基于RGMa片段的诊断测定的制作方法

发明领域

本发明涉及用于检测和测定样品中rgma片段的测定法，以及该测定法用于确定、优化、预测和监测患有神经变性疾病的主体中的治疗的用途。

背景

多发性硬化(ms)是一种中枢神经系统的慢性炎性疾病。当前可用的伴有钆应用的mri技术显现在疾病过程期间发生的多种病变并用作生物标志物。然而，脑脊液(csf)和蛋白的研究可进一步理解疾病进展、慢性炎症和对治疗(诸如鞘内延迟释放类固醇应用)的反应之间的相互作用。

轴突再生的过程改善多发性硬化的临床结果。已知在髓磷脂和神经胶质结构中存在几种再生抑制剂，即髓磷脂相关糖蛋白；nogoa、omgp(少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白)。另一种抑制剂为排斥导向分子a(rgma)，其还阻碍神经元再生和功能恢复。rgma是一种糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定糖蛋白，其为神经突生长的有效抑制剂且作为在cns创伤或炎症后抑制神经元再生和功能恢复的重要因子出现。rgma以膜结合和可溶形式存在，其对于神经突生长均为抑制性的。rgma已定位于患有创伤性脑损伤或缺血性中风的人中的cns髓磷脂、新鲜病变以及成熟疤痕组织中。

存在于脑和脊髓中的rgma和其片段可促进神经变性且抑制神经再生。rgma影响神经纤维的再生以及神经元的变性。使用基于elisa的测定法检测rgma种类，以鉴定再生活性的抑制。然而，这些测定法缺乏区分具有不同大小的rgma片段的能力且通常不显示检测不同rgma片段所需的高灵敏度水平。此外，基于elisa的测定法因为体液中的蛋白量低而不能检测到rgma。需要一种具有较高灵敏度且可检测和区分rgma片段以及将rgma片段与患有ms或任何其他神经变性疾病的患者中的增强的功能恢复和再生相关联的诊断测定法。

发明概述

本发明涉及检测和定量样品中至少一种rgma片段的方法。该方法包括(a)从主体获得包含至少一种rgma片段的样品；(b)将该样品与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白结合至少一种rgma片段以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；(c)将该样品与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物，以及(d)检测和定量样品中至少一种rgma片段。至少一种rgma片段可以是具有约1kda至约65kda的大小的rgma片段。该rgma片段可具有10kda、18kda、20kda、30kda、40kda、50kda或65kda的大小。rgma片段可选自18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段。在步骤(b)前，可利用凝胶电泳分离至少一种rgma片段。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。至少一种rgma片段可以是可溶性rgma片段。该rgma片段的大小可通过sds-page测定。sdspage可以是4-15%。捕获结合蛋白可以是rgma-选择性抗体。该抗体可以是生物素化rgma-选择性抗体。检测结合蛋白可以是四价抗生物素蛋白且可检测标记可以是生物素化辣根过氧化物酶。可使用过氧化物酶染色试剂盒检测至少一种rgma片段。该rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及检测和定量样品中至少一种rgma片段的方法。该方法包括(a)从主体获得包含至少一种rgma片段的样品；(b)将该样品与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白结合至少一种rgma片段以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；(c)将该样品与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物，以及(d)检测和定量样品中的至少一种rgma片段。至少一种rgma片段可以是具有约1kda至约65kda的大小的rgma片段。该rgma片段可具有10kda、18kda、20kda、30kda、40kda、50kda或65kda的大小。rgma片段可选自18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段。在步骤(b)前，可使用凝胶电泳分离至少一种rgma片段。该方法进一步包括在步骤(b)前将至少一种rgma片段固定于膜上以产生western印迹膜；在步骤(b)中，将western印迹膜与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白与固定于western印迹膜的至少一种rgma片段结合，形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；以及在步骤(c)中，将western印迹膜与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。至少一种rgma片段可以是可溶性rgma片段。可通过sds-page测定rgma片段的大小。sdspage可以是4-15%。膜可以是硝酸纤维素膜。捕获结合蛋白可以是rgma-选择性抗体。该抗体可以是生物素化rgma-选择性抗体。检测结合蛋白可以是四价抗生物素蛋白且可检测标记可以是生物素化辣根过氧化物酶。可使用过氧化物酶染色试剂盒检测至少一种rgma片段。该rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及检测和定量样品中至少一种rgma片段的方法。该方法包括(a)从主体获得包含至少一种rgma片段的样品；(b)将该样品与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白结合至少一种rgma片段以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；(c)将该样品与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物，以及(d)检测和定量样品中的至少一种rgma片段。至少一种rgma片段可以是具有约1kda至约65kda的大小的rgma片段。该rgma片段可具有10kda、18kda、20kda、30kda、40kda、50kda或65kda的大小。rgma片段可选自18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段。在步骤(b)前，可使用凝胶电泳分离至少一种rgma片段。该方法进一步包括在步骤(b)前将至少一种rgma片段固定于膜上以产生western印迹膜；在步骤(b)中，将western印迹膜与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白与固定于western印迹膜的至少一种rgma片段结合，形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；以及在步骤(c)中，将western印迹膜与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。至少一种rgma片段可以是可溶性rgma片段。该方法进一步包括在步骤(b)中，在凝胶上同时分离rgma蛋白标准物与样品中的蛋白；以及(g)将至少一种rgma片段与分离的rgma蛋白标准物比较以定量片段。rgma蛋白标准物可以是重组rgma片段梯度。梯度可包含10、25、50、100和200pg/ml的rgma蛋白标准物。该rgma片段的大小可通过sds-page测定。sdspage可以是4-15%。膜可以是硝酸纤维素膜。捕获结合蛋白可以是rgma-选择性抗体。该抗体可以是生物素化rgma-选择性抗体。检测结合蛋白可以是四价抗生物素蛋白且可检测标记可以是生物素化辣根过氧化物酶。可利用过氧化物酶染色试剂盒检测至少一种rgma片段。该rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及确定有需要的主体中的神经变性疾病的治疗有效性的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的样品中至少一种rgma片段的水平，以及(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平提高，则该治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是无效的，以及其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平相同或降低，则该治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是有效的。至少一种rgma片段的对照水平可以是患有神经变性疾病、但没有对神经变性疾病进行治疗的主体的至少一种rgma片段的水平。治疗可包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。治疗可包含曲安奈德(triamcinoloneacetonide,tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德(fingolimod))、拉喹莫德(laquinimod)、β-干扰素、克帕松(copaxone)、达利珠单抗(daclizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)中的至少一种或其组合。治疗可包含曲安奈德(tca)。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病(parkinson'sdisease)、阿尔兹海默氏病(alzheimer'sdisease)、泰-萨二氏病(tay-sachsdisease)、尼曼-匹克病(niemann-pickdisease)、高歇氏病(gaucher'sdisease)、赫尔勒氏综合征(hurler'ssyndrome)、亨廷顿氏病(huntington'sdisease)、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病(devic'sdisease)、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及确定用于有需要的主体中的神经变性疾病的治疗的有效性的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的样品中至少一种rgma片段的水平，以及(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平提高，则该治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是无效的，以及其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平相同或降低，则该治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是有效的。该方法进一步包括继续向有需要的主体施用被确定为在治疗神经变性疾病中有效的治疗。至少一种rgma片段的对照水平可以是患有神经变性疾病、但没有对神经变性疾病进行治疗的主体的至少一种rgma片段的水平。治疗可包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。治疗可包含曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、β-干扰素、克帕松、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗中的至少一种或其组合。治疗可包含曲安奈德(tca)。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及预测患有神经变性疾病的主体对治疗的反应性的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的样品中至少一种rgma片段的水平，(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，以及(c)如果与对照水平相比，样品中至少一种rgma片段的水平降低，则可提供预测主体对治疗的反应性。治疗可包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。治疗可包含曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、β-干扰素、克帕松、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗中的至少一种或其组合。治疗可包含曲安奈德(tca)。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及预测患有神经变性疾病的主体对治疗的反应性的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的样品中至少一种rgma片段的水平，(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，以及(c)如果与对照水平相比，样品中至少一种rgma片段的水平降低，则可提供预测主体对治疗的反应性。该方法进一步包括向预测对治疗有反应的主体施用治疗。治疗可包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。治疗可包含曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、β-干扰素、克帕松、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗中的至少一种或其组合。治疗可包含曲安奈德(tca)。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及治疗患有神经变性疾病的主体的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的样品中至少一种rgma片段的水平，(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，以及(c)如果与对照水平相比，片段的水平提高，则向该主体施用治疗方案。治疗可包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。治疗可包含曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、β-干扰素、克帕松、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗中的至少一种或其组合。治疗可包含曲安奈德(tca)。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及优化用于患有神经变性疾病的主体中的治疗方案的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至20中任一项的方法确定该主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平，其中该第一样品在该主体已开始治疗方案的时段之前或期间的时间点从主体获得；(b)在比步骤(a)晚的时间，确定该主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平降低表明治疗方案针对神经变性疾病具有疗效；(c)使用权利要求1的方法确定该主体的第一样品中至少一种rgma片段的水平，(d)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较；以及(e)如果与对照水平相比，样品中至少一种rgma片段的水平降低，则提供预测该主体对治疗的反应性。该治疗方案可以是神经修复治疗方案。神经修复治疗方案的成功率可增加。该治疗方案可以是神经保护治疗方案。神经保护治疗方案的成功率可增加。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定该主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平，其中该第一样品在该主体已开始药物治疗的时段之前或期间的时间点从主体获得；(b)在比步骤(a)晚的时间，确定该主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平降低表明药物治疗方案针对神经变性疾病具有疗效，以及与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平提高表明药物治疗方案针对神经变性疾病不具有疗效；以及(c)如果药物治疗方案针对神经变性疾病不具有疗效，则向该主体施用不同的药物治疗。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

本发明涉及筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物的方法。该方法包括(a)使用权利要求1至21中任一项的方法确定包含细胞的样品中至少一种rgma片段的第一水平；(b)将该样品与化合物接触，(c)在比步骤(b)晚的时间，确定该主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平降低表明化合物针对神经变性疾病具有疗效，以及其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平提高表明化合物针对神经变性疾病不具有疗效；以及(d)选择被鉴定为具有疗效的化合物。可检测至少两种rgma片段。至少两种rgma片段的大小可以是30kda和40kda。可检测至少三种rgma片段。该至少三种rgma片段的大小可以是18kda、30kda和40kda。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化。rgma片段可以是人rgma片段。方法样品可包含脑脊液、血液、血清或血浆。

附图简述

图1显示rgma通过前蛋白转化酶ski-1和弗林蛋白酶(furin)的切割，产生18、30和40kda的片段(a、b、c、实线箭头)。

图2显示进行性ms患者的csf中存在的rgma片段。

图3a、b、c显示具有改善的edss(图3a)、步行距离(图3b)和步行速度(图3c)的在tca治疗期间具有立即反应的17名患者的临床数据。所有数据作为平均值±sem(平均值的标准误差)给出；*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001；*=事后分析的p-值的显著性水平；i=第一次tca施用前的基线，ii，第二次tca施用前，iii=第三次tca施用前，iv=第四次tca施用前，v=第五次tca施用前；vi=第六次tca施用前。

图4a、b、c显示具有未改善的edss(图4a)、步行距离(图4b)和步行速度(图4c)的对于重复施用tca没有立即反应的8名患者的临床数据。所有数据以平均值±sem(平均值的标准误差)给出；i=第一次tca施用前的基线，ii=第二次tca施用前，iii=第三次tca施用前，iv=第四次tca施用前，v=第五次tca施用前。

图5a、b、c显示对tca治疗的立即反应者的脑脊液中rgma浓度(40kda(图5a)；30kda(图5b))和蛋白浓度(图5c)的变化。所有数据以平均值±sem给出；*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001；*=事后分析的p-值的显著性水平；i=第一次tca施用前的基线；ii，第二次tca施用前；iii，第三次tca施用前；iv，第四次tca施用前。

图6显示从对tca施用具有立即反应的17名患者中得到的rgmacsf水平的三个代表性western印迹与光密度分析(densitometricanalysis)的柱状图。

图7a、b、c显示对tca治疗没有立即反应的ms患者的脑脊液中rgma浓度(40kda(图7a)；30kda(图7b))和蛋白浓度(图7c)。所有数据以平均值±sem给出；*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001；*=事后分析的p-值的显著性水平；i=第一次tca施用前的基线；ii=第二次tca施用前；iii=第三次tca施用前；iv=第四次tca施用前。

图8显示从不对tca施用具有立即反应的8名患者中得到的rgmacsf水平的三个代表性western印迹与光密度分析的柱状图。

详述

本发明涉及用于分析rgma片段的水平，以及确定、优化、预测和监测用于有需要的主体中的神经变性疾病的治疗方案的测定法。基于rgma片段的诊断测定可用于检测具有特定大小的具体rgma片段。内源性和重组rgma片段的免疫检测可用于确定、优化、预测和监测患有神经变性疾病或显示其症状的主体中的治疗。基于rgma片段的诊断测定使用最少量定量测量人体液如csf、血液、血清和血浆中存在的可溶性再生-抑制性rgma片段的浓度。该诊断测定提供更高灵敏度(检测人材料中的低皮克(pg)量的rgma)且（与rgma蛋白标准物组合）为一种鉴定患有神经变性疾病诸如多发性硬化的患者的体液中rgma浓度的定量工具。此外，该测定区别rgma的不同片段，且允许监测在疾病进展期间这些片段的模式转变(patternshifts)。因此，因为该方法提供用于神经修复药物试验中的患者分层的方法；追踪可对促进再生药物做出阳性反应的患者的方法；鉴定此类试验中的未反应者的方法；优化神经修复治疗策略的方式；以及提高神经修复药物方法的成功率的方法，所以其优于仅研究整个rgm蛋白的当前技术。

本章节和本文整个公开内容中所用的章节标题仅仅为了组织目的且无意限制。

1.定义

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。在矛盾的情况下，以本文(包括定义)为主。以下描述优选的方法和材料，尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献以其整体通过引用并入。本文公开的材料、方法和实例仅说明而无意限制。

如本文所用，单数形式“一”和“该”包括多个指示物，除非上下文另外明确指出。为了记载本文的数值范围，明确地涵盖具有相同精确度的其间每个中间值。例如，对于范围6-9，除了6和9，涵盖数值7和8，以及对于范围6.0-7.0，明确地涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

“或”的使用意指“和/或”，除非另外指出。并且，术语“包括(including)”和“具有(having)”，以及那些术语的其他形式诸如“包括(includes)”、包括(included)”、“具有(has)”和“具有(have)”的使用且无限制性。

如说明书和权利要求中所用，以下术语具有以下含义：

如本文所用，术语“对照主体”意指健康主体，即没有神经变性疾病诸如多发性硬化(ms)的临床体征或症状的主体。在临床上评估对照主体的另外检测不到的ms体征或症状，所述评估可包括常规身体检查和/或实验室试验。如本文所用，“对照组”是指对照主体或健康主体的组，即没有神经变性疾病诸如ms的临床体征或症状的主体的组。

如本文所用，“样品”、“生物样品”、“测样品品”、“样本”、“主体的样品”和“患者样品”可互换使用且可以是血液、组织、尿、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。样品可从患者获得直接使用或可预处理，诸如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的失活、添加试剂等，以如本文所讨论或另外本领域已知的一些方式修饰样品的特征。

如本文可互换使用的术语“主体”、“患者”或“方法中的主体”意指任何脊椎动物，包括但不限于，哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠)、非人灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人。在一些实施方案中，该主体可以是人或非人。在一些实施方案中，该主体可以是处于或怀疑处于发展神经变性疾病诸如ms的风险中或已经患有神经变性疾病诸如ms的人主体。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”是指这样的治疗，其中目的在于减缓(减轻)非所需生理病况、病症或疾病，或获得有利或所需的临床结果。对于本发明的目的，有利或所需临床结果包括，但不限于，缓解症状；减小病况、病症或疾病的程度；稳定(即，不恶化)病况、病症或疾病的状态；延迟病况、病症或疾病的发作或减缓其进展；改善病况、病症或疾病状态；以及缓解(无论局部还是整体)，无论可检测到还是不可检测到，或增强或改善病况、病症或疾病。治疗还包括与如果不接受治疗所预期到的存活相比，延长存活。

除非文中另外定义，结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交所用的任何名称以及其技术是本领域众所周知且常用的那些。术语的含义和范围应当是清楚的；但在任何潜在不明确的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。

2.基于rgma片段的诊断测定

本发明涉及用于定量和检测样品中的rgma片段的诊断测定。该rgma可以是任何rgma片段。该诊断测定可定量和检测至少一种rgma片段。将rgma合成为含有47aa信号序列、121aan端前区段、256成熟区和26aac端前区段的450氨基酸(aa)前原蛋白。n端前区段含有rgd三肽和该分子的唯一两个潜在的n-连接糖基化位点。成熟区段显示具有与vonwillebrand因子结构域的结构同源性的缩短结构域。在天冬氨酸-脯氨酸键处发生蛋白水解加工，产生预期的32kda成熟区。gpi-锚定的rgma蛋白被弗林蛋白酶和前蛋白转化酶ski-1加工成许多膜结合和可溶性片段，且该加工是其适当体内功能所需的。

rgma的受体被报导为再生蛋白(neogenin)。rgm-a也已显示为骨形态发生蛋白共同受体(coreceptor)，能够结合bmp-2、bmp-4、bmp-5和bmp-6。rgma的几种不同片段通过结合至其神经元受体再生蛋白而发挥其神经突生长抑制功能。再生蛋白为免疫球蛋白超家族中的成员且由四个n端免疫球蛋白样结构域(ig)、六个纤连蛋白iii型(fniii)结构域、跨膜结构域和c端内部结构域组成。两个不同rgma片段n端(30kda)和c端片段(40kda)结合至再生蛋白的相同fniii结构域(结构域3-4)，尽管它们缺乏序列同源性。rgma片段已显示在体外抑制神经突生长。在脊髓损伤模型中用多克隆rgma抗体中和rgma活性导致长距离轴突再生且增进功能恢复。在脑中风模型中，rgma的下调导致神经保护和经由再生蛋白加强的功能恢复，所述再生蛋白在轴突引导和细胞分化中的基本作用是众所周知的。在人csf中两种再生抑制性rgma片段(30和40kda)的存在表示这些蛋白在进行性ms患者中导致再生失败和神经变性。在ms患者中，rgma由脑和脊髓中的不成熟和成熟树突细胞表达。rgma在免疫系统中，例如也在小胶质细胞上，或在t细胞反应的调节中也可能具有作用，因为其在cd68-阳性巨噬细胞和cd4-阳性t淋巴细胞上表达。在脑中，活化的小胶质细胞在其表面表达rgma，且小胶质rgma表达的降低导致在体外和在体内均增强轴突生长。此外，rgma基因在用实验自身免疫性脑脊髓炎诱导的ms患者和某些大鼠品系中被鉴定为与疾病相关的基因。

诊断测定包括从主体获得包含至少一种rgma片段的样品；将该样品与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白结合至少一种rgma片段以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；将该样品与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与该捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物，以及检测和定量样品中的至少一种rgma片段。至少一种rgma片段可具有约1kda至约65kda的大小。至少一种rgma片段可具有约10kda、约18kda、约20kda、约30kda、约40kda、约50kda或约65kda的大小。至少一种rgma片段可选自18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段。可将至少一种rgma片段与样品的其他组分(诸如具有不同大小的其他rgma片段)分离。在一些实施方案中，该测定涉及使用分离技术，诸如凝胶电泳、柱色谱和质谱，通过大小分离片段。

a.rgma片段

rgma通过诊断测定检测。rgma可以是rgma片段。该测定可检测至少一种rgma片段。

rgma通过两种蛋白酶，前蛋白转化酶ski-1和弗林蛋白酶，在n-端氨基酸168和在n-端结构域内切割以产生功能活性蛋白和18、30和40kda的活性片段(图1)。30kda片段通过二硫键(s-s)连接膜结合的c-端40kda片段。在c-端(箭头，脱落)gpi-锚定结构域内切割导致三个片段的释放，产生可溶形式的rgma。当c-端被脱落酶和切割gpi-锚的酶切割时，产生这些片段的可溶形式。如同膜-锚定形式，三个所有可溶性片段(18kda=截短n-端结构域，30kda=n-端结构域，40kda=c-端结构域)作为轴突生长和再生抑制剂是有活性的。

基于rgma片段的诊断测定可检测具有约1kda至约65kda的大小的至少一种rgma片段。rgma片段可以是约1kda、约2kda、约3kda、约4kda、约5kda、约6kda、约7kda、约8kda、约9kda、约10kda、约11kda、约12kda、约13kda、约14kda、约15kda、约16kda、约17kda、约18kda、约19kda、约20kda、约21kda、约22kda、约23kda、约24kda、约25kda、约26kda、约27kda、约28kda、约29kda、约30kda、约31kda、约32kda、约33kda、约34kda、约35kda、约36kda、约37kda、约38kda、约39kda、约40kda、约41kda、约42kda、约43kda、约44kda、约45kda、约4kda、约47kda、约48kda、约49kda、约50kda、约51kda、约52kda、约53kda、约54kda、约55kda、约56kda、约57kda、约58kda、约59kda、约60kda、约61kda、约62kda、约63kda、约64kda、约65kda或其组合。

基于rgma片段的诊断测定可检测至少一种rgma片段、至少两种rgma片段、至少三种rgma片段、至少四种rgma片段、至少五种rgma片段、至少六种rgma片段或至少七种rgma片段。基于rgma片段的诊断测定可检测10kdargma片段、18kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段、50kdargma片段、65kdargma片段或其组合。例如，基于rgma片段的诊断测定可检测10kdargma片段；18kdargma片段；20kdargma片段、30kdargma片段；40kdargma片段；50kdargma片段；65kdargma片段；10kdarmga片段和18kdargma片段；10kdarmga片段和20kdargma片段；10kdarmga片段和30kdargma片段；10kdarmga片段和40kdargma片段；10kdarmga片段和50kdargma片段；10kdarmga片段和60kdargma片段；18kdarmga片段和20kdargma片段；18kdarmga片段和30kdargma片段；18kdarmga片段和40kdargma片段；18kdarmga片段和50kdargma片段；18kdarmga片段和60kdargma片段；20kdarmga片段和30kdargma片段；20kdarmga片段和40kdargma片段；20kdarmga片段和50kdargma片段；20kdarmga片段和60kdargma片段；30kdarmga片段和40kdargma片段；30kdarmga片段和50kdargma片段；30kdarmga片段和60kdargma片段；40kdarmga片段和50kdargma片段；40kdarmga片段和60kdargma片段；50kdarmga片段和60kdargma片段；10kdargma片段和18kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段、50kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；18kdargma片段和10kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段、50kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；20kdargma片段和10kdargma片段、18kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段、50kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；30kdargma片段和10kdargma片段、18kdargma片段、20kdargma片段、40kdargma片段、50kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；40kdargma片段和10kdargma片段、18kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、50kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；50kdargma片段和10kdargma片段、18kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段或65kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种；65kdargma片段和10kdargma片段、18kdargma片段、20kdargma片段、30kdargma片段、40kdargma片段或50kdargma片段中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种。基于rgma片段的诊断测定可检测18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段，只要这些片段保留捕获结合蛋白诸如以下所讨论的抗-rgma-抗体的结合表位位点。

b.片段检测

可通过分离片段和测定片段大小的多种方式来检测和定量主体样品中的rgma片段。可使用特异性结合rgma片段的捕获结合蛋白检测片段，所述捕获结合蛋白诸如rgma片段结合蛋白，诸如抗-rgma抗体。捕获结合蛋白可具有可检测的标记或由具有可检测标记的检测结合蛋白识别。可检测标记允许鉴定rgma片段。

在一些实施方案中，使用sds-page/western印迹分析鉴定、测定大小和定量rgma片段。在一些实施方案中，使用柱色谱技术鉴定、测定大小和定量rgma片段。在一些实施方案中，使用质谱鉴定、测定大小和定量rgma片段。

捕获结合蛋白可以是抗-rgma抗体，诸如生物素化rgma-选择性抗体(baf2459r&dsystems)或美国专利公开号2004/0102376、2010/0028340、2011/0135664、2013/0330347和2014/0023659中所述的rgma抗体。结合rgma片段的抗体可在与abc过氧化物酶染色试剂盒(pierce；32020)或高灵敏ecl溶液(thermoscientific,supersignalwestfemtochemiluminescencesubstrate,34094)孵育后显现且用versadocimager(biorad)扫描。quantityoneversion4.6.9(biorad)可用于定量体液中重组rgma(r&dsystems,2459-rm-050)和单rgma片段的条带强度。

(1)sds-page/western印迹

基于rgma片段的诊断测定可进一步包括将至少一种rgma片段固定于膜以产生western印迹膜，将western印迹膜与捕获结合蛋白接触，其中该捕获结合蛋白与固定于western印迹膜的至少一种rgma片段结合，以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；以及将western印迹膜与检测结合蛋白接触，其中该检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物。

可使用rgma蛋白标准物标记物且与样品同时在sds-page上分离。使至少一种rgma片段条带强度与rgma蛋白标准物标记物比较以确定rgma片段的大小和/或定量至少一种rgma片段的量。rgma蛋白标准物可以是重组rgma片段梯度。在一些实施方案中，重组rgma片段梯度包括10、25、50、100和200pg/ml。sds-page可具有5%至25%丙烯酰胺。在一些实施方案中，sds-page可以是4-15%丙烯酰胺梯度凝胶。膜可以是硝酸纤维素或pvdf膜。

3.使用基于rgma片段的诊断测定的方法-诊断、预测或评估治疗性/预防性治疗的效力的方法

本文还提供了使用基于rgma片段的诊断测定的方法。该方法包括从有需要的主体获得样品。该方法使用基于rgma片段的诊断测定以检测从主体获得的样品中上述rgma片段中至少一种的存在和/或水平。该主体可患有神经变性疾病或处于患有神经变性疾病的风险。

该方法利用基于rgma片段的诊断测定以确定用于神经变性疾病的治疗或治疗方案的有效性。在其他实施方案中，该方法利用基于rgma片段的诊断测定以预测患有神经变性疾病的主体对治疗或治疗方案的反应性。在一些实施方案中，该方法利用基于rgma片段的诊断测定以确定是否应当将治疗或治疗方案施用于主体。在还有其他实施方案中，该方法利用基于rgma片段的诊断测定以优化用于患有神经变性疾病的主体中的治疗或治疗方案。在一些实施方案中，该方法可使用基于rgma片段的诊断测定以监测患有神经变性疾病的主体中的治疗或治疗方法。在其他实施方案中，该方法利用基于rgma片段的诊断测定以筛选针对神经变性疾病在治疗上有效的化合物。

a.神经变性疾病

rgma可用作神经变性和一个方面慢性疾病进展和另一个方面再生之间相互作用的调节剂。神经变性疾病可以是其中rgma的存在与疾病相关(即，其中rgma活性是不利的)的疾病。例如，在缺血损伤人脑组织中，在患有创伤性脑损伤的人的病变中，在ad患者的斑区中，在帕金森氏病患者的黑质中以及在ms患者中已经发现了rgma。神经变性疾病或病症可以是多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、cns的创伤性损伤，诸如脊髓损伤、创伤性脑损伤，以及中风，诸如缺血性脑中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性和脑白质营养不良。

(1)多发性硬化

多发性硬化(ms)为一种中枢神经系统的失能性疾病，其干扰脑内，以及脑和身体之间的信息流。ms涉及一种免疫-介导的过程，其中身体免疫系统的异常反应针对中枢神经系统(cns)，所述中枢神经系统由脑、脊髓、视网膜和视神经组成。该病症的特征在于关于其进展和其炎性病变的主要脑和脊髓定位的多种亚型。此类亚型包括复发-缓解型ms(rrms)、继发性-进行性ms(spms)、原发性-进行性ms(ppms)和进行性-复发ms(prms)。

rrms的特征在于恶化的神经功能的明确定义的攻击，通常称为复发、发作或恶化，其随后为局部或完全恢复期(缓解)，在其期间，症状局部或完全改善，且没有明显疾病进展。spms的特征为ms的第二阶段并在起初具有rrms疾病进程的个体中发生。因为疾病从rrms中所见的炎症过程逐渐地变化为特征在于神经损伤或损失的更稳定的进行性阶段，所以患有spms的个体可或不可继续经历由炎症引起的复发。ppms的特征在于神经功能的稳定恶化，没有任何明显复发或缓解期。患有ppms的个体具有随时间变化的进展率，伴随偶尔稳定或暂时改善，但进展是连续的。prms类似于ppms，因为患有prms的个体从刚开始就经历稳定恶化的神经功能，以及偶尔复发，如患有rrms的患者所经历的那些。

术语“临床上分离的综合征”(cis)用于描述持续至少24小时且由中枢神经系统中一个或多个部位的炎症和脱髓鞘引起的神经症状的首次发作。cis可以是单病灶的，其中人经历由单病变引起的单一神经体征或症状，或为多病灶的，其中人经历由在多于一处的病变引起的多于一种体征或症状。经历cis的人可或不可继续发展ms。长期来看，大多数患者结束为具有神经变性性质的进行性、郁积型、慢性炎性过程。

可使用扩展残疾状况得分(expandeddisabilitystatusscore,edss)和/或最大步行距离和/或步行速度的评估来评估或诊断患有或怀疑患有ms的主体。在一些实施方案中，具有降低的edss得分，增加的步行距离，和/或减慢的步行速度的主体可表明治疗或治疗方案对于主体是有效的。

例如，与主体治疗前的edss得分相比，主体的edss得分降低至少约0.1、至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约2.0、至少约3.0、至少约4.0、至少约5.0或至少约6.0，表明治疗或治疗方案在治疗神经变性疾病中是有效的。

例如，具有约70m至约150m、约70m至约145m、约70m至约140m、约70m至约135m、约70m至约130m、约70m至约125m、约70m至约120m、约70m至约115m、约70m至约110m、约70m至约105m、约70m至约100m、约70m至约95m、约70m至约90m、约70m至约85m、约70m至约80m、约70m至约75m、约75m至约150m、约75m至约145m、约75m至约140m、约75m至约135m、约75m至约130m、约75m至约125m、约75m至约120m、约75m至约115m、约75m至约110m、约75m至约105m、约75m至约100m、约75m至约95m、约75m至约90m、约75m至约85m、约75m至约80m、约80m至约150m、约80m至约145m、约80m至约140m、约80m至约135m、约80m至约130m、约80m至约125m、约80m至约120m、约80m至约115m、约80m至约110m、约80m至约105m、约80m至约100m、约80m至约95m、约80m至约90m、约80m至约85m、约85m至约150m、约85m至约145m、约85m至约140m、约85m至约135m、约85m至约130m、约85m至约125m、约85m至约120m、约85m至约115m、约85m至约110m、约85m至约105m、约85m至约100m、约85m至约95m、约85m至约90m、约90m至约150m、约90m至约145m、约90m至约140m、约90m至约135m、约90m至约130m、约90m至约125m、约90m至约120m、约90m至约115m、约90m至约110m、约90m至约105m、约90m至约100m、约90m至约95m、约95m至约150m、约95m至约145m、约95m至约140m、约95m至约135m、约95m至约130m、约95m至约125m、约95m至约120m、约95m至约115m、约95m至约110m、约95m至约105m、约95m至约100m、约100m至约150m、约100m至约145m、约100m至约140m、约100m至约135m、约100m至约130m、约100m至约125m、约100m至约120m、约100m至约115m、约100m至约110m、约100m至约105m、约105m至约150m、约105m至约145m、约105m至约140m、约105m至约135m、约105m至约130m、约105m至约125m、约105m至约120m、约105m至约115m、约105m至约110m、约110m至约150m、约110m至约145m、约110m至约140m、约110m至约135m、约110m至约130m、约110m至约125m、约110m至约120m、约110m至约115m、约115m至约150m、约115m至约145m、约115m至约140m、约115m至约135m、约115m至约130m、约115m至约125m、约115m至约120m、约120m至约150m、约120m至约145m、约120m至约140m、约120m至约135m、约120m至约130m、约120m至约125m、约250m至约750m、约250m至约700m、约250m至约650m、约250m至约600m、约250m至约550m、约250m至约500m、约250m至约450m、约250m至约400m、约250m至约350m、约250m至约300m、约300m至约750m、约300m至约700m、约300m至约650m、约300m至约600m、约300m至约550m、约300m至约500m、约300m至约450m、约300m至约400m、约300m至约350m、约350m至约750m、约350m至约700m、约350m至约650m、约350m至约600m、约350m至约550m、约350m至约500m、约350m至约450m、约350m至约400m、约400m至约750m、约400m至约700m、约400m至约650m、约400m至约600m、约400m至约550m、约400m至约500m、约400m至约450m、约450m至约750m、约450m至约700m、约450m至约650m、约450m至约600m、约450m至约550m、约450m至约500m、约500m至约750m、约500m至约700m、约500m至约650m、约500m至约600m、约500m至约550m、约550m至约750m、约550m至约700m、约550m至约650m、约550m至约600m、约600m至约750m、约600m至约700m、约600m至约650m、约650m至约750m或约650m至约700m的步行距离的增加的主体表明治疗或治疗方案在治疗该主体的神经变性疾病中是有效的。具有步行距离增加至少约1m、至少约2m、至少约3m、至少约4m、至少约5m、至少约10m、至少约15m、至少约20m、至少约25m、至少约30m、至少约35m、至少约40m、至少约45m、至少约50m、至少约55m、至少约60m、至少约65m、至少约70m、至少约75m、至少约80m、至少约85m、至少约90m、至少约95m、至少约100m、至少约105m、至少约110m、至少约115m、至少约120m、至少约125m、至少约130m、至少约135m、至少约140m、至少约145m、至少约150m、至少约155m、至少约160m、至少约165m、至少约170m、至少约175m、至少约180m、至少约185m、至少约190m、至少约195m或至少约200m的主体表明治疗或治疗方案在治疗该主体的神经变性疾病中是有效的。

例如，具有至少约30s/8m至至少约10s/8m、至少约25s/8m至至少约10s/8m、至少约20s/8m至至少约10s/8m、至少约15s/8m至至少约10s/8m、至少约30s/8m至至少约15s/8m、至少约25s/8m至至少约15s/8m、至少约20s/8m至至少约15s/8m、至少约30s/8m至至少约20s/8m、至少约25s/8m至至少约20s/8m或至少约30s/8m至至少约25s/8m的步行速度(s/8m)的增加的主体表明治疗或治疗方案在治疗该主体的神经变性疾病中是有效的。具有小于约30.0s/8m、小于约25.0s/8m、小于约20.0s/8m、小于约15.0s/8m、小于约14.5s/8m、小于约14.0s/8m、小于约13.5s/8m、小于约13.0s/8m、小于约12.9s/8m、小于约12.8s/8m、小于约12.7s/8m、小于约12.6s/8m、小于约12.5s/8m、小于约12.4s/8m、小于约12.3s/8m、小于约12.2s/8m、小于约12.1s/8m、小于约12.0s/8m、小于约11.9s/8m、小于约11.8s/8m、小于约11.7s/8m、小于约11.6s/8m、小于约11.5s/8m、小于约11.4s/8m、小于约11.3s/8m、小于约11.2s/8m、小于约11.1s/8m、小于约11.0s/8m、小于约10.5s/8m、小于约10.0s/8m、小于约9.5s/8m、小于约9.0s/8m、小于约8.5s/8m或小于约8.0s/8m的步行速度的主体表明治疗或治疗方案在治疗该主体的神经变性疾病中是有效的。

例如，主体步行8m花费的时间减少至少约0.5秒、至少约1秒、至少约2秒、至少约3秒、至少约4秒、至少约5秒、至少约6秒、至少约7秒、至少约8秒、至少约9秒、至少约10秒、至少约11秒、至少约12秒、至少约13秒、至少约14秒、至少约15秒、至少约16秒、至少约17秒、至少约18秒、至少约19秒、至少约20秒、至少约21秒、至少约22秒、至少约23秒、至少约24秒或至少约25秒表明治疗或治疗方案在治疗该主体的神经变性疾病中是有效的。

b.对照/参考水平

可期望包括对照样品。对照样品可与如上所述的来自主体的样品同时分析。从主体样品获得的结果可与从对照样品获得的结果比较。可提供标准曲线，用所述标准曲线，可比较生物样品的测得结果。此类标准曲线将标志物的水平呈现为测得单位的函数，即如果使用化学发光标记，则所述测定单位为化学发光信号强度。使用取自多个供体的样品，可提供正常健康组织或未进行处理的ms组织中rgma片段的对照水平的标准曲线。

因此，鉴于以上描述，提供测定测试样品中rgma片段的存在、量或浓度的方法。所述方法包括(1)通过western印迹分析法测定测试样品的rgma片段，例如采用结合rgma片段上的表位的至少一种捕获抗体以及结合捕获抗体或rgma片段上的表位(所述表位不同于捕获抗体的表位)且任选地包括可检测标记的至少一种检测抗体。该方法进一步包括(2)将作为测试样品中rgma片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的由可检测标记所产生的信号与作为校准物中rgma片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的所产生的信号比较。所述校准物任选地，且优选地，为一系列校准物的一部分，其中每个校准物与系列中的其他校准物不同在于rgma片段的浓度。

(1)参考水平

本文所述的方法使用主体的rgma片段的参考水平以(1)鉴定和确定治疗或治疗方案用于患有神经变性疾病的主体的有效性；(2)预测患有神经变性疾病的主体对治疗或治疗方案的反应性；(3)向患有神经变性疾病的主体提供治疗或治疗方案；(4)优化患有神经变性疾病的主体的治疗或治疗方案；(5)监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗或治疗方案；以及(6)筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物。

一般而言，可采用预定或参考水平作为基准，针对该基准以评估在测定测试样品的rgma片段(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段)后获得的结果。一般而言，在进行此类比较时，该预定水平系通过在适当条件下进行足够次数的特定测定来获得，使得可以建立分析物存在、量或浓度与具有特定标记的ms的特定阶段或终点的关联性或相关性。通常，用参考主体(或主体群体)的测定获得预定水平。参考主体可以是对照主体，诸如不患有神经疾病的正常或健康主体或患有神经疾病的主体，诸如ms主体。该ms主体为患有ms的特定阶段或前期(即，rrms、spms、ppms、prms或cis)且可能针对ms治疗或未治疗的主体。参考群体或参考组群可以是对照组群或ms组群。ms组群可包括患有ms的特定阶段或前期(即，rrms、spms、ppms、prms或cis)的ms主体和/或患有ms、但未针对ms治疗的主体。参考水平可以是向主体施用治疗或治疗方案之前的主体中的rgma片段水平。

具体而言，关于用于治疗反应性的预定水平，如上所述，rgma片段的量或浓度可“不变”、“有利”(或“有利变化”)或“不利”(或“不利变化”)。“升高”或“增加”是指测试样品中的量或浓度高于或大于典型或正常水平或范围(例如，预定水平)，诸如对照组或ms组中所见的典型或正常水平，或高于或大于另一参考水平或范围(例如，更早样品或基线样品)。“升高”或“增加”也指测试样品中的量或浓度高于或大于开始治疗前主体中所见的水平或范围。术语“降低”或“减小”是指测试样品中的量或浓度低于或小于典型或正常水平或范围(例如，预定水平)，诸如对照组或ms组中所见的典型或正常水平，或低于或小于另一参考水平或范围(例如，更早样品或基线样品)。术语“降低”或“减小”也指测试样品中的量或浓度低于或小于开始治疗前主体中所见的水平或范围。术语“变化”是指样品中的量或浓度相对于典型或正常水平或范围(例如，预定水平)，诸如对照组或ms组中所见的典型或正常水平，或相对于另一参考水平或范围(例如，更早样品或基线样品)变化(升高或降低)。

如上所讨论的用于rgma片段的典型或正常水平或范围或另一参考水平或范围(例如，更早样品或基线样品)根据标准惯例定义。所谓的变化水平或变化可视为当存在不能通过试验误差或样品偏差解释的与典型或正常水平或范围或参考水平或范围相比的任何净变化时发生。在一些实施方案中，在特定样品中测量的水平将与来自所谓的正常主体(即对照主体)的类似样品中确定的水平或水平范围比较。在该上下文中，例如，“正常”(有时称为“对照”或“健康”)主体是不具有可检测的ms的主体，且“正常”患者或群体是不表现出可检测的ms的患者或群体。“明显正常的主体”为rgma片段未被评估或正被评估的主体(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段)。当分析物在正常情况下检测不到(例如，正常水平为零，或在正常群体的约25至约75百分位数范围内)，但在测试样品中检测到时，以及当分析物以比正常水平更高的水平存在于测试样品中时，则该分析物的水平被视为“升高”。在一些实施方案中，将在特定样品中测量的水平与来自ms主体的类似样品或取自开始治疗前的主体的早期样品或基线样品中测量的水平或水平范围比较。

在一些实施方案中，如果参考水平是针对ms治疗或未治疗的ms主体中的rgma片段水平，则高于rgma片段(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段)的参考水平的水平将主体鉴定为对治疗或治疗方案没有反应或将治疗鉴定为对于治疗ms是无效的；低于或等于rgma片段(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段)的参考水平的水平将主体鉴定为对治疗或治疗方案有反应或将治疗鉴定为对于治疗ms是有效的。

在一些实施方案中，与对照、基线或更早水平或范围相比的样品中相对rgma片段水平的变化将主体鉴定为对治疗或治疗方案有反应或将治疗鉴定为对于治疗ms是有效的。在一些实施方案中，与对照、更早或基线样品中的rgma片段水平相比，取自主体的样品中少于约100%、少于约95%、少于约85%、少于约80%、少于约75%、少于约70%、少于约65%、少于约55%、少于约50%、少于约45%、少于约40%、少于约35%、少于约30%、少于约25%、少于约20%、少于约15%、少于约10%或少于约5%的相对rgma片段水平将主体鉴定为对治疗或治疗方案有反应或预测有反应或将治疗鉴定为对于治疗ms是有效的。

c.样品

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可包括从主体获得一种或多种样品。一种或多种样品可以是脑脊液(csf)样品。在其他实施方案中，一种或多种样品可取自任何来源，例如，组织、血液、血浆、唾液、痰、粘液、汗液、尿液、尿道拭子、宫颈拭子、泌尿生殖或肛门拭子、结膜拭子、眼晶状体液或脑脊液。一种或多种样品可(i)直接获得自主体来使用或(ii)在预处理以改变一种或多种样品的特征后使用。因此，一种或多种样品可通过例如由血液制备血浆或血清、裂解细胞、由固体材料制备液体、稀释粘液、过滤液体、添加试剂、纯化核酸、纯化蛋白等进行预处理。

样品可在向主体施用治疗或治疗方案前和后的多个时间点获取。例如，样品可在向主体施用治疗或治疗方案之前1天、0天、之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天获取。

d.与其他生物标志物的组合

本文所述的方法也可包括使用基于rgma片段的诊断测定与另一生物标志物的组合以(1)鉴定和确定治疗或治疗方案对患有神经变性疾病的主体的有效性；(2)预测患有神经变性疾病的主体对治疗或治疗方案的反应性；(3)向患有神经变性疾病的主体提供治疗或治疗方案；(4)优化患有神经变性疾病的主体的治疗或治疗方案；(5)监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗或治疗方案；以及(6)筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物。在一些实施方案中，生物标志物可以是ms的生物标志物，诸如nogoa、nogo受体(ngr)的配体、nogo受体、少突细胞髓磷脂糖蛋白(omgp)、髓磷脂碱性蛋白(mbp)、神经丝(nf)、生长相关蛋白43(gap-43)；骨桥蛋白；白介素-17、白介素-6、干扰素-γ和tnf-α。在一些实施方案中，ms的生物标志物水平的变化(即增加或减少)与rgma片段水平的变化的组合表明治疗或治疗方案是否是有效的。

e.治疗方案

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于神经变性疾病的治疗或治疗方案。治疗或治疗方案可包括神经修复药物，包括神经再生药物、神经保护药物或其组合。神经修复涵盖通过突触强度的变化、突触活性的改变、沉默突触的活化、抑制性突触的沉默来修正功能失调性神经网络。神经修复包括神经再生过程。神经再生是通过受损纤维的再生、受损纤维束或健康的相邻的未受损束的侧支发芽、再生后新突触的形成以及随后新髓鞘片的形成来修复受损的神经网络。神经保护是神经元结构和/或功能的相对保存以通过停止或至少减缓神经元丢失来阻止或减缓疾病进展和继发性损伤。

治疗或治疗方案可包括皮质类固醇，诸如曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗、泼尼松龙(prednisolone)；甲泼尼龙(methylprednisolone)；咪唑硫嘌呤(azathioprine)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；环孢霉素(cyclosporine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；4-氨基吡啶(4-aminopyridine)；替扎尼定(tizanidine)；干扰素-β1a(avonex；biogen)；干扰素-β1b(betaseron；chiron/berlex)；干扰素α-n3)(interferonsciences/fujimoto)、干扰素-α(alfawassermann/j&j)、干扰素β1a-if(serono/inhaletherapeutics)、聚乙二醇干扰素α2b(enzon/schering-plough)、共聚物1(cop-1；copaxone；tevapharmaceuticalindustries,inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(cladribine)；其他人细胞因子或生长因子以及其受体，例如，tnf、lt、il-1、il-2、il-6、il-7、il-8、il-23、il-15、il-16、il-18、emap-11、gm-csf、fgf和pdgf的抗体或拮抗剂，细胞表面分子诸如cd2、cd3、cd4、cds、cd19、cd20、cd25、cd28、cd30、cd40、cd45、cd69、cd80、cd86、cd90或其配体的抗体、那他珠单抗(natalizumab)、药剂，诸如氨甲喋呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporine)、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)、特立氟胺(teriflunomide)、来氟米特(leflunomide)、醋酸格拉替雷(glatirameracetate)、gilenya(芬戈莫德)、米托蒽醌(mitoxantrone)、聚乙二醇干扰素β-1a、反丁烯二酸二甲酯、nsaid，例如，布洛芬(ibuprofen)，皮质类固醇诸如泼尼松龙(prednisolone)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、干扰促炎性细胞因子诸如tnfα或il-1的信号传导的药剂(例如irak、nik、ikk、p38或map激酶抑制剂)、il-1β转化酶抑制剂、tace抑制剂、t-细胞信号传导抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如，可溶性p55或p75tnf受体、sil-1ri、sil-1rii、sil-6r)、抗炎性细胞因子(例如il-4、il-10、il-13和tgfβ)或其任何组合。治疗或治疗方案可包括促再生rgma抗体。促再生rgma抗体描述于美国专利公开号2004/0102376、2010/0028340、2011/0135664、2013/0330347和2014/0023659中。

治疗可进一步包括：治疗剂、成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；黏附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能性片段；氨甲喋呤；环孢菌素；雷帕霉素；fk506；可检测标记或报告分子；tnf拮抗剂；抗风湿药物；肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药(nsaid)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗牛皮藓剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫剂(immunization)、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药物、刺激剂、哮喘药物、β-激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、神经保护剂，诸如抗氧化剂、自由基清除剂、抗惊厥药物如苯妥英(phenytoin)、贫血药物红细胞生成素或其组合。

(1)tca

神经变性疾病的治疗或治疗方案可以是曲安奈德治疗。称为曲安奈德(tca=volona)的持久性皮质类固醇的鞘内施用可用于ms患者中。多种tca研究揭示具有降低的edss(扩展残疾状况得分)、增加的步行距离和减慢的步行速度的治疗患者的显著改善。然而，ms患者的这种改善功能恢复的基本分子机理是完全不清楚的。

先前的公开观察试验描述在原发性和继发性进行性ms患者中重复鞘内施用持续释放类固醇曲安奈德(tca)的益处，尤其当他们患有脊髓症状时。在临床上，对tca治疗有三种反应：(i)在一系列的四次至六次tca施用期间，患者可能报导立刻改善或(ii)在几次tca注射后疾病症状的延迟改善或(iii)无益处。未详细知道对tca治疗的这三种行为反应模式的生化和药理原因。在上肢和下肢功能的明显立刻增强的患者中显示自由基的csf合成降低。一般而言，自由基具有介导组织破坏和调节多种csf蛋白产生的能力。重复鞘内施用持续释放类固醇曲安奈德可有利于进行性多发性硬化患者。

f.确定用于神经变性疾病的治疗的有效性的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于确定用于有需要的主体中的神经变性疾病的治疗或治疗方案的有效性的方法。确定方法可包括确定获得自主体的样品中的至少一种rgma片段的水平。确定可包括使用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

确定的方法也可包括将至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较。如果至少一种rgma片段的水平相比于至少一种rgma片段的对照水平提高，则可确定该治疗或治疗方案在治疗神经变性疾病中是无效的。当确定治疗或治疗方案在治疗神经变性疾病中是无效的时，则该方法也可包括向主体施用与无效治疗或治疗方案不同的治疗或治疗方案。

如果至少一种rgma片段的水平相比于至少一种rgma片段的对照水平降低，则可以确定治疗或治疗方案在治疗神经变性疾病中是有效的。当确定治疗或治疗方案在治疗神经变性疾病中是有效的时，则该方法也可包括继续向主体施用该有效治疗或治疗方案。

g.预测患有神经变性疾病的主体对治疗的反应性的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于预测患有神经变性疾病的主体对治疗的反应性的方法。该方法可包括确定获得自主体的样品中至少一种rgma片段的水平。确定可包括使用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

预测方法也可包括将至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较。预测方法可进一步包括如果至少一种rgma片段的水平相对于该rgma片段的对照水平降低，则提供预测主体对治疗或治疗方案的反应性。当提供反应性的预测时，预测方法也可包括向主体施用治疗或治疗方案。

h.治疗患有神经变性疾病的主体的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于治疗患有神经变性疾病的主体的方法。该方法可包括确定获得自主体的样品中至少一种rgma片段的水平。确定可包括利用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

该方法也可包括将至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较。该方法可进一步包括如果至少一种rgma片段的水平相对于该rgma片段的对照水平提高，则向主体施用治疗或治疗方案。

i.优化用于患有神经变性疾病的主体中的治疗方案的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于优化用于患有神经变性疾病的主体中的治疗或治疗方案的方法。该方法可包括确定获得自主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平。第一样品在该主体已开始治疗或治疗方案的时段之前或期间的时间点获得。该方法也可包括确定获得自主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平。第二样品可在比第一时间点晚的时间点从主体获得。第二样品可在距离获取第一样品时至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约4天、至少约5天、至少约2周、至少约1个月或至少约一年获取。确定第一水平和第二水平可包括使用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量各自样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

当至少一种rgma片段的第二水平小于至少一种rgma片段的第一水平时，则治疗或治疗方案针对神经变性疾病可能是有效的且不改变治疗方案。当至少一种rgma片段的第二水平高于或等于至少一种rgma片段的第一水平时，则治疗或治疗方案针对神经变性疾病可能是无效的且改变治疗方案。

j.监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗的方法。该方法可包括确定获得自主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平。第一样品在该主体已开始治疗或治疗方案的时段之前或期间的时间点获得。该方法也可包括确定获得自主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平。第二样品可在比第一时间点晚的时间点从主体获得。第二样品可在距离获取第一样品时至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约4天、至少约5天、至少约2周、至少约1个月或至少约一年获取。确定第一水平和第二水平可包括使用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量各自样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

至少一种rgma片段的第二水平相对于至少一种rgma片段的第一水平降低，可表明治疗或治疗方案针对神经变性疾病具有疗效。当治疗或治疗方案在治疗上被确定针对神经变性疾病有效时，监测方法可包括继续向主体施用治疗上有效的治疗或治疗方案。

至少一种rgma片段的第二水平相对于至少一种rgma片段的第一水平提高，可表明治疗或治疗方案针对神经变性疾病不具有疗效。当治疗或治疗方案在治疗上被确定对于神经变性疾病无效时，监测方法可包括向主体施用与该治疗上无效的治疗或治疗方案不同的治疗或治疗方案。

k.筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物的方法

使用基于rgma片段的诊断测定的方法可用于筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物的方法。例如，基于rgma片段的诊断测定可用于评估神经再生的临床药物候选、增强神经可塑性的临床药物候选或促进髓鞘再生的临床药物候选。该方法可包括确定包含细胞的样品中至少一种rgma片段的第一水平。该方法也可包括将样品与化合物接触。该方法可进一步包括确定样品中至少一种rgma片段的第二水平。第二水平可在将样品与化合物接触后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约4天、至少约5天、至少约2周、至少约1个月或至少约一年测量。确定第一水平和第二水平可包括使用基于rgma片段的诊断测定以检测或测量各自样品中至少一种rgma片段的存在和/或水平。

至少一种rgma片段的第二水平相对于至少一种rgma片段的第一水平降低，可表明化合物针对神经变性疾病具有疗效。至少一种rgma片段的第二水平相对于至少一种rgma片段的第一水平提高，可表明化合物针对神经变性疾病不具有疗效。

4.用于进行方法的试剂盒

本文提供试剂盒，其可用于进行如上所述的方法。试剂盒可提供(1)能够特异性结合rgma片段中任一种(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段中每一种)以定量从主体分离的生物样品中rgma片段(例如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段中每一种)的水平的试剂，以及(2)指示rgma片段(诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段中每一种)的参考水平的参考标准物，其中至少一种试剂包含能够特异性结合适当标志物的至少一种抗体。试剂盒可包含能够特异性结合至少一种rgma片段的试剂，定量生物样品中的各生物标志物的浓度的试剂以及指示生物样品中rgma片段的参考水平的参考标准物(即，18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma)。试剂盒可进一步包含能够特异性结合ms的至少一种额外生物标志物的至少一种试剂(即抗体)，所述生物标志物诸如nogoa、nogo受体、omgp、mbp、nf、gap-43、骨桥蛋白；白介素-17、白介素-6、白介素-γ和tnf-α；以及指示ms的至少一种额外生物标志物(如果存在)的参考水平的参考标准物。

试剂盒也可包含抗体和用于施用所述抗体的装置。试剂盒可进一步包含用于使用该试剂盒和进行分析、监测或治疗的说明书。

试剂盒也可包含一个或多个容器，诸如小瓶或瓶子，其中各容器含有单独试剂。试剂盒可进一步包含书面说明书，其可描述如何进行或解释本文所述的分析、监测、治疗或方法。

例如，试剂盒可包含用于通过western印迹分析来测定测试样品的18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段的说明书。说明书可为纸张形式或计算机可读形式，诸如磁盘、cd、dvd等。抗体可以是18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段捕获抗体和/或18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段检测抗体(意指用可检测标记标记的抗体)。例如，试剂盒可含有特异性结合至少一种rgma片段的至少一种捕获抗体。试剂盒也可含有用于捕获抗体的缀合抗体(例如，用可检测标记标记的抗体)(即，特异性结合18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段的捕获抗体的缀合抗体)。替代地或额外地，试剂盒可包括校准物或对照，例如，纯化的，以及任选地冻干的，(例如，18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段)，和/或至少一个容器(例如，试管、微量滴定板或条，其已经包被了抗-18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段单克隆抗体)以进行测定，和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一种可以作为浓缩溶液提供，用于可检测标记(例如，酶标记)的底物溶液，或终止溶液。优选地，试剂盒包含进行测定所必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲液、稀释液等。说明书也可包括用于产生标准曲线的说明书或用于定量18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段目的的参考标准物。

如上所提到，在试剂盒中提供的任何抗体，诸如18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段的特异性重组抗体，可并入可检测标记，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团、化学发光标记等，或试剂盒可包括用于标记抗体的试剂或用于检测抗体(例如，检测抗体)和/或用于标记分析物的试剂或用于检测分析物的试剂。抗体、校准物和/或对照可在单独容器中提供或预分配至适当测定模式、例如微量滴定板中。

任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如，灵敏度板、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的且描述于用于多种免疫诊断产物的内插页中。任选地使用灵敏度板元件来确定测定性能特征，且进一步任选地为western印迹试剂盒试剂完整性和测定标准化的有效指示剂。

试剂盒也可任选地包括进行诊断测定或利于质量控制评估所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。试剂盒中也可包括其他组分，诸如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如，预处理试剂)。试剂盒可额外包括一种或多种其他对照。可将试剂盒中的一种或多种组分冻干，其中试剂盒可进一步包括适于重构冻干组分的试剂。

试剂盒的各种组分可任选地在必要时提供于适当容器中，例如微量滴定板。试剂盒可进一步包括用于保留或储存样品的容器(例如，用于血液样品的容器或筒)。适当时，试剂盒任选地也可包括反应容器、混合容器、以及利于试剂或测试样品的制备的其他组分。试剂盒也可包括有助于获得测试样品的一种或多种装置，诸如注射器、移液管、镊子、量勺等。

如果可检测标记为至少一种吖啶鎓(acridinium)化合物时，试剂盒可包括至少一种吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一种吖啶鎓-9-甲酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记为至少一种吖啶鎓化合物时，试剂盒也可包含过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。

如果需要，试剂盒可包括固相，诸如磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、比色杯、薄膜、支架分子、膜、滤纸、石英晶体、盘或芯片。试剂盒也可包括可检测标记，其可以是抗体或缀合至抗体，诸如用作检测抗体的抗体。可检测标记可例如为直接标记，其可以是酶、寡核苷酸、纳米颗粒、化学发光团、荧光团、荧光猝灭剂、化学发光猝灭剂或生物素。试剂盒可任选地包括检测标记所需的任何额外试剂。

如果需要，试剂盒可进一步包含一种或多种单独或与说明书进一步组合的组分，以测定测试样品的另一分析物，所述分析物可以是生物标志物，诸如ms生物标志物，诸如nogoa、nogo受体、omgp、mbp、nf、gap-43、骨桥蛋白；白介素-17、白介素-6、白介素-γ和tnf-α。分析物的实例包括但不限于18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段以及本文所讨论或本领域另外已知的其他分析物和生物标志物。在一些实施方案中，用于测定测试样品的18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段的一种或多种组分能够确定18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段的存在、量或浓度。也可使用tof-ms和内标测定样品(诸如血清样品)的18kdargma片段、30kdargma片段和/或40kdargma片段。

对于本领域技术人员显而易见的是，对本文所述的本公开的方法的其他合适修改和改进可容易应用且理解，且可使用合适的等同方案不脱离本公开的范围和本文公开的方面和实施方案的情况下进行。现在详细描述本公开内容，通过参考以下实施例将更清晰地理解本公开内容，以下实施例仅用于说明本公开的一些方面和实施方案，不应视为限制本公开的范围。本文提及的所有期刊参考文献、美国专利和出版物的公开内容以其整体通过引用并入文。

本发明具有通过以下非限制实施例说明的多个方面。

实施例

实施例1

材料和方法

主体.研究25名ms患者(年龄：50±1.64[平均值±sem，岁]。平均ms持续时间为14.02±1.71[年]。主体包括14名女性和11名男性。主体包括13名继发性进行性[8名女性，5名男性]和12名原发性进行性[6名女性，6名男性])。排除标准为急性恶化发作或其症状进展近期明显加快。

设计.tca施用后，强制卧床休息至少六个小时以支持和便于tca在csf和脊髓中的扩散。用无创伤sprotte针进行腰椎穿刺。调节药物治疗的原有免疫系统保持稳定。痉挛减轻治疗没有变化。在基线处以及在施用溶解于10ml盐水中的40mg曲安奈德(tca)后的每一天进行扩展残疾状况得分(edss)评级、最大步行距离、以及步行速度评价，直到第四次tca施用。

csf取样和csf分析.在鞘内施用tca前，取csf。将约1mlcsf的等分试样收集在无菌eppendorf管中，立即冷冻并在-20℃下储存。在第一次施用tca(时刻i)前的基线处和在注射tca(时刻ii、iii、iv和v)后的每一天进行rgma测定。通过用nanodrop分析仪(thermoscientific)测量来测定蛋白浓度。

western印迹分析.通过western印迹和免疫检测分析csfrgma水平(schaffar等人，jneurochem107：418-431(2008))。简言之，将10μl各csf样品与10μlsds-负载染料(lifetechnologies)混合并在95℃下孵育10分钟。使10μl这些样品在sds-pa-凝胶(lifetechnologies)上分离并转移至硝酸纤维素膜。用抗-rgma抗体(r&dsystems,baf2459)和第二试剂超灵敏abc过氧化物酶染色试剂盒(pierce,32050)免疫染色后，将膜与发光试剂(thermoscientific,supersignalwestfemtochemiluminescencesubstrate,34094)孵育。

条带强度分析.用quantityoneversion4.6.9(biorad)测量条带强度。简言之，选择bandanalysisquickguide中的“framelanes...”并选择泳道数。用“add/adjustanchors”-工具细微调整泳道且用“detectbands…”-工具人工检测目标条带。用“alllanereport”，检测轨迹强度xmm并用于分析。对于每个患者，将时刻i计算为100%且时刻ii、iii、iv以百分比与时刻i相关。将这些百分比的平均值绘制成图且用bonferroni多重比较检验在graphpadprism5中用anova进行统计学分析。

用于实验室结果的统计学评估的步骤。通过western印迹分析所有25个患者的csf的rgma表达，其与临床得分无关。上样等量csf，用于通过western印迹分析以比较相同体积中的rgma水平。通过比重计测量分析该组中所有25个患者的csf中的30kda和40kda条带。在观察间隔期间将临床数据分组成立即反应者和非立即反应者。

统计.将用重复测量设计的ancova用于该先导试验的该探索性分析。协变量为作为协变量的ms持续时间、ms类型、性别和年龄。用针对基线的tukey多重比较检验进行事后分析。用graphpadprism5软件进行统计学分析。

实施例2

ms患者的脑脊液中的rgma

为了确定rgma片段是否存在于患有ms的患者的脑脊液中，进行人csf样品的凝胶电泳、western印迹和用rgma-特异性抗体的免疫检测，如实施例2中所述。图1显示以上所述的所有rgma片段存在于人csf中(由key和lah,celladhesion&migration6:2,85-90(2012)修改)。用rgma-特异性抗体的免疫检测导致具有约40、30和18kda的大小的三种片段的检测。tca=曲安奈德，分别为第一、第二、第三、第四和第五次tca治疗前用于进行性ms患者i-ii、iii、iv、v的鞘内治疗的持久皮质类固醇。

实施例3

多发性硬化患者中的曲安奈德的效果

当前多种药物减缓ms疾病进展，但没有导致ms患者中的功能恢复的提高。进行实验以表明每隔一天的四次曲安西龙(triamcinolone)施用的与脑脊液中rgma水平相关的效力。在25名进行性多发性硬化患者中，在基线处和施用曲安西龙后的每一天进行临床评估。在将tca施用于患者前，取1-2mlcsf的等分试样。在每次施用曲安西龙前，通过western印迹分析与定量测定rgma浓度。取决于疾病活性，患者通常接受4-6次tca施用。

反应者的临床数据.治疗后，17名患者(10名男性，7名女性；年龄：52.18±2.04，ms持续时间：15.74±1.92)得到改善。这些患者的edss得分(f=8.55；p<0.009[图3a])下降，最大步行距离增加(f=3.64；p=0.01[图3b])，以及步行速度加快(f=3.42；p<0.01[图3c])。三名患者坐轮椅且他们的数据不包括在步行能力的分析中。

没有立即反应的患者的临床数据.在观察期间，8名患者(1名男性，7名女性；年龄：45.38±2.04；ms持续时间：10.38±3.24)没有立即反应。edss得分(f=1；ns[图4a])；最大步行距离(f=1.52；ns[图4b])和步行速度(f=0.021；ns[图4c])没有明显变化。6名患者报导在tca施用后三周内的延迟改善。

一般而言，所有参与者中都没出现严重的副作用。在整个分析中没有发现协变量的影响。

实验室结果.反应者.在该组群中rgma水平下降。30kda形式(f=3.82；p<0.05[图5b])的下降没有40kda形式(f=9.12；p<0.0001[图5a])明显。蛋白csf浓度没有显著变化(f=2.77；ns[图5c])。图6说明三个代表性western印迹。

未立即反应的患者.在csf中rgma的形式(30kda：f=2.98；ns[图7b]；40kda：f=0.84；ns[图7a])和蛋白含量(f=2.86；ns[图7c])都没有出现明显变化。图8显示该组中三个代表性western印迹。

在17名患者中，多发性硬化的临床得分改善，且最大步行距离和步行速度改善。这些反应者中的rgma水平降低。剩余患者未显示迅速临床益处且rgma浓度未降低。rgma的降低可反映在进行性多发性硬化患者中通过曲安西龙的再生和功能恢复。蛋白浓度在反应者和未反应者之间无差异。在csf中的两个组群之间分别在两个组群中不存在细胞计数的相关变化。

重复施用tca诱导所有研究的rgma片段的浓度降低。令人惊讶的是，在显示功能改善的那些患者中观察到csf中的可溶性rgma片段的浓度的tca-诱导的降低，表明rgma片段可用于评估ma患者的结果。这通过第二观察进一步加强，其中也用tca治疗的另一组ms患者未显示rgma片段csf浓度的降低且同时未显示功能恢复。

应理解，以上详述和随附实施例仅为说明性且不视为对本发明范围的限制，本发明范围仅由随附权利要求和其等效方案定义。

对所公开的实施方案的多种改变和变化对于本领域技术人员是显而易见的。可在不脱离其精神和范围下进行此类改变和变化，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些。

为了完整性原因，在以下编号项中记载本发明的各个方面：

项1.检测和定量样品中的至少一种rgma片段的方法，所述方法包括：(a)从主体获得包含至少一种rgma片段的样品；(b)将所述样品与捕获结合蛋白接触，其中所述捕获结合蛋白结合所述至少一种rgma片段以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；(c)将所述样品与检测结合蛋白接触，其中所述检测结合蛋白与捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物，以及(d)检测和定量样品中至少一种rgma片段。

项2.项1的方法，其中所述至少一种rgma片段为具有约1kda至约65kda的大小的rgma片段。

项3.项1或2的方法，其中所述rgma片段具有10kda、18kda、20kda、30kda、40kda、50kda或65kda的大小。

项4.项1至3中任一项的方法，其中所述rgma片段选自18kdargma片段、30kdargma片段和40kdargma片段。

项5.项1至4中任一项的方法，其中至少一种rgma片段在步骤(b)前使用凝胶电泳分离。

项6.项5的方法，其进一步包括在步骤(b)前将所述至少一种rgma片段固定于膜上以产生western印迹膜；在步骤(b)中，将所述western印迹膜与所述捕获结合蛋白接触，其中所述捕获结合蛋白与固定于所述western印迹膜上的至少一种rgma片段结合，以形成捕获结合蛋白-rgma片段复合物；以及在步骤(c)中，将所述western印迹膜与检测结合蛋白接触，其中所述检测结合蛋白与所述捕获结合蛋白相互作用以形成检测结合蛋白-捕获结合蛋白rgma片段复合物。

项7.项1至6中任一项的方法，其中检测至少两种rgma片段。

项8.项7的方法，其中所述至少两种rgma片段的大小为30kda和40kda。

项9.项1至6中任一项的方法，其中检测至少三种rgma片段。

项10.项9的方法，其中所述至少三种rgma片段的大小为18kda、30kda和40kda。

项11.项1至10中任一项的方法，其中至少一种rgma片段为可溶性rgma片段。

项12.项5至11中任一项的方法，其进一步包括在步骤(b)中，在凝胶上同时分离rgma蛋白标准物与样品中的蛋白；以及(g)将至少一种rgma片段与分离的rgma蛋白标准物比较以定量所述片段。

项13.项12的方法，其中所述rgma蛋白标准物为重组rgma片段梯度。

项14.项13的方法，其中所述梯度包含rgma蛋白标准物10、25、50、100和200pg/ml。

项15.项1至14中任一项的方法，其中所述rgma片段的大小由sds-page测定。

项16.项15的方法，其中所述sds-page为4-15%。

项17.项6至16中任一项的方法，其中所述膜为硝酸纤维素膜。

项18.项1至17中任一项的方法，其中所述捕获结合蛋白为rgma-选择性抗体。

项19.项18的方法，其中所述抗体为生物素化rgma-选择性抗体。

项20.项19的方法，其中所述检测结合蛋白为四价抗生物素蛋白且所述可检测标记为生物素化辣根过氧化物酶。

项21.项20的方法，其中至少一种rgma片段使用过氧化物酶染色试剂盒检测。

项22.确定有需要的主体中的神经变性疾病的治疗有效性的方法，所述方法包括：(a)使用项1至21中任一项的方法确定所述主体的样品中至少一种rgma片段的水平；以及(b)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较，其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平提高，则所述治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是无效的，以及其中如果与对照水平相比，至少一种片段的水平相同或降低，则所述治疗被确定为在治疗神经变性疾病中是有效的。

项23.项22的方法，其进一步包括继续向有需要的主体施用被确定为在治疗神经变性疾病中有效的治疗。

项24.项22或23的方法，其中至少一种rgma片段的对照水平为患有神经变性疾病、但没有对神经变性疾病进行治疗的主体中的至少一种rgma片段的水平。

项25.预测患有神经变性疾病的主体对治疗的反应性的方法，所述方法包括：(a)使用项1至21中任一项的方法确定所述主体的样品中至少一种rgma片段的水平；(b)将所述主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较；以及(c)如果与对照水平相比，样品中至少一种rgma片段的水平降低，则提供预测所述主体对治疗的反应性。

项26.项25的方法，其进一步包括向预测对治疗有反应的主体施用治疗。

项27.治疗患有神经变性疾病的主体的方法，所述方法包括：(a)使用项1至21中任一项的方法确定所述主体的样品中至少一种rgma片段的水平；(b)将所述主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较；以及(c)如果与对照水平相比，片段的水平提高，向所述主体施用治疗方案。

项28.项22至27中任一项的方法，其中所述治疗包含神经修复药物、神经保护药物或神经再生药物。

项29.项22至28中任一项的方法，其中所述治疗包含曲安奈德(tca)、tecfidera/bg-12(反丁烯二酸二甲酯)、gilenya(芬戈莫德)、拉喹莫德、β-干扰素、克帕松、达利珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗中的至少一种或其组合。

项30.项26至29中任一项的方法，其中所述治疗包含曲安奈德(tca)。

项31.优化用于患有神经变性疾病的主体中的治疗方案的方法，所述方法包括：(a)使用项1至20中任一项的方法确定所述主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平，其中所述第一样品在所述主体已开始治疗方案的时段之前或期间的时间点从所述主体获得；(b)在比步骤(a)晚的时间，确定所述主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平降低表明治疗方案针对神经变性疾病具有疗效；(c)使用项1的方法确定所述主体的第一样品中至少一种rgma片段的水平，(d)将主体的样品中至少一种rgma片段的水平与至少一种rgma片段的对照水平比较；以及(e)如果与对照水平相比，样品中至少一种rgma片段的水平降低，则提供预测所述主体对治疗的反应性。

项32.项31的方法，其中所述治疗方案为神经修复治疗方案。

项33.项32的方法，其中所述神经修复治疗方案的成功率增加。

项34.项31的方法，其中所述治疗方案为神经保护治疗方案。

项35.项34的方法，其中所述神经保护治疗方案的成功率增加。

项36.监测患有神经变性疾病的主体的促进再生药物治疗的方法，所述方法包括：(a)使用项1至21中任一项的方法确定所述主体的第一样品中至少一种rgma片段的第一水平，其中所述第一样品在所述主体已开始药物治疗的时段之前或期间的时间点从所述主体获得；(b)在比步骤(a)晚的时间，确定所述主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的第二水平降低表明药物治疗方案针对神经变性疾病具有疗效，以及与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的所述第二水平提高表明药物治疗方案针对神经变性疾病不具有疗效；以及(c)如果药物治疗方案针对神经变性疾病不具有疗效，则向所述主体施用不同药物治疗。

项37.筛选针对神经变性疾病具有疗效的化合物的方法，所述方法包括：(a)使用项1至21中任一项的方法确定包含细胞的样品中至少一种rgma片段的第一水平；(b)将所述样品与化合物接触，(c)在比步骤(b)晚的时间，确定所述主体的第二样品中至少一种rgma片段的第二水平，其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的所述第二水平降低表明化合物针对神经变性疾病具有疗效，以及其中与至少一种rgma片段的第一水平相比，至少一种rgma片段的所述第二水平提高表明化合物针对神经变性疾病不具有疗效；以及(d)选择被鉴定为具有疗效的化合物。

项38.项22至37中任一项的方法，其中检测至少两种rgma片段。

项39.项38的方法，其中所述至少两种rgma片段的大小为30kda和40kda。

项40.项22至37中任一项的方法，其中检测至少三种rgma片段。

项41.项40的方法，其中所述至少三种rgma片段的大小为18kda、30kda和40kda。

项42.项22至41中任一项的方法，其中所述神经变性疾病或病症为多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、泰-萨二氏病、尼曼-匹克病、高歇氏病、赫尔勒氏综合征、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、特发性炎性脱髓鞘疾病、维生素b12缺乏、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克氏病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性或脑白质营养不良。

项43.项22至42中任一项的方法，其中所述神经变性疾病或病症为多发性硬化。

项44.项1至43中任一项的方法，其中所述rgma片段为人rgma片段。

项45.项1至44中任一项的方法，其中所述样品包含脑脊液、血液、血清或血浆。