本发明涉及一种蛋白含量的测定方法，具体说是一种将二喹啉甲酸用于海藻酸盐材料中蛋白含量的定量检测方法。
背景技术：
海藻酸盐材料因其良好的生物相容性，作为组织再生的生物材料显示出广阔的应用前景。但海藻酸盐材料中杂质蛋白将严重影响其在应用过程中的生物相容性。作为组织工程的原材料产品，其产品中的杂蛋白成分将被严格限制。目前，国家相关标准中针对蛋白的定量表征方法均采用考马斯亮蓝法。但，该方法在测试过程中，需要在酸性环境下进行，而海藻酸盐材料在pH酸性环境下形成凝胶态，无法形成均匀溶液，使得常规考马斯亮蓝检测蛋白的方法无法应用到海藻酸盐材料杂蛋白的检测中。
技术实现要素：
针对常规考马斯亮蓝检测蛋白的方法无法应用到海藻酸盐材料杂蛋白的检测中的缺陷，本发明提出，将可在碱性条件下测定蛋白含量的方法用于海藻酸盐材料中杂质蛋白含量的检测。
本发明提出的具体技术方案如下：
(1)用生理盐水配制成100.0μg/ml的蛋白质标准液。
(2)将步骤(1)配制的标准液用生理盐水依此稀释成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。
(3)配制二喹啉甲酸试剂及其工作液：
试剂A：分别称取10.0g BCA(二喹啉甲酸)(1％)，20.0g Na2CO3·H2O(2％)，1.6g酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO3(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
试剂B：精确称取2.0g CuSO4·5H2O(4％)，蒸馏水定容至50mL。
取50体积份试剂A与1体积份试剂B混合均匀，即配制成绿色的工作液。
(4)向步骤(2)获得的梯度蛋白质标准液中加入二喹啉甲酸工作液，二者质量比为1:5-1:50均匀混合，40-70℃水浴中反应10-60分钟，不含蛋白质标准液的生理盐水为对照组，测定各组在562nm处的吸光度值，绘制蛋白含量-吸光度标准曲线。
(5)生理盐水配制海藻酸盐样品溶液(1-20mg/ml)。
(6)向步骤(5)配制的海藻酸盐溶液中加入二喹啉甲酸工作液，二者质量比为1:5-1:50均匀混合，40-70℃水浴中反应10-60分钟，生理盐水为对照组，测定对照组与海藻酸盐样品组在562nm处的吸光度值，根据步骤(4)获得的蛋白含量-吸光度标准曲线，计算海藻酸盐溶液中的蛋白含量，根据海藻酸盐溶液浓度计算海藻酸盐材料样品中的蛋白含量。
(7)也可将海藻酸钠样品直接溶解在二喹啉甲酸工作液中，海藻酸盐样品的配制浓度在10μg/ml-10mg/ml，40-70℃水浴中反应10-60分钟，在562nm处测定吸光度值，根据步骤(4)获得的蛋白含量-吸光度标准曲线，计算海藻酸盐溶液中的蛋白含量。
本发明提出的测定海藻酸盐材料中蛋白含量的定量检测方法，适合测定分子量在10-500kDa的海藻酸盐材料。
本发明提出的测定海藻酸盐材料中蛋白含量的定量检测方法，适合测定海藻酸的钠盐或钾盐。
具体实施方式
实施例1：
(1)配制二喹啉甲酸试剂及其工作液：
试剂A：分别称取10.0g BCA(1％)，20.0g Na2CO3·H2O(2％)，1.6g酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO3(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
试剂B：精确称取2.0g CuSO4·5H2O(4％)，蒸馏水定容至50mL。
取50体积份试剂A与1体积份试剂B混合均匀，即配制成绿色的工作液。
(2)绘制蛋白含量-吸光度标准曲线：
配制梯度蛋白标准液：用生理盐水配制成100.0μg/ml的牛血清白蛋白标 准液，用生理盐水依此稀释成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。向梯度蛋白质标准液中加入二喹啉甲酸工作液，二者质量比为1:10均匀混合，60℃水浴中反应30分钟，不含蛋白质标准液的生理盐水为对照组，测定各组在562nm处的吸光度值，绘制蛋白含量-吸光度标准曲线。
(3)测定待测海藻酸钠样品中的蛋白含量：取海藻酸钠样品，用生理盐水配制成5mg/ml的海藻酸钠溶液，向海藻酸钠溶液中加入二喹啉甲酸工作液，二者质量比为1:10均匀混合，60℃水浴中反应30分钟，生理盐水为对照组，测定两组在562nm处的吸光度值，根据蛋白含量-吸光度标准曲线，求得海藻酸钠溶液中蛋白含量为45.0μg/ml。根据海藻酸钠溶液浓度，计算得待测海藻酸钠样品中蛋白含量为0.9％(质量分数)。
实施例2：
(1)配制二喹啉甲酸试剂及其工作液：
试剂A：分别称取10.0g BCA(1％)，20.0g Na2CO3·H2O(2％)，1.6g酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO3(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
试剂B：精确称取2.0g CuSO4·5H2O(4％)，蒸馏水定容至50mL。
取50体积份试剂A与1体积份试剂B混合均匀，即配制成绿色的工作液。
(2)绘制蛋白含量-吸光度标准曲线：
配制梯度蛋白标准液：用生理盐水配制成100.0μg/ml的牛血清白蛋白标准液，用生理盐水依此稀释成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。向梯度蛋白质标准液中加入二喹啉甲酸工作液，二者质量比为1:10均匀混合，60℃水浴中反应30分钟，不含蛋白质标准液的生理盐水为对照组，测定各组在562nm处的吸光度值，绘制蛋白含量-吸光度标准曲线。
(3)测定待测海藻酸钾样品中的蛋白含量：取海藻酸钾样品，用二喹啉甲酸工作液配制成1mg/ml的海藻酸钾溶液，60℃水浴中反应30分钟，测定在562nm处的吸光度值，根据蛋白含量-吸光度标准曲线，求得海藻酸钾溶液 中蛋白含量为28.0μg/ml。根据海藻酸钾溶液浓度，计算得待测海藻酸钾样品中蛋白含量为0.28％(质量分数)。