技术领域本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测方法。
背景技术：
蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半胱氨酸，蛋白质对空气中的氧较为敏感，容易发生结构的转变，形成一系列聚合物。钙调蛋白磷酸酶B亚基(CNB)是钙调蛋白磷酸酶Calcineurin，(CN)的调节亚基。CN是目前所知唯一一种依赖Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，它具有比较窄的底物专一性。于上世纪70年代末、80年代初由加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并从牛脑中提纯。该酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，相对分子质量61×103；B亚基(CNB)是调节亚基，相对分子质量19×103。RhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有两个巯基结构的蛋白，在生产、放置等过程中，易受温度、水分、pH值、光照、氧化等因素影响形成二聚体、三聚体等多聚体结构，造成各组分比例不稳定，无法准确测定其量。其纯化工艺中又需要用到缓冲盐、络合剂、金属离子、氧化还原性物质等等对蛋白测定有干扰的物质。目前采用细胞培养的体外抑瘤试验等方法往往无法取得理想的线性范围，结果重现性差，无法完成方法学验证。因此，提供一种rhCNB的生物学活性的测定用组合试剂、试剂盒及测定方法具有重要的现实意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测方法。本方法具有较强的专属性，经试验证明，本法检测结果重复性好，能实现对rhCNB产品的有效质量控制。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了rhCNA或其突变体或剪切体在制备检测rhCNB活性的试剂中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述应用中所述的rhCNA或其突变体或剪切体为rhCNA或其突变体rhCNAΔ316、rhCNAΔY311、rhCNAΔD313、rhCNAΔV314、rhCNAΔY311，或其剪切体rhCNA420(1-420)、rhCNA388(1-388)、rhCNA347(1-347)。本发明还提供了一种组合试剂，包括rhCNA或其突变体或剪切体。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述的rhCNA或其突变体或剪切体为rhCNA或其突变体rhCNAΔ316、rhCNAΔY311、rhCNAΔD313、rhCNAΔV314、rhCNAΔY31，或其剪切体rhCNA420(1-420)、rhCNA388(1-388)、rhCNA347(1-347)。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中还包括反应底物。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述反应底物为pNPP。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂还包括还原剂、rhCNB对照品、缓冲液、BSA、MnCl2或CaCl2中的一种或两者以上的混合物。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂包括底物溶液、还原剂、rhCNA或其突变体或剪切体、rhCNB对照品。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述反应底物包括pNPP：0.005～0.08mol/L、BSA:0.2mg/ml、Tris-HCl(pH7.4):0.05mol/L、MnCl2:0.001mol/L和CaCl2:0.001mol/L。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述还原剂可以为DTT，所述DTT溶液的浓度为1mol/L。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述rhCNA或其突变体或剪切体为已测定比活性的rhCNA或其突变体或剪切体。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中所述rhCNB对照品为已测定比活性的rhCNB对照品。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中rhCNB供试品或rhCNB对照品的浓度为0.49μg/ml～1000μg/ml。在本发明的另一些具体实施方案中，所述组合试剂中rhCNA或其突变体或剪切体溶液的配制浓度范围：18～28U/ml。本发明还提供了所述组合试剂在制备rhCNB活性的检测工具中的应用。本发明还提供了一种检测rhCNB活性的试剂盒，包括所述的组合物试剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括底物溶液、还原剂溶液、rhCNA或其突变体或剪切体、rhCNB对照品。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述反应底物包括pNPP：0.005～0.08mol/L、BSA:0.2mg/ml、Tris-HCl(pH7.4):0.05mol/L、MnCl2:0.001mol/L和CaCl2:0.001mol/L。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述还原剂溶液可以为DTT，所述DTT溶液的浓度为1mol/L。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述rhCNA或其突变体或剪切体为已测定比活性的rhCNA或其突变体或剪切体。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述rhCNB对照品为已测定比活性的rhCNB对照品。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中rhCNB供试品或rhCNB对照品的浓度为0.49μg/ml～1000μg/ml。在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒中rhCNA或其突变体或剪切体溶液的配制浓度范围：18～28U/ml。具体的，本发明提供的试剂盒组成见表1：表1试剂盒组成本发明还提供了一种测定rhCNB活性的方法，采用所述组合物试剂或所述试剂盒对rhCNB的活性进行测定。具体的，本发明提供的测定rhCNB活性的方法，采用pNPP等钙调蛋白磷酸酶反应底物为底物，利用rhCNB对rhCNA或其突变体或剪切体这一蛋白磷酸酶的激活作用，使反应底物显色，通过紫外-可见分光光度比色法检测底物的吸光度，用酶标仪进行连续检测，分别对对照组及供试品组进行酶动力学分析(EnzymeKinetic)：采用Michaelis-Mentenfit及4-Parameterfit对原始数据进行分析和曲线拟合，分别获得标准品和供试品的S形曲线，获得供试品组rhCNB的生物学活性。具体的，所述S形曲线的拟合度(R2)值应不低于0.98。具体的，所述供试品的生物学活性(比活性)按下式计算：式中：Pt为标准品的生物学活性(U/mg)Es为供试品rhCNB相当于对照品rhCNB半效量的稀释倍数。Er为标准品rhCNB半效量的稀释倍数。EC50s为供试品rhCNB相当于对照品rhCNB半效量时的浓度。EC50r为对照品rhCNB的半效浓度。本发明采用pNPP)为反应底物，利用rhCNB对rhCNA或其突变体或剪切体这一蛋白磷酸酶的特异激活作用，使反应底物显色，通过紫外-可见分光光度比色法检测底物溶液的吸光度，换算为rhCNB的生物学活性。由于rhCNB对于rhCNA或其突变体或剪切体的激活作用具有严格的专一性，而本法正是利用这一特性建立，因此本法具有较强的专属性，经试验证明，本法检测结果重复性好(见实例5)，能实现对rhCNB产品的有效质量控制。为方便检测，将其做成试剂盒，更凸显本发明的创新性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例2的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图2示实施例2的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图3示实施例3的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图4示实施例3的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图5示实施例4中结果1的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图6示实施例4中结果1的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图7示实施例4中结果2的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图8示实施例4中结果2的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图9示实施例4中结果3的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图10示实施例4中结果3的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图11示实施例5的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图12示实施例5的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图13示实施例6的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图14示实施例6的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图15示实施例7的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图16示实施例7的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图17示实施例8的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图18示实施例8的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图19示实施例9的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图20示实施例9的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图21示实施例10的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图22示实施例10的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图23示实施例11的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图24示实施例11的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图25示实施例12的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图26示实施例12的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图27示实施例13中序号4结果的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图28示实施例13中序号4结果的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)；图29示实施例13中序号5结果的rhCNB对照品及供试品的SignalCurvel图；图30示实施例13中序号5结果的S型曲线及软件分析结果数据(其中：GroupA为对照品rhCNB，GroupB为供试品rhCNB)。具体实施方式本发明公开了一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明在研究rhCNB项目生物学活性测定的过程中，最先是采用细胞培养的体外抑瘤试验等方法测定生物学活性，该法存在的主要问题是：无法得到理想的线性范围，试验结果重现性差，无法完成方法学验证。为此，发明者通过大量的实验摸索研究，采用pNPP为反应底物，利用rhCNB对rhCNA或其突变体或剪切体这一蛋白磷酸酶的激活作用，使反应底物pNPP在410nm处显色，通过紫外-可见分光光度比色法检测pNPP的吸光度，用酶标仪进行连续检测，分别对对照组及供试品组进行酶动力学分析(EnzymeKinetic)：采用Michaelis-Mentenfit及4-Parameterfit对原始数据(OD410值)进行分析和曲线拟合，分别获得标准品和供试品的S形曲线，S形曲线的拟合度(R2)值应不低于0.98。供试品的生物学活性(比活性)按下式计算：式中：Pt为标准品的生物学活性(U/mg)Es为供试品rhCNB相当于对照品rhCNB半效量的稀释倍数。Er为标准品rhCNB半效量的稀释倍数。EC50s为供试品rhCNB相当于对照品rhCNB半效量时的浓度。EC50r为对照品rhCNB的半效浓度。为方便样品送检，本发明制备了一种rhCNB激活rhCNA的试剂盒，暂命名为rhCNB活性检测试剂盒，试剂盒的组成(10次检测/盒)见表2：表2rhCNB活性检测试剂盒组成(10次检测/盒)其中，rhCNB供试品、rhCNB对照品的系列浓度配制范围：0.49μg/ml～1000μg/ml。rhCNA或其突变体或剪切体溶液的配制浓度范围：18～28U/ml。采用该rhCNB活性检测试剂盒检测rhCNB生物学活性的具体方法如下：①试液准备：供试品溶液的制备：称取供试品适量，加水定量稀释制得蛋白质含量为2mg/ml的溶液，对该溶液以2倍稀释连续做12个稀释度，制得蛋白质含量分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml、3.91μg/ml、1.95μg/ml、0.98μg/ml、0.49μg/ml的系列供试品溶液。对照品溶液的准备：取重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基对照品1瓶(试剂盒4号瓶)，4℃冰箱中放置使溶融，精密称取适量，同上法制备成12个稀释度的系列对照品溶液。底物液准备：取底物液1瓶(试剂盒1号瓶)，放置4℃冰箱中使融溶，加入DTT溶液(试剂盒2号管)10μl使终浓度为0.001mol/L，混匀，备用。②测定法：在96孔酶标板上每孔加入20μl上述稀释好的系列对照品及供试品溶液，每个浓度梯度加2个平行样。最终各孔中钙调蛋白磷酸酶B亚基终浓度如下表3：表3各孔中对照品及供试品溶液终浓度梯度排布表酶溶液的制备：取已测定比活性的rhCNA或其突变体或剪切体1瓶，置冰水中，加测活液定量稀释制成约18～28U/ml的溶液。酶溶液的加样及检测：各孔中依次加入180μl上述稀释好的酶溶液，并立即放入提前预热到30℃的酶标仪进行循环连续检测，检测波长410nm，每5分钟1个检测循环，检测25个循环以上。曲线拟合：分别对对照组及供试品组进行酶动力学分析(EnzymeKinetic)：采用Michaelis-Mentenfit及4-Parameterfit对原始数据(OD410值)进行分析和曲线拟合，分别获得标准品和供试品的S形曲线，S形曲线的拟合度(R2)值应不低于0.98。供试品的生物学活性(比活性)按下式计算：式中：Pt为标准品的生物学活性(U/mg)Es为供试品CNB相当于标准品CNB半效量的稀释倍数。Er为标准品CNB半效量的稀释倍数。EC50s为供试品CNB相当于标准品CNB半效量时的浓度。EC50r为标准品CNB的半效浓度。本发明提供的一种组合试剂及其应用、含有该组合试剂的试剂盒及检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1本发明制备了一种rhCNB激活rhCNA的试剂盒，暂命名为rhCNB活性检测试剂盒，试剂盒的组成(10次检测/盒)见表4：表4rhCNB活性检测试剂盒组成(10次检测/盒)其中，rhCNB供试品、rhCNB对照品的系列浓度配制范围：0.49μg/ml～1000μg/ml。rhCNA或其突变体或剪切体溶液的配制浓度范围：18～28U/ml。采用该rhCNB活性检测试剂盒检测rhCNB生物学活性的具体方法如下：①试液准备：供试品溶液的制备：称取供试品适量，加水定量稀释制得蛋白质含量为2mg/ml的溶液，对该溶液以2倍稀释连续做12个稀释度，制得蛋白质含量分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml、3.91μg/ml、1.95μg/ml、0.98μg/ml、0.49μg/ml的系列供试品溶液。对照品溶液的准备：取重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基对照品1瓶(试剂盒4号瓶)，4℃冰箱中放置使溶融，精密称取适量，同上法制备成12个稀释度的系列对照品溶液。底物液准备：取底物液1瓶(试剂盒1号瓶)，放置4℃冰箱中使融溶，加入DTT溶液(试剂盒2号管)10μl使终浓度为0.001mol/L，混匀，备用。②测定法：在96孔酶标板上每孔加入20μl上述稀释好的系列对照品及供试品溶液，每个浓度梯度加2个平行样。最终各孔中钙调蛋白磷酸酶B亚基终浓度如下表5：表5各孔中对照品及供试品溶液终浓度梯度排布表酶溶液的制备：取已测定比活性的rhCNA或其突变体或剪切体1瓶，置冰水中，加测活液定量稀释制成约18～28U/ml的溶液。酶溶液的加样及检测：各孔中依次加入180μl上述稀释好的酶溶液，并立即放入提前预热到30℃的酶标仪进行循环连续检测，检测波长410nm，每5分钟1个检测循环，检测25个循环以上。曲线拟合：分别对对照组及供试品组进行酶动力学分析(EnzymeKinetic)：采用Michaelis-Mentenfit及4-Parameterfit对原始数据(OD410值)进行分析和曲线拟合，分别获得标准品和供试品的S形曲线，S形曲线的拟合度(R2)值应不低于0.98。供试品的生物学活性(比活性)按下式计算：式中：Pt为标准品的生物学活性(U/mg)Es为供试品CNB相当于标准品CNB半效量的稀释倍数。Er为标准品CNB半效量的稀释倍数。EC50s为供试品CNB相当于标准品CNB半效量时的浓度。EC50r为标准品CNB的半效浓度。实施例2使用实施例1试剂数据范围下限值(使用rhCNAΔ316突变体，配制浓度为18U/ml；pNPP浓度为0.005mol/L)，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果(图谱见图1、图2)(注：对照品比活性4673U/mg)。实施例3使用实施例1试剂数据范围上限值(使用rhCNAΔ316突变体，配制浓度为28U/ml；pNPP浓度为0.08mol/L)，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果(图谱见图3、图4)(注：对照品比活性4673U/mg)。实施例4使用实施例1试剂数据范围中间值，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：结果1(使用rhCNAΔ316突变体，配制浓度为23U/ml；pNPP浓度为0.0375mol/L)：(图谱见图5、图6)结果2(使用rhCNAΔ316突变体，配制浓度为23U/ml；pNPP浓度为0.0375mol/L)：(图谱见图7、图8)结果3(使用rhCNAΔ316突变体，配制浓度为23U/ml；pNPP浓度为0.0375mol/L)：(图谱见图9、图10)实施例5使用实施例1试剂数据范围中间值，使用rhCNA，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图11、图12)实施例6使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNA420(1-420)剪切体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图13、图14)。实施例7使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNA388(1-388)剪切体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图15、图16)。实施例8使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNA347(1-347)剪切体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图17、图18)。实施例9使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNAΔY311突变体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图19、图20)。实施例10使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNAΔY313突变体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图21、图22)。实施例11使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNAΔY314突变体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图23、图24)。实施例12使用实施例1试剂数据范围中间值，rhCNAΔY315突变体，按照实施例1中的方法进行测定的试验结果：(图谱见图25、图26)。实施例13采用本发明实施例1提供的试剂盒和检测方法检测同一批rhCNB供试品5次，结果见表6。(注：序号1结果对应图5和图6，序号2结果对应图7和图8，序号3结果对应图9和图10，序号4结果对应图27和图28，序号5结果对应图29和图30)。表6重复性实验结果表明，本法重复性良好，RSD为4.4％以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。