一种治疗艾滋病的中药唐草片新增检测成分的测定方法与流程

本发明涉及中药复方制剂，具体涉及治疗艾滋病的中药唐草片新增检测成分的测定方法。

背景技术：

国内外运用中医药治疗艾滋病的大量实验和临床研究结果发现，中医药对艾滋病的治疗，具有增强和稳定机体免疫功能；例如，在治疗某些机会性感染，改善患者的症状体征，提高生活质量和延长生命等方面均有较大的作用。

所述中药唐草片由老鹳草、黄芪、龙葵、金银花、木棉花、诃子、白花蛇舌草、石榴皮、糯稻根、菱角、瓜蒌皮、柴胡、香薷、甘草、鸡血藤、红花、银杏叶、马齿苋、胡黄连和全蝎二十味中药原料制成。

中国专利200410030849公开了一种治疗艾滋病的中成药复方制剂。该发明经过科学、严格的中医药理论、药物相互作用、中药配伍、药物毒理和药效、临床研究等基础研究。该中成药复方制剂具有益气养血、清热解毒、活血化瘀、除湿化痰的功效，通过益气祛邪扶正，增强HIV/AIDS患者的免疫功能，延缓HIV病毒的复制，体现了中医药的整体调理、固本祛邪的理念，弥补了西药HARRT疗法的不足，同时又可以作为艾滋病患者的辅助治疗手段，价格低廉，服用方便。

中国专利200910048798.6公开了一种治疗艾滋病中药唐草片的 质量标准及检测方法，采用显微特征鉴别唐草片样品中全蝎成分；采用薄层层析法鉴别唐草片样品中老鹳草、石榴皮、糯稻根、甘草、胡黄连、柴胡、黄芩、银杏叶等成分；采用高效液相色谱法定量测定唐草片样品中所含金银花的绿原酸和木樨草苷含量、红花的红花黄色素A含量、黄芪的黄芪甲苷含量，但是所述测定方法均为分别进行的，因而操作比较烦琐，不利于大批量样品的检测，并且其他成分无法控制。此外，人类免疫缺陷病毒的复制周期主要包括吸附、融合、逆转录、整合、转录、翻译、出芽和成熟等，HIV-1整合酶是HIV复制必需的酶，在宿主体内又无与之功能对等的组分，是抗HIV-1药物的理想靶点之一。HIV-1整合酶抑制剂可阻断病毒整合，IN抑制剂与蛋白酶或/和逆转录酶抑制剂联用在治疗H1V/AIDS方面有重要临床价值，而且对于解决当前的耐药性问题也有较大的帮助。然而由于其完整的晶体衍射结构尚不清楚，影响了相应抑制剂的发展。Mi-JeongAhn等人发现诃子中的没食子酸及其它三种没食子酰葡萄糖具有抑制HIV整合酶的作用(Mi-JeongAhn,Chul Young Kim,Ji Suk Lee et al.Inhibition of HIV-1integrase by galloylglucoses from terminaliachebula and flavonal glycoside gallates from euphorboapekinensis[J].Planta Med.2002,68:457-459.)。但现有中药唐草片的检测中对诃子没有检测，因此，需要进一步改进，增加相关成分的测定方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，克服上述不足之处，研究设计 专一性强、稳定性好的应用高效液相色谱将中药唐草片的多种成分含量同时检測的测定方法。

本发明提供了一种治疗艾滋病的中药唐草片新增检测成分的测定方法。

本发明新增检测成分的测定方法为：

(1)采用薄层层析法鉴别唐草片中白花蛇舌草，诃子成分。

(2)采用在同一个高效液相色谱法条件下，通过流动相的梯度洗脱，将没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ同时进行测定。

具体的，本发明方法包括下列步骤：

(一)薄层层析色谱法鉴别：

(1)、白花蛇舌草鉴别：取中药唐草片样品，研细，加水10-60ml直接溶解，离心取上清液；或加乙醇10-60ml超声或回流，滤液蒸干，优选直接加水溶解，残渣加水5-50ml溶解；加入乙酸乙酯或三氯甲烷或正丁醇5-50ml，优先选择乙酸乙酯，萃取1至2次优选2次，收集溶剂层，100℃水浴上蒸干，残渣加1-5ml乙酸乙酯或无水乙醇或甲醇，优先选择甲醇溶解作为供试品；另取白花蛇舌草对照药材适量，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入乙酸乙酯或三氯甲烷或正丁醇适量起同供试品操作，制成对照药材溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述两种溶液各5-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10:2.5:4:0.25)或石油醚-苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5:10:3.5:0.25)为展开剂，优选环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸 (10:2.5:4:0.25)，展开，取出，晾干，氨蒸气中熏至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的主斑点；

(2)、诃子鉴别：取诃子对照药材1g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入乙酸乙酯或三氯甲烷或正丁醇适量起同白花蛇舌草鉴别项下供试品操作，制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取对照药材溶液和上述(1)白花蛇舌草鉴别项下的供试品溶液各5-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层或甲苯-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层为展开剂，优选二氯甲烷-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇显色，在105℃加热至斑点清晰，取出置室温(25±2℃)冷却半小时，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点；

(二)高效液相色谱法测定：

取唐草片样品适量，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％以上甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放至室温(25±2℃)，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液，以没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相以有机溶剂和水，加入酸，流动相选自乙腈：水：磷酸或甲醇：水：磷酸，比例为乙腈-水-磷酸(6-17:94-83:0.3)或甲醇-水-磷酸 (20-40:80-60:0.3)，优选乙腈-水-磷酸(6-17:94-83:0.3)，检测波长为263nm-293nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定。

每片唐草片含没食子酸不低于0.9mg、绿原酸不低于0.5mg、甘草苷不低于0.25mg、胡黄连苷Ⅱ不低于0.45mg。

本发明是在原中药唐草片的检测方法(专利号20091004878.6)的基础上进一步改进，增加了鉴别和含量测定项目。

没食子酸是自然界中广泛存在的一种多酚类化合物，也是唐草片中含量很高的一种成分。唐草片处方中的诃子、老鹳草、石榴皮等药材均含有没食子酸，具有抑制HIV-1整合酶的作用，进而可以直接阻断HIV病毒复制，同时没食子酸具有很强的抑菌活性，对HIV导致的并发症感染具有治疗作用。因此，没食子酸是唐草片的重要有效成分之一，其含量应该予以控制。

甘草苷和胡黄连苷Ⅱ分别为甘草和胡黄连的指标性成分，控制其含量以代表甘草和胡黄连的质量。

对于中药复方来说，用薄层色谱鉴别的方法，可以判断产品是否含有本味药材，薄层色谱斑点的有无可判定所用药材的真伪,斑点的大小、颜色的深浅可在一定程度上反映出所用药材的优劣。因此为了确保复方成药的质量，应尽可能多的对产品中所含有的药材进行鉴别，因此本发明方法在唐草片现有检测方法的基础上通过研究增加了白花蛇舌草和诃子两味药材的薄层鉴别方法。采用同一个高效液相色谱法条件下，通过流动相的梯度洗脱，将没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡 黄连苷Ⅱ是在同一色谱条件下同时进行测定。

本发明提高和改进了中药唐草片的检测，增加了以下内容：

(1)唐草片样品中白花蛇舌草的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图1。

(2)唐草片样品中诃子的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图2。

(3)唐草片样品中没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ的高效液相色谱测定，每片的没食子酸含量不得少于0.9mg，含金银花以绿原酸计不得少于0.50mg，含甘草以甘草苷计不得少于0.25mg，含胡黄连以胡黄连苷Ⅱ计不得少于0.45mg，见图3。

本发明通过全检项目确证实验，说明本发明新增检测项目可以加入原检测方法，进一步提高药品的检测品种和方法，有利于提高产品质量。

本发明用先进的色谱分析技术，能有效控制中药唐草片活性指标成分，建立了产品的质量控制标准。本发明的测定方法增加了二味药成分的鉴别，并且采用高效液相色谱能同时测定多个个成分，有利于中药唐草片的批量生产测定。本发明测定方法稳定可靠、专一性强，有较大的应用价值。

附图说明

图1为唐草片样品中白花蛇舌草的薄层色谱图：置日光下检视，点样顺序从左至右，1—为白花蛇舌草空白阴性样品，2—为实施例1的唐草片样品，3—为实施例2的唐草片样品，4—为实施例3的唐草 片样品，5—为白花蛇舌草对照药材。

图2为唐草片样品中诃子的薄层色谱图：置日光下检视，点样顺序从左至右，1—为诃子空白阴性样品，2—为实施例4的唐草片样品，3—为实施例5的唐草片样品，4—为实施例6的唐草片样品，5—为诃子对照药材，

图3为实施例7唐草片的高效液相色谱图

按出峰保留时间标注的出峰序号情况如下，从从左至右，1—为没食子酸，2—为绿原酸，3—为甘草苷，4—为胡黄连苷Ⅱ。

图4为实施例10没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ标准品的高效液相色谱图

按出峰保留时间标注的出峰序号情况如下，从从左至右，1—为没食子酸，2—为绿原酸，3—为甘草苷，4—为胡黄连苷Ⅱ。

图5为缺金银花、甘草、胡黄连的唐草片高效液相色谱图

按出峰保留时间标注的出峰序号，从从左至右，1—为没食子酸。

具体实施方式

以下实施例使用的中药唐草片由上海百岁行药业有限公司生产(市售产品),各种试剂和对照药材市售得到。

实施例1

唐草片中白花蛇舌草的鉴别：分别取唐草片样品1、样品2、样品3(均为由上海百岁行药业有限公司生产,市售产品)各10片(每片片重0.4g，研细，加水50ml，超声30min，离心，取上清液，加入三氯 甲烷(所用试剂均市售得到)50ml，萃取1次，收集三氯甲烷层，蒸干，残渣加1.5ml甲醇溶解作为供试品。另取白花蛇舌草对照药材(购自中国生物制品检定所)0.5g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入三氯甲烷50ml起同供试品操作，制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10:2.5:4:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，氨蒸气中熏至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的主斑点。

实施例1的结果见图1.

实施例2：唐草片中诃子的鉴别：(唐草片样品同实施例1)

取诃子对照药材(购自中国生物制品检定所)1g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入三氯甲烷50ml起同实施例1白花蛇舌草鉴别项下供试品操作，制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取对照药材溶液和实施例1白花蛇舌草鉴别项下的供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇显色，在105℃加热至斑点清晰，取出置室温(25±2℃)冷却半小时，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点。

实施例2结果见图2。

实施例3唐草片中没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ的含量测定：

取唐草片样品(均为由上海百岁行药业有限公司生产，市售产品)适量，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放至室温(25±2℃)，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液，没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ对照品(购自中国生物制品检定所)：

精密称取没食子酸对照品、绿原酸对照品、甘草苷对照品、胡黄连苷Ⅱ对照品适量，加甲醇配制成每毫升分别含没食子酸0.05mg，绿原酸0.045mg，甘草苷0.02mg，胡黄连苷0.05mg的混合溶液，即得。

色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水-磷酸(6-17:94-83:0.3)梯度洗脱，检测波长为263nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定。

实验结果：每片唐草片中含没食子酸1.30mg，含绿原酸0.80mg，含甘草苷0.41mg，含胡黄连苷Ⅱ0.60mg。

实施例4

唐草片(批号130502，为上海百岁行药业有限公司生产的市售产品)中没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ含量测定的方法学验 证，(下列各表中的编号是同一批号的样品)

标准品购自中国生物制品检定所，所用试剂来自市售。

(1)准确度(加样回收率)

a、没食子酸

表1唐草片样品的没食子酸加样回收率数据

没食子酸回收率均在95％～105％之间，RSD小于2％，在可接受的范围之内，表明没食子酸的含量测定方法准确度良好。

b、绿原酸

表2唐草片样品的绿原酸加样回收率数据

绿原酸回收率均在95％～105％之间，RSD小于2％，在可接受的范围之内，表明绿原酸的含量测定方法准确度良好。

c、甘草苷

表3唐草片样品的甘草苷加样回收率数据

甘草苷回收率均在95％～105％之间，RSD小于2％，在可接受的范围之内，表明甘草苷的含量测定方法准确度良好。

d、胡黄连苷Ⅱ

表4唐草片样品的胡黄连苷Ⅱ加样回收率数据

胡黄连苷Ⅱ回收率均在95％～105％之间，RSD小于2％，在可接受的范围之内，表明胡黄连苷Ⅱ的含量测定方法准确度良好。

(2)精密度(重复性)

精密称取唐草片样品6份，按照唐草片高效液相法测定没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ项下含量测定的要求平行操作，计算6份样品含量如下表：

表5唐草片样品的重复性数据

唐草片平行六份样品中的没食子酸平均含量0.3301％、绿原酸平均含量为0.1993％、甘草苷的平均含量为1.0352％，胡黄连苷平均含量为0.1569％，四者RSD均不超过3％，在可接受的范围之内。

(3)专属性

a、金银花、甘草、胡黄连空白阴性样品的制备

制备时候不加金银花、甘草、胡黄连三味药材,取制备100片唐草 片配方量的药材,按如下比例制备，老鹳草10％，黄芪10％，龙葵10％，木棉花5％，诃子3％，白花蛇舌草7％，石榴皮3％，糯稻根10％，菱角7％，瓜蒌皮3％，鸡血藤9％，红花3％，银杏叶3％，马齿苋7％，柴胡5％，香薷3％，全蝎2％，加10倍量水，煮沸后煎煮1小时，过滤，收集滤液；药渣继续加入10倍量水进行第二次煎煮，煮沸后煎煮1小时，过滤；合并滤液，将滤液煮沸浓缩至黏稠状态时，转移至真空干燥箱，设置温度为60度，真空度—0.1Mpa，减压干燥30小时，收集浸膏粉，即为金银花、甘草、胡黄连空白阴性样品。

b、专属性测定

取0.5g金银花、甘草、胡黄连空白阴性样品按照唐草片含量测定项下供试品制备要求同法制备并检测，在绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ保留时间处未见有色谱峰干扰，表明该含量测定方法专属性良好。详细图谱见图4-5。

除没食子酸外，在与标准品图谱(图4)相同保留时间位置没有出现绿原酸，甘草苷，胡黄连苷Ⅱ相应的色谱峰干扰，说明检测方法的专属性符合要求。

(4)线性

精密称取没食子酸对照品约12.33mg、绿原酸对照品约10.35mg、甘草苷胡黄连苷Ⅱ对照品约11.04mg，分别至25ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，即分别为没食子酸对照品储备溶液、绿原酸对照品储备溶液、胡黄连苷Ⅱ对照品储备溶液。分别精密移取没食子酸对照品储备溶液、绿原酸对照品储备溶液、胡黄连苷Ⅱ对照品储备溶液各1ml、 2ml、3ml、5ml、8ml，分别至编号为1、2、3、4、5的五个25ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，过0.45μm有机膜，即为五个浓度梯度的没食子酸、绿原酸、胡黄连苷Ⅱ混合对照品。

将分别精密吸取上述五个浓度梯度的混合对照品各10μl，注入液相色谱仪，测定，峰面积与混合对照品含量进行线性回归，计算回归系数及回归方程的截距、斜率如下：

表6唐草片样品的没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ线性数据

实施例5

唐草片中没食子酸、绿原酸的含量测定：

(1)色谱条件与系统适应性：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.3％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。检测波长为293nm。理论塔板数按没食子酸峰计算不得低于5000。

(2)对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品、绿原酸对照品(购自中国生物制品检定所)适量，加甲醇制成每1ml分别含没食子酸0.05mg，绿原酸0.045mg的混合溶液，即得。

(3)供试品溶液的制备：取唐草片(为上海百岁行药业生产的市售产品)20片，精密称定，研细，取越0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率150W，频率60kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

(5)实验结果：每片唐草片中含没食子酸1.29mg，含绿原酸0.81mg。

实施例6

取唐草片样品2瓶(为上海百岁行药业生产的市售产品，以下文中的唐草片样品均是市售产品)按照下列标准进行全检。

1)显微鉴别：

取唐草片样品粉末0.01g，置显微镜下观察，体壁碎片淡黄色至黄色，有网状纹理及圆形毛窝；可见棕褐色刚毛。

2)薄层鉴别：

A、甘草鉴别：取唐草片样品10片，研细，加25ml水溶解，置水浴上加热回流提取30分钟，放冷，离心，取上清液，用25ml乙醚振摇提取1次，弃去乙醚液，再用25ml水饱和的正丁醇提取1次，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取甘草对照药材，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品1mg，加甲醇1ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液；或以适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。

B、糯稻根鉴别：取唐草片样品10片，研细，加乙酸乙酯10ml，超声处理提取30分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取糯稻根对照药材，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫 酸溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点及荧光斑点。

C、胡黄连鉴别：取唐草片样品10片，研细，加水使湿润，加甲醇25ml，加热回流提取15分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加25ml水饱和的正丁醇适量使溶解，用等量的正丁醇饱和的水洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取胡黄连苷-Ⅱ对照品1mg，加甲醇1ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)10℃以下放置后的下层溶液等适合的展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液显色。105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

D、老鹳草、石榴皮鉴别：取唐草片样品5片，研细，加溶媒50ml，置沸水浴加热提取，放冷，离心，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取老鹳草对照药材、石榴皮对照药材各0.5g，分别同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

E、柴胡鉴别：取唐草片样品10片，研细，加水25ml，置水浴上加热回流提取，放冷，离心，取上清液，用25ml乙醚振摇提取1次， 弃去乙醚液，再用25ml水饱和的正丁醇振摇提取1次，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤1-3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材0.5g同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-氯仿-甲醇(5：5：1)放置后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液的显色剂，显色，105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点及荧光主斑点。

F、银杏叶鉴别：取唐草片样品10片，研细，加50％丙酮100ml，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸去丙酮，水液用乙酸乙酯适量振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣用5％乙醇使溶解，通过聚酰胺柱(60H，内径1.5cm，长10cm)，用5％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至25ml，放冷，用乙酸乙酯振摇提取1次，蒸干，残渣用丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物5mg，加丙酮1ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各适量，分别点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(10：5：5：0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热约30分钟，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

G、黄芪鉴别：取黄芪甲苷对照品1mg，加甲醇1ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取对照品溶液和鉴别(E)项下的供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)展开剂，展开，取出，晾干， 喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液显色剂，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

H、白花蛇舌草鉴别：取唐草片样品5片，研细，加水25ml直接溶解，离心取上清液，滤液蒸干，残渣加水溶解；加入正丁醇25ml，萃取1次，收集溶剂层，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解作为供试品；另取白花蛇舌草对照药材适量，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从正丁醇起同供试品操作，制成对照药材溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10:2.5:4:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，氨蒸气中熏至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的主斑点。

I、诃子鉴别：取诃子对照药材1g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入正丁醇适量起同白花蛇舌草鉴别项下供试品操作，制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取对照药材溶液和上述(H)白花蛇舌草鉴别项下的供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇显色，在105℃加热至斑点清晰，取出置室温(25±2℃)冷却半小时，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点。

3)含量测定：

A、没食子酸、金银花的绿原酸、甘草的甘草苷、胡黄连的胡黄连 苷Ⅱ的含量测定：

取唐草片样品20片，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放至室温(25±2℃)，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液，没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ对照品(购自中国生物制品检定所)：精密称取没食子酸对照品、绿原酸对照品、甘草苷对照品、胡黄连苷Ⅱ对照品适量，加甲醇配制成每毫升分别含没食子酸0.05mg，绿原酸0.045mg，甘草苷0.02mg，胡黄连苷0.05mg的混合溶液，即得。

色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水-磷酸(6-17:94-83:0.3)梯度洗脱，检测波长为293nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定。每片唐草片含没食子酸1.2mg，含金银花以绿原酸计0.80mg，含甘草以甘草苷计0.3mg，含胡黄连以胡黄连苷Ⅱ计0.4mg。

B、金银花的木犀草苷含量测定：

木犀草苷：取唐草片样品5片，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理约1小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以木犀草苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈流动相A，以0.5％冰乙酸溶液流动相B，按0～30分钟，A：B→10：90，30～55分钟，A：B→30：70，进行梯度洗脱；检测波长为350nm。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。每片唐草片含金银花以木犀草苷计5μg。

C、黄芪的黄芪甲苷含量测定：

取唐草片样品5片，研细，取约3g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，为供试品溶液。以黄芪甲苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水(32：68)；检测器为蒸发光散射，精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算。每片唐草片含黄芪以黄芪甲苷计6μg。

D、红花的羟基红花黄色素A含量测定：

取唐草片样品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以羟基红花黄色素A对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26：2：72)，检测波长为403nm，精密吸取溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。每片唐草片含红花以红花黄色素A计0.08mg。

通过上述全检项目确证实验，说明本发明新增检测项目可以补充加入原检测方法，进一步提高药品的检测质量，有利于提高产品质量。 实施例7

取唐草片样品2瓶(为上海百岁行药业生产的市售产品，以下文中的唐草片样品均是市售产品)按照下列标准进行全检。

显微鉴别：

全蝎显微特征鉴别：取唐草片样品0.05g，置显微镜下观察，体壁碎片淡黄色至黄色，有网状纹理及圆形毛窝；有时可见棕褐色刚毛。

1)薄层鉴别：

A、甘草鉴别：取唐草片样品5片，研细，加50ml乙醇溶解，超声提取30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取3次，每次50ml，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇提取液，用等量的正丁醇饱和的水洗涤3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品2mg，加甲醇1ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

B、糯稻根鉴别：取唐草片样品5片，研细，加甲醇50ml，超声处理提取45分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取糯稻根对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用苯-氯仿-甲醇(5：5：1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛40％硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C、胡黄连鉴别：取唐草片样品5片，研细，加乙醇使湿润，加乙醇50ml，超声提取30分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加水饱和的正丁醇25ml使溶解，用等量的正丁醇饱和的水洗涤3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取胡黄连苷-Ⅱ对照品1mg，加甲醇2ml制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用甲苯-氯仿-甲醇(5：5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸溶液等显色剂，显色。105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

D、老鹳草、石榴皮鉴别：取唐草片样品10片，研细，加水100ml，超声提取30分钟，放冷，离心，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次40ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取老鹳草对照药材、石榴皮对照药材各2g，分别同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用苯-氯仿-甲醇-冰乙酸(5：5：2：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

E、柴胡鉴别：取唐草片样品10片，研细，加水50ml，超声提取30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙醚振摇提取3次，每次50ml，弃去乙醚液，再用等量的水饱和的正丁醇振摇提取3次，合并正丁醇 提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤3次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取柴胡对照药材同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸溶液等显色剂，显色，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

F、银杏叶鉴别：取唐草片样品10片，研细，加50％丙酮100ml，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸去丙酮，水液用乙酸乙酯50ml振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣用25％乙醇使溶解，通过聚酰胺柱(90H，内径1.5cm，长10cm)，用10％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至，放冷，用50ml乙酸乙酯振摇提取3次，蒸干，残渣用2ml丙酮使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物2g，加1ml丙酮适量制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5：3：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

G、黄芪鉴别：取黄芪甲苷对照品2mg，加1ml甲醇制成对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取对照品溶液和鉴别(E)项下的供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

H、白花蛇舌草的鉴别：取唐草片样品10片，研细，加乙醇50ml超声30分钟，滤液蒸干，残渣加50ml水溶解；加入50ml三氯甲烷，萃取2次，收集溶剂层，蒸干，残渣加1ml无水乙醇溶解作为供试品；另取白花蛇舌草对照药材5g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加入三氯甲烷起同供试品操作，制成对照药材溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5:10:3.5:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，氨蒸气中熏至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的主斑点。

I、诃子的鉴别：取诃子对照药材1g，加水20ml，加热回流1.5小时，过滤，滤液加水至50ml，从加三氯甲烷起同白花蛇舌草鉴别项下供试品操作，制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取对照药材溶液和上述(H)白花蛇舌草鉴别项下的供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-冰醋酸-水(15:5:0.5)下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇显色，在105℃加热至斑点清晰，取出置室温(25±2℃)冷却半小时，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点。

2)含量测定：

A、没食子酸、金银花的绿原酸、甘草的甘草苷、胡黄连的胡黄连苷含量测定：

取唐草片样品20片，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇100ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，取出，放至室温(25±2℃)，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，为供试品溶液，没食子酸、绿原酸、甘草苷、胡黄连苷Ⅱ对照品(购自中国生物制品检定所)：精密称取没食子酸对照品、绿原酸对照品、甘草苷对照品、胡黄连苷Ⅱ对照品适量，加甲醇配制成每毫升分别含没食子酸0.1mg，绿原酸0.09mg，甘草苷0.04mg，胡黄连苷0.1mg的混合溶液，即得。

色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水-磷酸(6-17:94-83:0.3)梯度洗脱，检测波长为275nm，精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定。每片唐草片含没食子酸1.2mg，含金银花以绿原酸计0.8mg，含甘草以甘草苷计0.3mg，含胡黄连以胡黄连苷Ⅱ计0.4mg。

B、金银花的木犀草苷含量测定：

木犀草苷：取唐草片样品10片，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，超声处理约1小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以木犀草苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈流动相A，以0.5％冰乙酸溶液流动相B，按0～30分钟，A：B→10：90，30～55分钟，A：B→30：70，进行梯度洗脱；检测波长为350nm。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。检测结果：每片唐草片含金银花以木犀草苷计7μg。

C、黄芪的黄芪甲苷含量测定：

取唐草片样品10片，研细，取约3g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40ml，水浴蒸干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，为供试品溶液。以黄芪甲苷对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水(32：68)；检测器为蒸发光散射，精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算。检测结果：每片唐草片含黄芪以黄芪甲苷计5μg。

D、红花的羟基红花黄色素A含量测定：

取唐草片样品10片，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。以羟基红花黄色素A对照品，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26：2：72)，检测波长为403nm，精密吸取溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。检测结果每片唐草片含红花以羟基红花黄色素A计0.07mg。

通过上述全检项目确证实验，说明本发明新增检测项目可以补充加入原检测方法，进一步提高药品的检测质量，有利于提高产品质量。