的波长、频带、和/或峰值的特征，这对于各自包含的谐振部位、特别是各自的化学键是特定的。这些被表示为拉曼位移或CARS位移(其对应于相应的分子振动状态之间的频率差)，其通常是以波数的形式。本领域技术人员可以从相关参考工作收集针对化学键获得的特征波长。

本发明还适用于固定波长的斯托克斯光束的使用。尽管在该情况下未获得光谱，但由相干反斯托克斯拉曼散射生成的信号也可以在该情况下用于图像再现。

根据本发明，这种方法由此包括通过以下提供至少一个谐振部位：通过样本的内在化学结构与至少一个另外的反应搭档的生物正交反应，即，通过生物正交反应引入未固有地包含在样本中的相应结构。

术语“生物正交反应”将在下文进一步详细说明。术语“内在化学结构”在此被理解为在其起源就已经包含在样本中的化学结构。在从生物源获得的样本中，其例如涉及具有脂类中的相应键和蛋白质中的肽键等的脂肪链。这种内在化学结构包括可以使用CARS显微术以图像再现方式感测到的谐振部位。

与这种内在谐振部位、或它们所基于的化学结构相比，根据本发明引入至样本中的谐振部位是样本基于它的自然来源不包括的那些谐振部位。本发明由此可以为固有地不具备或不具备足够的谐振部位、或其中谐振部位不表现期望定位或特异性的样本配备相应的谐振部位。

根据本发明，可以提供为，至少一个谐振部位是至少一个另一反应搭档的至少一部分，和/或所述部位至少部分地由生物正交反应本身生成。前一种情况根本上对应于与荧光染料的传统的染色反应和/或标记反应。这里，通常，荧光或颜色施加结构在相应的分子中提供，并且耦合至样本的反应结构。然而，与其对比，根据本发明的方法的利用还可以在实施生物正交反应自身的情况下生成谐振部位。

这可以例如通过共轭二烯至亲二烯体(其可以具有双键或三键)的环加成反应来实现，如下所示：

如果例如残基Y在此用作耦合部位，则针对合适的二烯烃的另外的完整的反应，可以生成在以上反应式的右边示出的结构，该结构由于其特定属性展示了明确定义的CARS图案，随后的探测处理可以与该图案匹配。

如所提到的，根据本发明的方法也可以特别地用于突出显示通常依靠CARS显微术不可检测的化学结构或使得通常依靠CARS显微术不可检测的化学结构可见。

本发明使得一旦通过生物正交反应创建了谐振部位，就可以特别地使用可以深入相应的组织中的小的分子，由于没有发生位阻现象，并且例如小的分子扩散通过组织。与例如使用荧光染料的传统的染色技术相比，这在使用生物正交反应的情况下是实质性的优点。这种类型的引入组织是特别感兴趣的，因为如所提到的，可以通过CARS显微术实现三维图像再现。

如所提到的，本发明基于生物正交化学反应的使用。“生物正交反应”在本申请的上下文中被理解为可以在没有明显地干扰自然过程的情况下在生命系统中进行的化学反应。生物正交反应可以特别地在没有细胞损害效果的情况下进行。

此处，术语“生物正交”以及相关的化学反应对于本领域技术人员是已知的(参见E.M.Sletten和C.R.Bertozzi,"Bioorthogonal chemistry,or:Fishing for selectivity in a sea of functionality"[Bioorthogonale Chemie-oder:in einem Meer aus nach fischen],Angew.Chem.121(38),7108-7133,2009,同时地E.M.Sletten和C.R.Bertozzi,"Bioorthogonal Chemistry:Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality,"Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(38),6974-6998,2009)。K.V.Reyna和Q.Lin,"Bioorthogonal Chemistry:Recent Progress and Future Directions,"Chem.Commun.(Camb.)46(10),1589-1600,2010还提供了综述。

典型的生物正交反应包括例如叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成反应(所谓的"无铜催化的点击化学(copper-free click chemistry),"参见J.M.Baskin等,"Copper-Free Click Chemistry for Dynamic In Vivo Imaging,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(43),16793-16797,2007)。其他典型反应是硝酮和前述环辛炔之间的反应、从醛和酮类的肟/水合物形成、四嗪反应、基于异氰化物的点击反应、以及四环庚烷形成。

狄尔斯-阿尔德反应和/或施陶丁格连接被认为特别有利地用于根据本发明的生物正交反应。施陶丁格连接是用于产生生物共轭体的高度化学选择方法。相应的反应搭档对于生物系统中存在的几乎所有官能团是生物正交的，并且已经在室温下在水环境中反应。这允许施陶丁格连接甚至在活细胞的复杂周围环境中使用。关于细节参考相关技术文献(参见例如S.Sander等,"Staudinger Ligation as a Method for Bioconjugation,"Angew.Chem.Int.Ed.Engl.50(38),8806-8827,2011)。

生物正交反应的使用通常包括两个步骤。首先，细胞基质，即在该情况下为要研究的样本，装备有被引入至样本中并且也称为“化学报告者”的生物正交官能团。所使用的基质包括例如代谢物、酶抑制剂等，以及在本发明的上下文中，要被标记并且期望在CARS显微术中改进可视化的所有化合物或组织。也被称为化学报告者的生物正交官能团必须不实质上修改样本的结构，以不负面地影响生物活性。在第二步骤中，引入具有与化学报告者反应的互补官能团的标记基质。

与CARS显微术结合的生物正交反应的使用使得在任何样本中(例如在细胞中)的目标部位的专门探测成为可能，而不负面地影响可能继续发生的生物化学过程。随后，标记反应导致用于CARS图像再现的“活性”基质的实际合成或引入。

该方法允许相应目标的CARS活性散射截面增大，或者最初通过合适的合成反应来生成。相应的方法通过化学图像再现将已知的多光子技术的优点与相应的选择性反应相结合。特别地，与荧光染料作为图像产生元素的传统使用(例如，用于单光子方法)相比，由于在生物正交反应中使用的化合物的有利空间属性，在组织中位于更深处的目标部位可以用于图像产生。

如所提到的，可以通过根据本发明提出的特征获得的另一优点是在CARS显微术的情况下非谐振背景的可再现对比染色。

如所提到的，CARS方法通常考虑还可以传统地用作“对比染色”的非谐振背景。然而，这具有缺点，即背景是统计的。另一方面，利用根据本发明提出的特征，可以通过相应的主动执行的“对比染色”引入定义的背景，以使得特定分子可以作为目标，并且所产生的图像可以与已经生成的背景相关联。这能够改进相应的CARS方法的再现性，以及实现改进的定量结论。

如通常已知的，传统的拉曼方法不过度敏感，并且需要强拉曼散射体。CARS显微术实质上更敏感，尽管其不能像拉曼光谱学那样用在高度特有的复合基质混合物中。在一些情况下，该较低的特异性对于研究方法所基于的任务来说是不足的。另一方面，本发明允许特异性的相应增加，以及另外地，散射截面的增大(在必要时)。

在本发明的上下文中的生物正交反应的特别有利的示例包括以如下形式的至少一个反应步骤：修改的胡伊斯根(Huisgen)环加成反应、硝酮偶极环加成反应、降冰片烯环加成反应、(4+1)环加成反应、和/或氧杂降冰片二烯环加成反应。

前述无铜催化点击反应特别地适用于例如使用环辛炔的本发明的上下文中。环辛炔例如耦合至叠氮基团，其可以继而作为第一反应搭档被引入至相应的样本中。叠氮基团特别地是生物正交的，因为它们很小，并且可以由此容易地穿透进入相应的组织中，并且不产生任何空间改变。叠氮化物不出现在天然样本中，使得不存在有竞争性的次级生物反应(参见M.F.Debets等,"Azide:a unique dipole for metal-free bioorthogonal ligations,"Chembiochem.11(9),1168-84,2010)。环辛炔较大，但它们具有足够的稳定性和正交性，以使得它们也适用于体内标记。

四嗪反应、四唑反应、和/或四环庚烷反应也可以特别地用于本发明的上下文中作为生物正交反应的至少一个反应步骤。这种反应在原理上也是已知的。

如已经重复说明的，样本的至少一个内在结构可以首先耦合至第一反应搭档，并且耦合至样本的内在结构的反应搭档之后可以耦合至另一反应搭档。任何反应搭档可以包括谐振部位，或者谐振部位可以仅通过任何两个或更多个反应搭档之间的反应形成。

通过生物正交反应将内在地不具有谐振部位的样本的结构配备有谐振部位的方法被认为是特别有利的。如所述，这特别地涉及固有地非谐振背景，其在传统方法中产生无论如何不可再现的统计信号。相反，本发明使得可以利用相应的谐振部位标记非谐振背景，并由此生成稳定的可再现的背景信号。后者有利地通过以如下方式选择合适的化合物来生成：其以对照的方式从实际感兴趣的结构突出，例如在明显不同的波长处呈现峰值。

相应的方法可以包括为样本的非谐振背景的结构提供谐振部位，并将由这些谐振部位引起的谐振信号的信号成分与由样本的内在谐振部位引起的信号成分相关联。

可以理解，在不背离本发明的范围的情况下，以上描述的特征和以下将要说明的特征不仅以所指出的相应的组合使用，还以其他组合或独立地使用。

本发明基于示例性实施例在附图中示意性地示出，并且将在下文参考附图详细描述。

附图说明

图1示意性地示出了可以在根据本发明的实施例的方法中使用的CARS显微镜。

图2示出可以作为本发明实施例的基础的CARS过渡的谱项图。

图3示出可以作为本发明实施例的基础的四波混频过程。

图4示出根据示意图的根据本发明实施例的方法。

图5示出根据示意图的根据本发明实施例的方法。

图6示出根据示意流程图的根据本发明实施例的方法。

在图中，彼此对应的元件被标记相同的参考标记并且不再重复说明。

具体实施方式

图1示出被实现为共焦扫描显微镜100的显微镜，其包含用于生成第一波长(例如，800nm)的光束102的激光器101。激光器101可以被实现为模式耦合掺钛蓝宝石激光器103。光束102通过入耦合光学器件104聚焦至例如用于波长修改的微结构光学元件105的端部，该元件可以被实现为由光子带隙材料106制造的光导纤维。

例如为了准直从光子带隙材料106制成的光导纤维出射的波长展宽的光束107，提供出耦合光学器件108。相应地波长修改光束的光谱结果是例如在从300nm至1600nm的波长区域上是几乎连续的，光功率水平在整个光谱上很大程度上是恒定的。

波长展宽后的光束107通过抑制部件108，例如电介质滤波器109，其在波长展宽后的光束107中将第一波长的区域中的光分量的功率水平降低至波长展宽后的光束107的其他波长的水平。波长修改后的光束107之后例如利用光学器件110聚焦在辐照针孔111上，之后到达选择部件112，其被实现为声光组件113并用作主分束器。可以利用选择部件112来选择各自具有由用户定义的波长的泵浦光束114和斯托克斯光束115。

泵浦光束114和斯托克斯光束115从选择部件112同轴地传播，行进至扫描镜116，扫描镜116将它们引导通过扫描光学器件117、管式光学器件118和物镜119至样本1上。来自样本1的探测光120(该光在图中以虚线示出)往回行进(当例如提供去扫描探测时)通过物镜119、管式光学器件118和扫描光学器件117至扫描镜116，并且之后至选择部件112，通过选择部件112，并且在穿过探测针孔121之后，被实现为多频带探测器的探测器122探测到。当例如同样提供非去扫描探测时，可以在聚光器侧上提供两个另外的探测器123、124。从样本在笔直向前的方向上出现的探测光125被聚光器126准直并由二向色分束器127按照波长分配至另外的探测器123、124。滤波器128、129被设置在探测器的前面以抑制探测光的具有泵浦光束114或斯托克斯光束115的波长的那些成分，或者其他光的成分。

图2和3在介绍部分已经被涉及。

图4在相应局部图A和B中示出从生物源获得的样本1。样本1可以例如是要被标记的细胞和/或显微切片的表面和/或相应制备的组织样本。

在所示出的示例中，样本1包括被标记为2的内在化学结构，其能够与在此被标记为3的反应搭档耦合。在所示出的示例中，反应搭档3包括耦合部位4和谐振部位5，其在通过激光辐射激励时，可以产生由于相干反斯托克斯拉曼散射引起的谐振信号。

图4的图细节A示出样本1的内在化学结构2和反应搭档3之间的非耦合状态。另一方面，局部图B示出了耦合状态，其结果是反应搭档3的谐振部位5现在可以用作样本1的用于探测的部分。

而图4及其部分A和B示出了单段反应，图5示出了两段反应。其中，内在化学结构2首先耦合至耦合分子6，耦合分子6包括用于耦合至样本1的内在化学结构2的第一官能团7和用于耦合至携带谐振部位5的反应搭档3的第二官能团8。样本1的内在化学结构2在此耦合至耦合分子6的第一官能团7；反应搭档3以其耦合部位4耦合至耦合分子6的第二官能团8。在图4和5中不同地部分绘制的耦合部位4和谐振部位5仅用于示意。根据图5，谐振部位5成为样本1的一部分，并且可以相应地被探测到。然而，与图4不同，局部图A在此示出耦合状态，并且局部图B示出非耦合状态。

在图6中，以示意流程图的形式示出了根据本发明实施例的方法，并整体标记为10。该方法从提供样本1的方法步骤11开始。在方法步骤12中，执行样本的内在化学结构与至少一个另外的反应搭档的生物正交反应。在步骤13中，具有通过步骤12中的生物正交反应提供的谐振部位的样本被引入至合适的研究系统，例如根据图1的CARS显微镜。在步骤14中，在研究系统中执行样本的研究。相应获得的信号在步骤15中被感测，并且用于例如获得包含至少一个谐振部位的化学结构的至少一个结构属性。